苗藥金烏健骨膠囊對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型大鼠腸道、滑膜炎癥及IL-17?琢/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路的影響

李湖帆，鐘琴，馬武開，朱玲，朱丹，張瀟東，王敏慧，易寒知，龔文濤，劉中靜，陳昌明

〔摘要〕 目的 探討苗藥金烏健骨膠囊對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis， CIA）模型大鼠腸道、滑膜炎癥及參與NF-κB信號(hào)通路基因IL-17受體信號(hào)分子ACT1（nuclear factor kappa B activator 1， ACT1）、泛素化TRAF6（TNF receptor associated factor 6， TRAF6）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1， TAK1）、核因子-κB上游激酶（IκB kinase α， IKKα）、核因子κB/p65、核因子κB/p50表達(dá)的影響。方法 將70只SPF級(jí)6～8周齡雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為7組，分別為空白對(duì)照組、模型組、金烏健骨膠囊低劑量組、金烏健骨膠囊中劑量組、金烏健骨膠囊高劑量組、甲氨蝶呤組及益生菌組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)后除空白對(duì)照組外，其余6組構(gòu)建CIA模型，兩次免疫造模成功后分別進(jìn)行藥物金烏健骨膠囊、甲氨蝶呤、益生菌灌胃治療，治療4周后靜脈取血，處死大鼠，分離大鼠滑膜組織及腸道組織。利用HE染色法檢測(cè)大鼠滑膜及大腸組織病理情況；ELISA法檢測(cè)大鼠血清TGF-β1、IL-1α、IL-17α、IL-21、IL-23的含量；Western blot法檢測(cè)大鼠腸道組織ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50蛋白的表達(dá)水平；RT-qPCR法檢測(cè)大鼠腸道ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50基因的表達(dá)情況。結(jié)果 滑膜病理結(jié)果顯示，與模型組相比，金烏健骨膠囊中、高劑量組和甲氨蝶呤組炎性浸潤(rùn)、增生、血管新生組織有明顯改善；腸道病理結(jié)果顯示，與模型組相比，金烏健骨膠囊低、中、高劑量組及甲氨蝶呤組、益生菌組腸道組織細(xì)胞可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸道組織細(xì)胞病變情況較模型組有不同程度的改善；ELISA結(jié)果顯示，與模型組相比，各給藥組血清含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）; Western blot結(jié)果顯示，各給藥組大鼠腸道組織ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50的蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05或P<0.01）；RT-qPCR結(jié)果顯示，各給藥組ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50基因的表達(dá)顯著降低（P<0.05或P<0.01）；金烏健骨膠囊高劑量組的作用最佳。結(jié)論 苗藥金烏健骨膠囊能夠減輕CIA大鼠腸道、滑膜炎癥，同時(shí)能夠影響腸道IL-17α/TRAF6/NF-κB信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)情況。

〔關(guān)鍵詞〕 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎；金烏健骨膠囊；炎癥；IL-17α/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.08.006

Effects of Jinwu Jiangu Capsule， the Miao medicine， on intestinal and synovial inflammation and IL-17？琢/TRAF6/NF-κB signaling pathway in

rats with collagen-induced arthritis

LI Hufan1， ZHONG Qin1，2， MA Wukai1，2， ZHU Ling1， ZHU Dan1， ZHANG Xiaodong1， WANG Minhui1，

