玉米大斑病菌遺傳多樣性的分子標(biāo)記研究進(jìn)展

趙霖熙，崔林開，韓贊平*

（1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南 洛陽 471023）

玉米大斑病是生產(chǎn)中一種常見的全球性真菌病害，由大斑剛毛座腔菌〔Setosphaeriaturcica（Luttr.）K. J. Leonard & Suggs〕 〔無性態(tài)Exserohilumturcica（Pass）Leonard & Suggs〕引起，1876 年在意大利首次發(fā)現(xiàn)，之后在世界各地流行至今[1，2]。1899 年玉米大斑病首次在我國東北地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[3]，之后在我國常年發(fā)生流行至今，對玉米產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，一般導(dǎo)致玉米減產(chǎn)10%～20%，發(fā)病重時玉米減產(chǎn)幅度高達(dá)50%以上[4，5]。

玉米大斑病在玉米整個生育期均可以發(fā)病，拔節(jié)期和抽穗期是發(fā)病高峰期。玉米大斑病主要為害玉米葉片，也可侵染葉鞘和苞葉，發(fā)病初期形成黃綠色水漬狀斑點，最終形成灰褐色或中間淺褐色、邊緣暗褐色的梭形病斑，發(fā)病嚴(yán)重時造成整株枯死[6]。當(dāng)田間相對濕度達(dá)到90%時，病斑表面會產(chǎn)生灰黑色霉層。玉米大斑病菌生理分化現(xiàn)象明顯，玉米大斑病菌的生理小種分布在我國十分復(fù)雜，目前已經(jīng)報道的生理小種有0、1、2、3、N、12、13、1N、23、2N、3N、12N、13N、123、23N 和123N 共16 種[7]，優(yōu)勢小種為1 號小種[8]。

隨著生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，遺傳多樣性研究不僅局限于形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記以及生理生化標(biāo)記等傳統(tǒng)的研究方法[9]，分子標(biāo)記技術(shù)因其直接以DNA 的形式表現(xiàn)不受環(huán)境和其他因素的影響而廣泛應(yīng)用到遺傳多樣性的研究中[10]。生物遺傳多樣性研究需要合適的標(biāo)記來反映群體的遺傳特征。研究玉米大斑病菌遺傳多樣性，對揭示其遺傳變異、病害防治以及抗病品種選育具有重要意義。對近年來不同分子標(biāo)記技術(shù)在國內(nèi)外玉米大斑病菌遺傳多樣性方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對研究中的問題及今后的研究方向進(jìn)行了分析，以期為玉米大斑病菌的研究提供理論依據(jù)。

1 玉米大斑病菌遺傳多樣性研究的DNA 分子標(biāo)記及其利用

1.1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）

RAPD 是由美國科學(xué)家Williams 和Welsh 于1990年發(fā)展起來，建立在以PCR 為基礎(chǔ)的一種新型的DNA分子標(biāo)記技術(shù)[11，12]。其具有操作簡單、檢測迅速、靈敏度高、所需DNA 量少等優(yōu)點，但是，RAPD 為顯性標(biāo)記，擴(kuò)增結(jié)果易受外界因素影響，試驗重復(fù)性較差。

RAPD 技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、品種鑒定及親緣關(guān)系分析等[13]，在真菌的遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究中應(yīng)用非常廣泛。張明會等[14]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)研究了39 株玉米大斑病菌的遺傳多樣性，結(jié)果表明，玉米大斑病菌具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性，在遺傳相似系數(shù)為0.76 時可以將39 株玉米大斑病菌劃分為6 組，分組的劃分與病原菌的地理來源無直接關(guān)系。姜開梅等[15]研究表明，云南省玉米大斑病菌存在豐富的遺傳多樣性，RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)能夠揭示病原菌間的遺傳差異及親緣關(guān)系。Abadi 等[16]利用RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)分析了玉米大斑病菌不同生理小種、不同地理來源玉米大斑病菌的遺傳多樣性，結(jié)果表明，0、1 和N 號生理小種與23 號生理小種的遺傳變異很大，來自非洲的菌株遺傳多樣性較來自以色列的高。Ferguson 等[17]通過21 對RAPD 引物研究了來自美國的251 株玉米大斑病菌的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)各個州內(nèi)遺傳變異較大，并指出群體遺傳結(jié)構(gòu)變異很可能是有性生殖和無性生殖的結(jié)果。Dong 等[18]利用RAPD 標(biāo)記對我國北方地區(qū)的玉米大斑病進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，玉米大斑病菌群體具有較高的遺傳多樣性，同時玉米大斑病菌群體可能發(fā)生了遺傳遷移。

