血清miR-125a-3p、BMP-2水平與骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折術(shù)后延遲愈合的關(guān)系

陳偉娜，王亮，陳立葉

唐山市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，河北唐山063000

骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折（OVCF）是指由于骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致椎體骨質(zhì)量、骨密度和骨強(qiáng)度降低，骨脆性增加，在無(wú)明顯外傷或輕微外傷下發(fā)生的椎體壓縮性骨折［1］。外科手術(shù)是OVCF的主要治療方式，但部分患者術(shù)后易出現(xiàn)延遲愈合，導(dǎo)致再次骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著升高［2-3］。有研究報(bào)道，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收大于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成是導(dǎo)致骨折延遲愈合的重要病理生理機(jī)制［4］。微小RNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可在翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與骨形成和骨吸收［5］。miR-125a-3p是一種高度保守的miRNA。有研究報(bào)道，miR-125a-3p能夠參與調(diào)控成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成［6］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）又被稱(chēng)為骨形成蛋白，屬于TGF-β超家族，是一種在骨形成和骨再生中具有關(guān)鍵性作用的骨誘導(dǎo)蛋白［7］。但二者與OVCF術(shù)后延遲愈合的關(guān)系鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究探討了血清miR-125a-3p、BMP-2水平與OVCF術(shù)后延遲愈合的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1.料與方法

1.1.床資料 選擇2020年1月—2022年10月唐山市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科收治的OVCF患者147例。所有研究對(duì)象診斷依據(jù)《骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折診療與管理專(zhuān)家共識(shí)》［3］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合OVCF診斷標(biāo)準(zhǔn)；②接受經(jīng)皮椎體后凸成形術(shù)治療；③年齡≥18歲；④臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有胸腰椎手術(shù)史或外傷史者；②合并骨關(guān)節(jié)炎、骨結(jié)核、骨腫瘤等其他骨病者；③合并其他部位惡性腫瘤者；④合并急慢性感染者；⑤合并造血系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病者；⑥合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能損害者。依據(jù)《骨質(zhì)疏松性胸腰椎骨折不愈合的診斷與治療》［8］判定骨折延遲愈合：術(shù)后3個(gè)月，X線片顯示無(wú)或極少骨痂生成，斷端骨質(zhì)可見(jiàn)硬化、間隙。147例OVCF患者中，術(shù)后延遲愈合67例（延遲愈合組）、正常愈合80例（正常愈合組）。本研究經(jīng)唐山市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：H202108），所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2.清miR-125a-3p檢測(cè) 采集所有研究對(duì)象術(shù)前空腹外周靜脈血3 mL，1 500 × g離心15 min，留取上層血清。采用TRIzol法提取血清總RNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 1 h，80 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-125a-3p上游引物5'-GCGAAAGCCATTTTTGGTTA-3'、下游引物5'-GGGCAGGACAATAGCGTATG-3'，U6上游引物5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3'、下游引物5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3'。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，Universal miRNA qPCR primer 0.5 μL，2 × Trans-Start?Top Green qPCR SurperMix 10 μL，無(wú)核酸酶水7.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-125a-3p水平。

1.3.清BMP-2檢測(cè) 采集所有研究對(duì)象術(shù)前空腹外周靜脈血3 mL，1 500 × g離心15 min，留取上層血清。采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清BMP-2。

1.4.VCF術(shù)后延遲愈合相關(guān)的資料收集分析 收集所有研究對(duì)象臨床資料，包括性別、年齡、BMI、吸煙史、基礎(chǔ)疾?。ǜ哐獕?、糖尿病、冠心?。?、骨折原因（滑倒、跌倒、其他）、骨折部位（腰椎、胸椎）和骨密度（采用雙能X線吸收測(cè)量法）、Oswestry功能障礙指數(shù)（ODI）評(píng)分、手術(shù)時(shí)間、術(shù)中出血量以及血清miR-125a-3p、BMP-2水平等，比較OVCF患者術(shù)后延遲愈合者與正常愈合者上述臨床資料，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)納入多因素Logistic回歸模型，分析OVCF術(shù)后延遲愈合的影響因素。

1.5.計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，結(jié)果比較采用U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。危險(xiǎn)因素分析采用多因素Logistic回歸模型。預(yù)測(cè)效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，曲線下面積（AUC）比較采用DeLong檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.果