YI Hanzhi1， GONG Wentao1， LIU Zhongjing3， CHEN Changming1，2*

1. Guizhou University of Chinese Medicine， Guiyang， Guizhou 550002， China; 2. Department of Rheumatology and Immunology， the Second Hospital of Guizhou University of Chinese Medicine， Guiyang， Guizhou 550001， China; 3. Research Center for Clinical Medicine， the Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang， Guizhou 550001， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Jinwu Jiangu Capsule （JWJGC）， the medicine from the Chinese Miao nationality， on intestinal and synovial inflammation in rat models with collagen-induced arthritis （CIA）， and on the expressions of genes involved in NF-κB signaling pathway， including IL-17 receptor signaling molecule nuclear factor kappa B activator 1 （ACT1）， TNF receptor associated factor-6 （TRAF6）， transforming growth factor-β-activated kinase 1 （TAK1）， and the nuclear factors of IκB kinase α （IKKα）， κB/p65， and κB/p50. Methods Seventy female Wistar rats aged 6-8 weeks of SPF grade were randomly divided into seven groups： blank control group， model group， low-， medium- and high-dose JWJGC groups， methotrexate group， and probiotic group， with 10 rats in each group. After adaptive feeding， except for the blank control group， CIA models were established in the other six groups. After two successful immune modeling attempts， rats in JWJGC groups， methotrexate group， and probiotic group were treated with JWJGC， methotrexate， and probiotics by gavage， respectively. After four weeks of treatment， blood of rats was collected via vein. Then the rats were sacrificed and the synovial tissues and intestinal tissues were separated from the bodies. The histopathological condition of rat synovium and intestine was checked by HE staining， the content of serum TGF-β1， IL-1α， IL-17α， IL-21， and IL-23 in rats was tested by ELISA， the expression levels of ACT1， TRAF6， TAK1， IKKα， P65， and P50 proteins in rat intestinal tissues were determined by Western blot， and the expression levels of ACT1， TRAF6， TAK1， IKKα， P65， and P50 genes in rat intestinal tissues were checked by RT-qPCR. Results The synovial pathological results showed that the medium- and high-dose JWJGC groups and methotrexate group had a significant reduction in inflammatory infiltration and proliferation， and a significant improvement in angiogenesis compared with the model group; the intestinal pathological results showed that a small amount of inflammatory cell infiltration could be seen in intestinal tissue cells of low-， medium- and high-dose JWJGC groups， methotrexate group， and probiotic group， and the pathological changes of intestinal tissue cells were improved to different degrees compared with the model group; the ELISA results showed that the content of serum TGF-β1， IL-1α， IL-17α， IL-21， and IL-23 in each medication group was significantly reduced compared with the model group （P<0.05 or P<0.01）; the Western blot results showed that the expression levels of ACT1， TRAF6， TAK1， IKKα， P65， and P50 proteins in rat intestinal tissues in each medication group were significantly lower compared with the model group （P<0.05 or P<0.01）; the RT-qPCR results showed that the expression levels of ACT1， TRAF6， TAK1， IKKα， P65， and P50 genes in each medication group significantly decreased compared with the model group （P<0.05 or P<0.01）; the high-dose JWJGC group had the best effects （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion JWJGC， the Miao medicine， can reduce the intestinal and synovial inflammation in CIA rats， and it can affect the expressions of genes related to intestinal IL-17α/TRAF6/NF-κB signaling pathway at the same time.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 rheumatoid arthritis; collagen-induced arthritis; Jinwu Jiangu Capsule; inflammation; IL-17α/TRAF6/NF-κB signaling pathway

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫疾病，臨床表現(xiàn)為對(duì)稱性、持續(xù)性多關(guān)節(jié)炎，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，宿主和環(huán)境之間存在復(fù)雜的相互作用，決定了RA疾病易感性、持久性及嚴(yán)重程度。而微生物群失調(diào)及共病免疫介導(dǎo)作為重要的因素在RA的發(fā)病及病情進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[1]。據(jù)最新的文獻(xiàn)報(bào)道，RA患者易出現(xiàn)腸道炎癥，失調(diào)的腸道微生物會(huì)改變機(jī)體腸道上皮黏膜細(xì)胞的通透性，發(fā)生腸道炎癥，產(chǎn)生大量自身抗體或促炎免疫細(xì)胞，自身抗體和免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子運(yùn)輸?shù)疥P(guān)節(jié)部位，造成關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥及骨質(zhì)破壞[2]。此外，腸道促炎細(xì)胞因子可觸發(fā)RA免疫介導(dǎo)炎癥的信號(hào)通路，促炎和抗炎細(xì)胞因子的失衡可促進(jìn)自身免疫的誘導(dǎo)，激活的信號(hào)通路產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致RA病情加重[3]。