1.2 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）

AFLP 是1992 年荷蘭科學(xué)家Zebeau 發(fā)明的一種新DNA 分子標(biāo)記技術(shù)[19]。AFLP 結(jié)合了RFLP 和RAPD的優(yōu)點[20，21]，表現(xiàn)為多態(tài)性高、所需DNA 量少、敏捷高效、重復(fù)性好，但是操作方法比較復(fù)雜。由于其優(yōu)點突出，因而AFLP 技術(shù)廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性的研究。

孫淑琴[22]利用AFLP 分子標(biāo)記研究了32 個玉米大斑病菌的有性雜交F2代的遺傳變異，從256 對引物中共篩選出89 對能夠有效擴(kuò)增的引物，表明玉米大斑病菌F2代存在豐富的遺傳多樣性，證明有性雜交能夠?qū)е掠衩状蟀卟【l(fā)生遺傳變異。王玉萍[23]通過26 對AFLP 引物研究了90 株玉米大斑病菌的遺傳多樣性，其中11 對引物能擴(kuò)增出多態(tài)性相對豐富的DNA 條帶，聚類分析結(jié)果表明玉米大斑病菌群體內(nèi)遺傳變異相對比較豐富，其遺傳變異與菌株地理來源無明顯的相關(guān)性，90 個菌株兩兩之間的相似系數(shù)為0.246 4～1.00。趙輝[24]利用AFLP 指紋圖譜的研究結(jié)果表明玉米大斑病菌群體具有明顯的遺傳多樣性，聚類分析結(jié)果表明玉米大斑病菌的群體遺傳多樣性與地理位置無關(guān)。

1.3 簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）

SSR 也叫微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），于1991 年由Moore 等[25]創(chuàng)立。SSR 標(biāo)記因在不同個體的堿基重復(fù)次數(shù)及重復(fù)單元不同能夠表現(xiàn)高度的特異性，因而是目前較為流行的分子標(biāo)記技術(shù)之一[26]。SSR 標(biāo)記具有在基因組中分布廣泛、多態(tài)性高、呈共顯性、結(jié)果穩(wěn)定、易于檢測等諸多優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性研究、基因定位以及遺傳圖譜構(gòu)建等[27，28]。

Hassbrook 等[29]成功開發(fā)了13 對玉米大斑病菌SSR引物，并通過南非6 個省的共26 株玉米大斑病菌進(jìn)行了SSR 驗證，結(jié)果表明，13 對SSR 引物均具有多態(tài)性。Human 等[30]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)研究了南非3 塊玉米田共258 株玉米大斑病菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌遺傳多樣性較低，遺傳結(jié)構(gòu)相對單一，該研究發(fā)現(xiàn)各采樣地點的菌株之間有多個相同的單倍型，表明分生孢子可以發(fā)生長距離遷移或可以直接通過人類介導(dǎo)的移動進(jìn)行移動。Li 等[31]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對黑龍江省的60 株玉米大斑病菌進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，黑龍江省的玉米大斑病菌遺傳多樣性相對比較豐富，分子方差分析表明群體遺傳多樣性與交配型具有明顯的相關(guān)性，而與菌株的地理位置相關(guān)性不大。高鵬飛[32]通過6 對SSR 引物對48 株玉米大斑病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，河南省玉米大斑病菌具有豐富的遺傳多樣性，聚類分析在相似系數(shù)為0.66 時可以將河南省8 個群體共48 株玉米大斑病菌劃分為2 個類群，并且玉米大斑病菌的遺傳分化與病原菌的地理學(xué)來源無明顯的相關(guān)性。Human 等[30]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對玉米大斑病遺傳多樣性的研究結(jié)果與其他學(xué)者有所差異，主要原因可能是其研究中采樣相對集中，導(dǎo)致玉米大斑病遺傳多樣性相對較低。SSR 分子標(biāo)記技術(shù)具有諸多優(yōu)點，因此成為目前玉米大斑病遺傳多樣性研究的主流方法。