2.1.組血清miR-125a-3p、BMP-2水平比較 延遲愈合組與正常愈合組血清miR-125a-3p水平分別為1.20 ± 0.21、0.99 ± 0.14，血清BMP-2水平分別為120.97（105.57，130.46）、147.62（135.12，159.76）pg/mL。延遲愈合組血清miR-125a-3p水平高于正常愈合組（t=7.079，P＜0.01），血清BMP-2水平低于正常愈合組（U=6.180，P＜0.01）。

2.2.VCF患者血清miR-125a-3p、BMP-2水平的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，OVCF患者血清miR-125a-3p水平與血清BMP-2水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.786，P＜0.01）。

2.3.VCF術(shù)后延遲愈合的影響因素分析 兩組臨床資料比較見(jiàn)表1。以O(shè)VCF術(shù)后是否發(fā)生延遲愈合（是=1，否=0）為因變量，以年齡、骨密度、ODI評(píng)分及血清miR-125a-3p、BMP-2水平為自變量，納入多因素Logistic回歸模型。結(jié)果顯示，年齡增加、ODI評(píng)分增加、血清miR-125a-3p水平升高為OVCF術(shù)后延遲愈合的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而骨密度增加及血清BMP-2水平升高則為其獨(dú)立保護(hù)因素（P均＜0.05），見(jiàn)表2。

表1.VCF患者術(shù)后延遲愈合者與正常愈合者臨床資料比較

表2.VCF術(shù)后延遲愈合的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.4.清miR-125a-3p、BMP-2水平對(duì)OVCF術(shù)后延遲愈合的預(yù)測(cè)價(jià)值分析 ROC曲線分析顯示，血清miR-125a-3p水平預(yù)測(cè)OVCF術(shù)后延遲愈合的AUC為0.798（95%CI：0.724～0.860），最佳截?cái)嘀禐?.11，此時(shí)其預(yù)測(cè)OVCF術(shù)后延遲愈合的靈敏度為70.15%、特異度為85.00%；血清BMP-2水平預(yù)測(cè)OVCF術(shù)后延遲愈合的AUC為0.796（95%CI：0.722～0.858），最佳截?cái)嘀禐?33.41 pg/mL，此時(shí)其預(yù)測(cè)OVCF術(shù)后延遲愈合的靈敏度為80.60%、特異度為78.75%；血清miR-125a-3p、BMP-2水平聯(lián)合預(yù)測(cè)OVCF術(shù)后延遲愈合的AUC為0.883（95%CI：0.820～0.930），其預(yù)測(cè)OVCF術(shù)后延遲愈合的靈敏度為74.63%、特異度為93.75%。血清miR-125a-3p、BMP-2水平聯(lián)合預(yù)測(cè)OVCF術(shù)后延遲愈合的AUC高于二者單獨(dú)（Z分別為3.036、2.641，P均＜0.05）。

3.論

OVCF是臨床常見(jiàn)的骨質(zhì)疏松性骨折，其發(fā)生率隨著骨質(zhì)疏松癥患者年齡增長(zhǎng)而不斷升高。OVCF不僅能導(dǎo)致椎體高度丟失和后凸畸形，引起頑固性背痛，還能導(dǎo)致胃腸功能紊亂和心肺功能下降，并且骨折發(fā)生后還會(huì)因臥床、疼痛和活動(dòng)減少導(dǎo)致骨量進(jìn)一步丟失，在后凸畸形導(dǎo)致身體重心前移的狀態(tài)下增加了其他部位骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［9］。經(jīng)皮椎體成形術(shù)是治療OVCF的經(jīng)典術(shù)式，其療效令人滿(mǎn)意。但OVCF患者多為老年人，骨折后骨痂形成緩慢，易出現(xiàn)骨折延遲愈合甚至不愈合，增加了各種并發(fā)癥甚至致殘、致死的風(fēng)險(xiǎn)［4］。