對(duì)早期RA患者進(jìn)行的研究表明，幾乎所有患者都存在亞臨床腸道炎癥，其特征是浸潤(rùn)性單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，以及淋巴濾泡的存在[4]。一項(xiàng)涵蓋6 776名受試者（包括2 686名RA患者）的橫截面研究表明，普雷沃菌屬與RA的遺傳風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，普雷沃菌屬可能通過介導(dǎo)Th17細(xì)胞的炎癥反應(yīng)促進(jìn)RA發(fā)病[5]。因此，進(jìn)一步了解IL-17在RA患者中的腸道炎癥作用將對(duì)探討該病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

目前發(fā)現(xiàn)，RA的發(fā)生發(fā)展與IL-17？琢密切相關(guān)，Th17細(xì)胞主要分泌IL-17？琢、IL-17F和IL-22，而IL-17？琢是Th17細(xì)胞分泌的最重要的效應(yīng)物，IL-17？琢通過與細(xì)胞表面受體IL-17RA結(jié)合，進(jìn)而與IL-17RC形成異源二聚體介導(dǎo)下游信號(hào)，胞內(nèi)接頭分子ACT1可以結(jié)合到受體復(fù)合物上與IL-17RA和IL-17RC上的SEFIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，泛素化TRAF6從而激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)炎癥基因的表達(dá)[6]。一方面，IL-17通過IKKα激活和IκBa降解觸發(fā)NF-κB的激活。NF-κB隨后上調(diào)ＩκBζ和B細(xì)胞淋巴瘤3編碼蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)IL-17/NF-κB驅(qū)動(dòng)的促炎和抗微生物感染基因的表達(dá)[7]。另一方面，TRAF6還能促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPK）信號(hào)途徑的激活。此外，IL-17/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路可抑制多種NF-κB負(fù)反饋回路的激活[8]。在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中，IL-17發(fā)揮著重要作用。而TGF-β1、IL-1？琢、IL-17？琢、IL-21、IL-23在IL-17形成過程中起著積極地促進(jìn)作用[9]。

由于RA發(fā)病原因尚未完全明確，臨床治療以抗炎、鎮(zhèn)痛及延緩病情進(jìn)展為主。傳統(tǒng)抗RA藥物如甲氨蝶呤、來氟米特、糖皮質(zhì)激素或者生物制劑如腫瘤壞死因子抑制劑、IL-1受體拮抗劑、IL-6受體拮抗劑、B細(xì)胞耗竭劑、T細(xì)胞等靶向藥物等雖對(duì)RA有較好的療效，但具有惡心、嘔吐、感染、口腔潰瘍等不良反應(yīng)[10]。而苗藥金烏健骨膠囊是貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院長(zhǎng)期用于治療風(fēng)濕病的有效經(jīng)驗(yàn)方，已在課題組應(yīng)用十余年。課題組前期大量的臨床研究證實(shí)金烏健骨膠囊對(duì)RA的治療有著良好的療效，能夠有效改善RA患者臨床癥狀和體征，降低抗風(fēng)濕藥如甲氨蝶呤等的毒副作用[11-13]，但該藥治療RA的作用機(jī)制尚未明確。本研究主要探討苗藥金烏健骨膠囊對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型（collagen induced arthritis， CIA）大鼠腸道、滑膜炎癥及IL-17？琢/TRAF6/NF-κB信號(hào)途徑的影響，為闡述苗藥金烏健骨膠囊治療RA的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雌性Wistar大鼠（體質(zhì)量150～180 g）購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0013。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)甲秀校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔環(huán)境，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，活動(dòng)、進(jìn)食、排便均無(wú)異常后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠的使用和喂養(yǎng)嚴(yán)格遵照貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)規(guī)章制度執(zhí)行，批準(zhǔn)批號(hào)：ky2020035。