1.4 簡單序列重復(fù)區(qū)間（inter-simple sequence repeats，ISSR）

ISSR 是Zietkiewicz 等[33]于1994 年提出的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)。ISSR 分子標(biāo)記操作簡單、快捷，同時結(jié)合了SSR、RAPD 以及AFLP 等分子標(biāo)記的優(yōu)點，在遺傳多樣性、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳作圖、基因定位等研究中被廣泛應(yīng)用[34]。

谷守芹等[35]對ISSR-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，從40 對ISSR 引物中篩選出9 對多態(tài)性豐富的ISSR 引物，對44 株玉米大斑病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析后發(fā)現(xiàn)多態(tài)性條帶占40.3%，表明玉米大斑病具有較為豐富的遺傳多樣性，聚類分析結(jié)果顯示在閾值為0.8 時可以將病原菌劃分為7 個類群。郭麗婕[36]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對2011～2014 年中國玉米產(chǎn)區(qū)的玉米大斑病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性比例最低為77.8%，表明中國玉米大斑病菌具有豐富的遺傳多樣性；通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌的遺傳多樣性與地理來源有一定關(guān)系；比較分析不同年份玉米大斑病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，相同地理位置的玉米大斑病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)變化顯著。Dai 等[37]以福建省7 個甜玉米主要生產(chǎn)區(qū)的117 株玉米大斑病菌為材料，利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行玉米大斑病菌遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)以及交配型分布的分析，發(fā)現(xiàn)福建省玉米大斑病菌遺傳多樣性相對比較豐富，群體遺傳分化水平與交配型比例具有相關(guān)性。目前，ISSR 分子標(biāo)記已經(jīng)成熟應(yīng)用于玉米大斑病菌遺傳多樣性的研究。

1.5 相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）

SRAP 又名基于序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP），是Li 和Quiros[38]提出的一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)。其原理是利用基因外顯子里G 和C 含量豐富，而啟動子和內(nèi)含子里A 和T含量豐富的特點設(shè)計2 套引物，對開放閱讀框架進(jìn)行擴(kuò)增。SRAP 分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡單、引物具有通用性等特點，被應(yīng)用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、比較基因組學(xué)等研究。馬周杰等[39]利用SRAP 標(biāo)記對東北地區(qū)57 株玉米大斑病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均多態(tài)性比率達(dá)68.75%，表明東北地區(qū)玉米大斑病菌菌株間具有豐富的遺傳多樣性；聚類分析結(jié)果表明，病原菌的遺傳相似系數(shù)為0.76～1.00，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.76 時可以將病原菌劃分為2 個類群，同時病原菌的群體遺傳分化與病原菌的地理學(xué)來源相關(guān)性不大，與病原菌的交配型有密切的相關(guān)性。

1.6 單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）

SNP 是繼SSR 和ISSR 分子標(biāo)記之后的新一代分子標(biāo)記[40]。近年來，SNP 分子標(biāo)記在各個領(lǐng)域的應(yīng)用得到了飛速發(fā)展。由于SNP 分子標(biāo)記具有遺傳穩(wěn)定性高、SNP 位點豐富、富有代表性、檢測迅速并且易于實現(xiàn)自動化分析等特點，SNP 分子標(biāo)記在Bin 圖譜構(gòu)建、高通量SNP 芯片分型以及群體遺傳進(jìn)化研究中應(yīng)用得越來越廣泛[41]。目前，SNP 分子標(biāo)記研究遺傳多樣性在動植物中應(yīng)用較為廣泛；在病原菌中應(yīng)用較少，在大豆灰斑病和黃萎病的病原菌遺傳多樣性研究中有采用SNP 分子標(biāo)記的相關(guān)報道[42，43]，但其在玉米大斑病菌遺傳多樣性領(lǐng)域的相關(guān)研究尚未見報道。因此，SNP 技術(shù)在真菌遺傳多樣性領(lǐng)域的研究還有待發(fā)展。