骨骼是高度動(dòng)態(tài)變化的器官，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的增殖、分化在骨形成和骨愈合中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。當(dāng)成骨細(xì)胞數(shù)量和活性降低而破骨細(xì)胞數(shù)量和活性增加時(shí)，即骨吸收超過(guò)骨形成，則會(huì)導(dǎo)致骨折延遲愈合［10］。miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA分子，可通過(guò)與mRNA的3'端非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，在翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)。有研究報(bào)道，miRNA可參與調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖與分化，在骨折愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11］。miR-125a-3p是miRNA家族的重要成員之一，定位于人19號(hào)染色體前臂13.41。TU等［6］研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞分化期間miR-125a-3p表達(dá)降低，而上調(diào)miR-125a-3p表達(dá)則能靶向G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1抑制成骨細(xì)胞增殖與分化。SHANG等［12］研究報(bào)道，miR-125a-3p在糖皮質(zhì)激素處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-125a-3p表達(dá)則能靶向Runx家族轉(zhuǎn)錄因子2和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。上述研究表明，miR-125a-3p在成骨細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用。BMP屬于TGF-β超家族，是骨骼形成和保持穩(wěn)態(tài)的多效調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，在骨和軟骨形成中發(fā)揮重要作用［13］。BMP-2是BMP家族中最具活性的成員，能夠誘導(dǎo)未成熟的間質(zhì)細(xì)胞聚集于骨形成中心并促使其向骨系細(xì)胞分化，從而在骨形成中發(fā)揮重要作用［14］。有研究報(bào)道，BMP-2持續(xù)釋放能夠促進(jìn)骨痂生長(zhǎng)并增強(qiáng)骨痂強(qiáng)度，從而促進(jìn)骨折愈合［15］。有研究還發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞中BMP-2缺乏可阻礙骨形成啟動(dòng)，延長(zhǎng)骨折愈合和軟骨愈傷組織形成時(shí)間［16］。以上研究表明，BMP-2在骨折愈合中亦發(fā)揮重要作用。但目前二者與OVCF術(shù)后延遲愈合的關(guān)系鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，延遲愈合組血清miR-125a-3p水平顯著升高，血清BMP-2水平顯著降低；血清miR-125a-3p、BMP-2水平是OVCF術(shù)后延遲愈合的獨(dú)立影響因素。結(jié)果表明，血清miR-125a-3p水平升高和血清BMP-2水平降低與OVCF患者術(shù)后延遲愈合密切相關(guān)。血清miR-125a-3p水平升高能夠通過(guò)調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1、Runx家族轉(zhuǎn)錄因子2、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白，抑制成骨細(xì)胞增殖與分化并導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量和活性增加，阻礙骨折愈合。張帥等［17］研究亦證實(shí)，抑制骨質(zhì)疏松性骨折大鼠miR-125a-3p表達(dá)能夠增加骨密度，促進(jìn)大鼠骨折愈合。而血清BMP-2水平降低可阻礙間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，抑制骨形成，從而延長(zhǎng)骨折愈合時(shí)間。近期研究報(bào)道，上調(diào)BMP-2表達(dá)能夠有效縮短O(píng)VCF大鼠骨折愈合時(shí)間并提高骨折愈合質(zhì)量［18］。本研究Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，OVCF患者血清miR-125a-3p、BMP-2水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示二者可能共同參與OVCF術(shù)后骨折愈合過(guò)程。張帥等［17］研究還顯示，抑制miR-125a-3p能夠靶向缺口1信號(hào)通路上調(diào)BMP-2表達(dá)，進(jìn)而增加骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨密度和骨強(qiáng)度，促進(jìn)骨折愈合。進(jìn)一步證實(shí)二者可能共同參與OVCF術(shù)后骨折愈合過(guò)程。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，年齡增加、ODI評(píng)分增加及骨密度降低亦能影響OVCF術(shù)后延遲愈合。究其原因，年齡大的OVCF患者新陳代謝慢，骨折部位營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)充和廢物代謝緩慢，影響術(shù)后骨折愈合；而骨密度越低和ODI評(píng)分越高則反映OVCF患者骨質(zhì)狀況和功能越差，與術(shù)后骨折延遲愈合有關(guān)。本研究ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血清miR-125a-3p、BMP-2水平單獨(dú)和聯(lián)合預(yù)測(cè)OVCF術(shù)后延遲愈合的AUC分別為0.798、0.796、0.883，血清miR-125a-3p、BMP-2水平聯(lián)合預(yù)測(cè)OVCF術(shù)后延遲愈合的AUC顯著高于二者單獨(dú)。提示血清miR-125a-3p、BMP-2水平對(duì)OVCF術(shù)后延遲愈合均有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，并且二者聯(lián)合時(shí)預(yù)測(cè)價(jià)值更高。

綜上所述，血清miR-125a-3p水平升高和血清BMP-2水平降低與OVCF術(shù)后延遲愈合密切相關(guān)；血清miR-125a-3p、BMP-2水平對(duì)OVCF術(shù)后延遲愈合均有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，二者聯(lián)合時(shí)預(yù)測(cè)價(jià)值更高。