1.2? 實(shí)驗(yàn)試劑

金烏健骨膠囊（藥物由金毛狗脊15 g、烏梢蛇10 g、千年健15 g、黑骨藤10 g、小花青風(fēng)藤15 g、姜黃20 g、白芍15 g、三七3 g、甘草3 g組成。每粒0.45 g，貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，黔藥制字Z20160028，批號(hào)：170701）。甲氨蝶呤片（metho？鄄trexate tablets， MTX，上海上藥信誼藥廠有限公司，批號(hào)：H31020644）；雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片（內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：S19980004）；牛Ⅱ型膠原凍干粉（Chondrex，批號(hào)：200078）；弗氏完全佐劑（批號(hào)：SLCD4457），蘇木素（批號(hào)：H9627）均購(gòu)自Sigma公司；磷酸酶抑制劑（碧云天，批號(hào)：S1873）；伊紅Y（國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：71014544）；PMSF（阿拉丁，批號(hào)：P105539）；RIPA裂解液（碧云天，批號(hào)：P0013B）；小鼠單抗β-actin（批號(hào)：BM0627）；HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗（批號(hào)：BA1051）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔多抗ACT1（abclonal，批號(hào)：A6776）；兔多抗TRAF6（批號(hào)：AF5376）、兔多抗TAK1（批號(hào)：AF7616）、兔多抗IKKα（批號(hào)：DF6047）、兔多抗P65（批號(hào)：AF5006）、兔多抗P50（批號(hào)：AF6217）均購(gòu)自Affinity公司；TGF-β1酶免疫吸附試劑盒（批號(hào)：E-EL-0162c）、IL-1？琢酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0011c）、IL-17？琢酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0566c）、IL-21酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0568c）、IL-23酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0569c）均購(gòu)自伊萊瑞特公司；胞漿胞核蛋白提取試劑盒（南京凱基生物，批號(hào)：KGP150）。

1.3? 實(shí)驗(yàn)儀器

病理切片機(jī)（德國(guó)Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，批號(hào)：2016）；垂直電泳槽（北京六一儀器廠，批號(hào)：DYCZ-24DN）；離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，批號(hào)：HI650）；電轉(zhuǎn)儀（北京六一儀器廠，批號(hào)：DYCZ-40）；磁力攪拌器（江蘇省金壇市中大儀器廠，批號(hào)：T8-1）；酶標(biāo)儀（Thermo，批號(hào)：mμlISKANMK3）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，批號(hào)：DHG 9203A）；PCR儀（東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，批號(hào)：580BR10905）；紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，批號(hào)：JY02S）。

2 方法

2.1? 實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型制備

將購(gòu)入的70只雌性SPF級(jí)Wistar大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、金烏健骨膠囊低劑量組、金烏健骨膠囊中劑量組、金烏健骨膠囊高劑量組、甲氨蝶呤組及益生菌組，每組10只。CIA模型按照參考文獻(xiàn)[14]制備，在0.1 mol/L冰乙酸5 mL中加入10 mg牛Ⅱ型膠原凍干粉，置于4 ℃冰箱過夜，造模前與弗氏完全佐劑等體積混合，冰浴乳化，使配制濃度為1 mg·mL-1。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠待尾根部及右后足墊部消毒后，注射膠原乳劑0.2 mL/只致炎。7 d后再次加強(qiáng)免疫，于尾根部及右后足墊部皮內(nèi)注射0.4 mL/只致炎。加強(qiáng)免疫后關(guān)節(jié)腫痛進(jìn)一步加重，出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、脫毛等癥狀，這些表現(xiàn)符合CIA大鼠造模成功的標(biāo)志[15]。