2 展望

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和遺傳多樣性研究技術(shù)的不斷完善，分子標(biāo)記技術(shù)以高效、簡便、精確度高等特點逐漸取代傳統(tǒng)的研究方法，可以預(yù)見，今后一段時間內(nèi)基于DNA 分子水平和組學(xué)研究仍是玉米大斑病菌群體遺傳多樣性研究的主要方法，并將越來越精細(xì)。但是，目前并沒有一種完美的分子標(biāo)記技術(shù)，各種分子標(biāo)記技術(shù)都有一定的局限性。RAPD 技術(shù)的穩(wěn)定性和多態(tài)性水平較差，試驗結(jié)果易受環(huán)境條件和人為因素的影響，不同的條件下，結(jié)果差異較大，試驗可重復(fù)性較低[44]；AFLP 技術(shù)雖然多態(tài)性水平高，但是由于操作相對復(fù)雜，試驗成本較高，同時其對反應(yīng)條件及DNA 的濃度要求較高，限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用；ISSR 技術(shù)需要摸索PCR 的最適反應(yīng)條件，同時由于該方法不能區(qū)分顯性純合基因型與雜合基因型，使其在應(yīng)用中受到了一定的限制；SRAP 技術(shù)在應(yīng)用中由于分子標(biāo)記定位的隨機(jī)性，需要的樣本量較大[45]。目前，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)由于其諸多優(yōu)點，已經(jīng)成為遺傳多樣性研究中的主流分子標(biāo)記技術(shù)；SNP 雖然是新一代的分子標(biāo)記技術(shù)，但是該技術(shù)在遺傳多樣性方面的研究相對較少，相關(guān)研究方法還有待開發(fā)。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，玉米大斑病的主要防治措施是選育和種植抗病品種，研究玉米大斑病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)對于抗病品種的選育以及玉米大斑病的防治及預(yù)報預(yù)測具有重要意義。對比玉米大斑病菌群體遺傳多樣性的相關(guān)研究可以發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)玉米大斑病菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)有所差異，但總體上玉米大斑病菌具有相對豐富的遺傳多樣性。說明玉米大斑病菌遺傳結(jié)構(gòu)差異較大。不同學(xué)者利用不同的分子標(biāo)記技術(shù)研究表明，玉米大斑病菌遺傳多樣性與病原菌地理來源相關(guān)性不大，表明玉米大斑病菌能夠進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，也表明該病在我國發(fā)生嚴(yán)重。目前，分子標(biāo)記技術(shù)能夠很好地揭示玉米大斑病菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)，并能說明其與地理來源、病原菌交配型等因素的關(guān)系，但是未能解釋群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變異的主要原因以及群體遺傳變異與玉米大斑病菌致病性之間的關(guān)系。我國玉米大斑病菌具有豐富的遺傳多樣性，但是關(guān)于玉米大斑病菌遺傳多樣性的進(jìn)化機(jī)制研究較少，其遺傳進(jìn)化機(jī)制尚未明確。玉米大斑病的生理小種在我國分布極其廣泛，目前關(guān)于玉米大斑病菌不同生理小種遺傳多樣性的研究相對較少，不同生理小種玉米大斑病菌的遺傳多樣性是否發(fā)生分化還有待研究。

關(guān)于玉米大斑病遺傳多樣性方面的研究，今后工作重點應(yīng)放在以下幾個方面：（1）玉米大斑病菌遺傳多樣性及其致病性之間的關(guān)系；（2）玉米大斑病菌的進(jìn)化機(jī)制；（3）不同生理小種的玉米大斑病菌之間的群體遺傳結(jié)構(gòu)是否具有明顯的分化現(xiàn)象。