2.2? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃

加強(qiáng)免疫后一天開始灌胃給藥，灌胃時(shí)間為4周。空白對(duì)照組及模型組每日按照大鼠體質(zhì)量100 g·mL-1生理鹽水灌胃，其余各組按照成人與動(dòng)物給藥等效計(jì)量換算給藥，等效劑量人鼠換算=S（藥物劑量g·60 kg-1）×0.625[16]。金烏健骨膠囊組每日分別給予金烏健骨膠囊（低劑量組：0.225 g·kg-1，中劑量組：0.45 g·kg-1和高劑量組：1.35 g·kg-1）；甲氨蝶呤組每周給予0.001 g·kg-1的甲氨蝶呤；益生菌組每周給予0.35 g·kg-1益生菌。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.3.1? 大鼠一般情況觀察? 期間觀察造模前后大鼠的毛色變化、活動(dòng)狀態(tài)、飲食、飲水及關(guān)節(jié)腫脹情況。末次給藥后各組大鼠禁食不禁水，采集血清后用10%的水合氯醛麻醉大鼠，處死大鼠后分離關(guān)節(jié)滑膜組織及結(jié)腸組織，用于觀察組織病理變化及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2? 足趾腫脹度測(cè)定? 致炎后第7天開始觀察大鼠右后足關(guān)節(jié)病變程度。參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分法評(píng)定法[17]。沒有關(guān)節(jié)受累則為0分，一個(gè)關(guān)節(jié)或關(guān)節(jié)區(qū)為1分，兩個(gè)關(guān)節(jié)或兩個(gè)關(guān)節(jié)區(qū)為2分，兩個(gè)或兩個(gè)以上關(guān)節(jié)區(qū)則為3分，整個(gè)肢體則為4分。不同的關(guān)節(jié)區(qū)為趾骨關(guān)節(jié)、跗骨關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)，分別測(cè)量第1、2、3、4周大鼠右后足關(guān)節(jié)腫脹度。

2.3.3? HE染色法檢測(cè)滑膜及大腸組織病理情況? 取10％福爾馬林對(duì)大鼠滑膜及大腸組織進(jìn)行標(biāo)本固定，使用梯度乙醇對(duì)標(biāo)本脫水，浸透蠟的標(biāo)本包裹在石蠟塊中。包埋好的蠟塊使用徠卡病理切片機(jī)進(jìn)行切片，將切片放入組織攤烤片機(jī)進(jìn)行烤片，烤好的切片放入二甲苯及乙醇中脫蠟，切片依次放入蒸餾水浸洗5 min再入蘇木素染液染5 min，自來水洗浸返藍(lán)后的切片再放入1%水溶性伊紅染液染色5 min，自來水洗浸洗。風(fēng)干后用中性樹膠封片，鏡檢。

2.3.4? TGF-β1、IL-1？琢、IL-17？琢、IL-21、IL-23的含量的測(cè)定? 按試劑盒說明書加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，取大鼠血清3 000 r/min，離心10 min，取上清樣檢測(cè)。往空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液100 μL，標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品100 μL。覆膜后37 ℃孵育后棄去孔內(nèi)液體，甩干，每孔加入抗體100 μL，覆膜后37 ℃溫育1 h。棄去液體，洗板3次。每孔加酶100 μL，覆膜后37 ℃溫育30 min。棄去液體，甩干，洗板5次。每孔加顯色劑90 μL，覆膜后37 ℃避光孵育15 min。每孔加終止液50 μL，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度。根據(jù)檢測(cè)順序測(cè)量各基因血清中的含量。

2.3.5? ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50基因檢測(cè)? 取大腸組織，加入200 μL氯仿，混勻后室溫放置5 min，在4 ℃，離心8 min后轉(zhuǎn)移上層水相于新1.5 mL EP管中，加入400 μL異丙醇，靜置10 min，在4 ℃，離心10 min，管底可見白色的RNA沉淀。棄上清，加入無(wú)RNase的75%乙醇1 mL，混勻后，在4 ℃，離心5 min。棄上清，將沉淀物溶于20 μL

DEPC水中。取溶解后的RNA 2 μL用微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280值，根據(jù)公式計(jì)算RNA的濃度：總RNA濃度（μg/μL）=OD260×40×10-3，分別利用RT1和RT2將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，結(jié)果以β-actin為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)定量，使用引物序列如下表1。

2.3.6? ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50蛋白檢測(cè)? 將大腸組織加蛋白裂解液，置冰上40 min，在4 ℃、離心10 min，取上清。用Bradford法對(duì)上清進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，進(jìn)行電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜，37 ℃封閉1 h，一抗4 ℃過夜。用TBST液孵育作為陰性對(duì)照。洗膜后，將膜與堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的抗IgG抗體孵育，洗去一抗。用TBST稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，然后洗去二抗。將增強(qiáng)液與過氧化物酶按1：1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，覆膜后用X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。用圖像分析測(cè)定各帶吸光度（A）值作定量分析。

2.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次及以上，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以“ｘ±s”表示，若檢驗(yàn)樣本資料符合正態(tài)分布并且滿足方差齊性，則采用方差分析及t檢驗(yàn)，不符合的采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 大鼠一般情況表現(xiàn)

造模前，各組大鼠表現(xiàn)并無(wú)差異。造模后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠飲食、飲水情況下降，部分大鼠出現(xiàn)毛發(fā)脫落，關(guān)節(jié)腫脹導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)緩慢、行走不穩(wěn)，呼吸加快，對(duì)外界反映情況較急躁。給與金烏健骨膠囊及甲氨蝶呤、益生菌干預(yù)后，與模型組比較，給藥組一般情況都有改善，尤以甲氨蝶呤及金烏健骨膠囊高劑量組明顯。

3.2? 金烏健骨膠囊對(duì)CIA大鼠右后足關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評(píng)分的影響

結(jié)果如表2比較，與正常對(duì)照組比較，模型組在各時(shí)間點(diǎn)右后足關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評(píng)分均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組在給藥第3周時(shí)右后足關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評(píng)分增長(zhǎng)緩慢，第4周時(shí)右后足關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評(píng)分已顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

3.3? 金烏健骨膠囊對(duì)CIA大鼠滑膜組織病理學(xué)的影響

正常對(duì)照組滑膜組織無(wú)血管翳形成及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜細(xì)胞排列整齊。模型組滑膜組織可見滑膜細(xì)胞增生，大量淋巴細(xì)胞成彌漫性浸潤(rùn)，并可見肉芽腫改變，血管翳形成。金烏健骨膠囊低劑量組及益生菌組滑膜間質(zhì)內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜組織增生水腫，滑膜細(xì)胞排列紊亂，與模型組比較無(wú)明顯改善。金烏健骨膠囊中、高劑量組和甲氨蝶呤組可見少量新生血管形成及滑膜輕度增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，與模型組大鼠比較，炎性浸潤(rùn)、增生、血管新生組織有明顯改善，金烏健骨膠囊高劑量組和甲氨蝶呤組作用效果較為接近。詳見圖1。

3.4? 金烏健骨膠囊對(duì)CIA大腸組織病理學(xué)的影響

正常對(duì)照組大腸組織黏膜層及黏膜下層可見周圍黏膜大致正常及無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜層及黏膜下層細(xì)胞排列整齊。模型組大腸組織黏膜層及黏膜下層可見大量細(xì)胞增生并水腫，大量炎性細(xì)胞成彌漫性浸潤(rùn)，并可見棉絮狀假膜及纖維素樣物形成。金烏健骨膠囊低劑量組內(nèi)大腸黏膜層及黏膜下層可見稍中等量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，大腸組織輕度增生水腫，大腸黏膜層及黏膜下層細(xì)炎性胞排列紊亂，與模型組比較無(wú)明顯改善。金烏健骨膠囊中、高劑量組和甲氨蝶呤組可見少量棉絮狀假膜及纖維素樣物形成，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，與模型組大鼠比較，炎性浸潤(rùn)、增生及彌漫性浸潤(rùn)有明顯改善，金烏健骨膠囊高劑量組和甲氨蝶呤組作用效果較為接近。詳見圖2。

3.5? 金烏健骨膠囊對(duì)CIA大鼠血清TGF-β1、IL-1？琢、IL-17？琢、IL-21、IL-23含量的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組血清TGF-β1、IL-1？琢、IL-17？琢、IL-21、IL-23含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，甲氨蝶呤組及金烏健骨高劑量組血清TGF-β1、IL-1？琢、IL-17？琢、IL-21、IL-23含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）。詳見圖3。

3.6? 金烏健骨膠囊對(duì)CIA大鼠大腸ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50 mRNA的表達(dá)量影響

與正常對(duì)照組比較，模型組ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50基因表達(dá)顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50基因表達(dá)顯著降低（P<0.05或P<0.01）。詳見圖4。

3.7? 金烏健骨膠囊對(duì)CIA大鼠大腸中ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50蛋白的表達(dá)水平影響

與正常對(duì)照組比較，模型組ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05或P<0.01），與模型組比較，金烏健骨膠囊組、甲氨蝶呤組及益生菌組ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05或P<0.01）。詳見圖5—6。

4 討論

RA是一種以侵襲性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫性疾病。確切的發(fā)病機(jī)制不明，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。有證據(jù)表明，腸道菌群失調(diào)在RA的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，腸道的通透性及損傷和炎癥標(biāo)志物的變化影響著關(guān)節(jié)炎癥，腸道屏障完整性有助于關(guān)節(jié)炎的好轉(zhuǎn)[18]。當(dāng)腸道屏障的完整性被打破，其腸道微生物就會(huì)打破平衡產(chǎn)生腸道炎癥，RA患者可觀察到的常見微生物群變化包括細(xì)菌比重的降低，例如革蘭氏陽(yáng)性菌類和革蘭氏陰性菌比例失衡，以及某些物種的過量或枯竭，其中普雷沃菌群可見大量增多[19]。早期RA患者腸道微生物失調(diào)導(dǎo)致的腸道炎癥中以亞群普雷沃為主，同時(shí)發(fā)現(xiàn)RA患者腸道微生物中腸Th17細(xì)胞數(shù)量增加，Th17細(xì)胞表現(xiàn)出分泌IL-17響應(yīng)于NF-κB迅速誘導(dǎo)RA[20]。

NF-κB是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，其控制轉(zhuǎn)錄DNA及細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞存活。NF-κB幾乎存在于所有動(dòng)物細(xì)胞類型中，并參與細(xì)胞刺激的反應(yīng)，如應(yīng)激、細(xì)胞因子、腸道炎癥和自身免疫疾病[21]。IL-17是Th17細(xì)胞因子的原型。IL-17？琢通過有效介導(dǎo)中性粒細(xì)胞，參與腸道炎癥反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中通過造模以后血清中IL-17？琢明顯升高，當(dāng)給予金烏健骨膠囊以后IL-17？琢顯著下降。此外IL-17？琢在氨基酸水平上的同源性較強(qiáng)，在不同的自身免疫性疾病中起著重要的作用[22]。IL-17？琢受體細(xì)胞通路，首先招募ACT1啟動(dòng)，其具有活化NF-κB的功能，ACT1在機(jī)體免疫反應(yīng)的作用極為廣泛。如在B細(xì)胞中，其可以通過調(diào)節(jié)CD40信號(hào)來影響B(tài)細(xì)胞的存活率。此外，也是NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)下游信號(hào)通路的重要分子。ACT1也被認(rèn)為是IL-17？琢受體信號(hào)激活必需的分子，ACT1具有E3泛素連接酶活性，在IL-17？琢信號(hào)傳遞后，ACT1迅速招募并泛素化TRAF6與使用TRAF6的其他受體一樣。研究表明，RA中成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞通過產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和蛋白酶導(dǎo)致軟骨破壞，TRAF6升高的在RA滑膜與滑膜炎的嚴(yán)重性和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的數(shù)量顯著相關(guān)[23]。IL-17通過IKK激酶激活I(lǐng)KKα降解觸發(fā)NF-κB的激活。NF-κB隨后上調(diào)IKKα和B細(xì)胞淋巴瘤3編碼蛋白基因的表達(dá)，而NF-κBp50/NF-κBp65能與免疫球蛋白k輕鏈基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列特異性結(jié)合。從而驅(qū)動(dòng)了IL-17？琢/TRAF6/NF-κB信號(hào)促炎導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生[24]。本實(shí)驗(yàn)的滑膜病理及大腸病理結(jié)果表明，金烏健骨膠囊高劑量組和甲氨蝶呤組改善RA的滑膜炎及腸道炎癥作用效果較為接近，各組ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα及P65、P50下降水平及血清TGF-β1、IL-1？琢、IL-17？琢、IL-21、IL-23含量降低水平與甲氨蝶呤組類似，這也證明了苗藥金烏健骨膠囊可能通過抑制IL-17？琢/TRAF6/NF-κB信號(hào)的表達(dá)來改善大鼠腸道、滑膜炎癥。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA屬于“痹病”范疇，苗醫(yī)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其屬于“痹毒”范疇。金烏健骨膠囊具有補(bǔ)腎活血、祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛的作用，為貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院長(zhǎng)期用于治療貴州人民RA的經(jīng)驗(yàn)用方，對(duì)RA都能起到治愈或者緩解其關(guān)節(jié)腫痛的情況。前期研究者多通過體外培養(yǎng)RA-FLS或構(gòu)建CIA模型大鼠，通過對(duì)炎癥因子（IL-17、IL-1、IL-6等）、自噬相關(guān)基因（LC3、Beclin-1、Bcl-2等）、RA-FLS增殖與凋亡率等一系列數(shù)據(jù)的測(cè)定，得出金烏健骨膠囊防治RA具有良好療效的結(jié)論[25]。但與腸道菌群失衡導(dǎo)致的腸道炎癥方面未有研究，通過探討苗藥金烏健骨膠囊對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型CIA大鼠腸道、滑膜炎癥及參與NF-κB信號(hào)通路基因ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα、P65、P50表達(dá)的影響。對(duì)于RA的治療具有廣闊的臨床應(yīng)用前景以及較大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，與正常對(duì)照組比較，模型組關(guān)節(jié)滑膜中ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα及P65、P50 蛋白表達(dá)及血清TGF-β1、IL-1？琢、IL-17？琢、IL-21、IL-23含量顯著升高，給予金烏健骨膠囊干預(yù)后，大腸組織中ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα及P65、P50蛋白表達(dá)及血清TGF-β1、IL-1？琢、IL-17？琢、IL-21、IL-23含量降低，尤其以金烏健骨膠囊高劑量及甲氨蝶呤組顯著降低，益生菌稍降低，而甲氨蝶呤片是臨床上用于治療RA的一線藥物，況且腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致的腸道、滑膜炎癥與RA密切相關(guān)。由此可知，適當(dāng)劑量的金烏健骨膠囊可通過抑制IL-17？琢/TRAF6/NF-κB信號(hào)途徑來治療RA。同時(shí)，病理切片顯示苗藥金烏健骨膠囊可抑制RA滑膜血管翳增生、降低滑膜細(xì)胞的侵潤(rùn)及抑制大腸棉絮狀假膜及纖維素樣物形成，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。可得出金烏健骨膠囊可抑制膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型CIA大鼠的腸道、滑膜炎癥。

綜上所述，金烏健骨膠囊可改善大鼠腸道、滑膜炎癥來治療RA的作用機(jī)制可能是通過下調(diào)ACT1、TRAF6、TAK1、IKKα及P65、P50蛋白基因表達(dá)，降低炎癥因子含量，抑制IL-17？琢/TRAF6/NF-κB信號(hào)途徑的表達(dá)，防止滑膜細(xì)胞增生、血管翳形成，從而抑制RA炎癥水平，使炎癥障礙建立，快速代謝和快速消除全身的炎癥。最終起到通過調(diào)控炎癥，從而抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情的進(jìn)展，緩解關(guān)節(jié)腫脹，降低炎癥反應(yīng)，防止骨破壞。這些可能為苗藥金烏健骨膠囊的基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)，為中醫(yī)藥治療RA提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯? 蘇? 維）