乙氧氟草醚對桂味荔枝冬梢控殺效果及內(nèi)源激素影響的研究

金 峰 向 旭 邱燕萍 袁沛元 凡 超

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

荔枝（Litchi chinensisSonn.）為無患子科（Spindaceae）常綠喬木，在廣東、廣西、海南和福建廣泛種植［1］。荔枝冬梢生長消耗樹體營養(yǎng)，如不嚴(yán)格管理嫩梢，則對開花、坐果率及產(chǎn)量影響較大［2-3］。桂味荔枝是我國種植面積前十的主栽荔枝品種，其控梢成花問題是業(yè)內(nèi)公認(rèn)的難題。已報(bào)道的控梢劑主要有百草枯、乙烯利、多效唑和乙氧氟草醚［4］。百草枯作為一種高毒農(nóng)藥，在市場上受到嚴(yán)格管控［5］，現(xiàn)已停止使用。乙烯利和多效唑處理荔枝冬梢時(shí)易受環(huán)境和樹體情況等因素影響，使用不當(dāng)會對樹體周邊的成熟葉片造成傷害［6-7］。乙氧氟草醚是一種使用廣泛的二苯醚類除草劑［8］，具有高效、低毒和低殘留特點(diǎn)［9-11］，目前在荔枝栽培中被用于控殺冬梢。

乙氧氟草醚是一種抑制植物色素合成的強(qiáng)觸殺性除草劑［12-15］。在植物中，在分子氧存在的條件下，原卟啉原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase，PROTOX）催化原卟啉原IX 生成原卟啉IX［16］。在光和氧的作用下，原卟啉IX 產(chǎn)生大量單線態(tài)氧，這些單線態(tài)氧可以氧化官能團(tuán)，使光合作用單元停止工作［17-18］，也可以通過加速細(xì)胞膜的氧化引起植物細(xì)胞受損［19-20］。單線態(tài)氧信號途徑可以與乙烯、水楊酸和茉莉酸等信號分子交叉連接，形成信號網(wǎng)絡(luò)［21-22］。研究表明，乙烯、茉莉酸和水楊酸信號途徑不僅是植物抵御生物和非生物脅迫的重要途徑，而且在一定條件下還會參與植物細(xì)胞凋亡信號的傳遞［23-24］。擬南芥flu突變體在黑暗條件下處理15 h 后被轉(zhuǎn)移至光照條件，其所產(chǎn)生的大量單態(tài)氧導(dǎo)致植株死亡，這一過程被證實(shí)與乙烯、茉莉酸和水楊酸激素信號途徑被激活有關(guān)［25-26］。植物內(nèi)源乙烯是以甲硫氨酸為底物，依次經(jīng)過腺苷甲硫氨酸合成酶、1-氨基環(huán)丙烷羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）合成酶和ACC 氧化酶三步催化而成［27］。ERF1基因是乙烯信號傳導(dǎo)途徑中重要的應(yīng)答因子之一，在植物乙烯的信號傳導(dǎo)途徑中被EIN3/EIL1 蛋白激活［28-31］。LOX、AOS和AOC基因是植物茉莉酸生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，茉莉酸從硬脂酸合成途徑中合成［32-35］。有研究表明，EDS1 和PAD4 是水楊酸介導(dǎo)的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗病（systemic acquired resistance，SAR）反應(yīng)中傳遞信號的重要基因［36］。乙烯、茉莉酸和水楊酸介導(dǎo)的防御系統(tǒng)形成代謝網(wǎng)絡(luò)交叉互作，水楊酸信號主要在防御早期發(fā)揮作用，而乙烯和茉莉酸信號主要參與后期抗逆的建立［37-38］。

本研究以桂味荔枝為材料，利用不同濃度乙氧氟草醚處理其冬梢，在組織和細(xì)胞水平上對冬梢進(jìn)行形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察，篩選出最佳處理濃度。并對水處理和乙氧氟草醚處理的冬梢進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組研究，檢測主要內(nèi)源激素的含量變化，同時(shí)對脅迫相關(guān)激素信號途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。旨在初步了解乙氧氟草醚控梢的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)荔枝樣本種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院荔枝試驗(yàn)園（113.37848°E，23.15922°N），取自20 年左右樹齡的桂味荔枝。試驗(yàn)前，選擇生長良好、樹勢相近的荔枝樹作為樣株（n=21）。每次取樣時(shí)，用鋒利刀片從荔枝果樹上分別切下長度約為5～8 cm 的荔枝嫩梢，同時(shí)采集對應(yīng)嫩梢下的成熟葉片（3 片），隨后立即用固定液或液氮保存并帶回實(shí)驗(yàn)室用于進(jìn)一步的觀察和檢測。脫色液配制：將10 g 水合氯醛溶解于10 mL 水中配成2.5 g·mL-1水合氯醛溶液。臺盼藍(lán)染色劑配制：將9 mL 甲醇、3 mL 水飽和酚、3 mL 甘油、3 mL 乳酸混合后加入3 mg臺盼藍(lán)配制而成［39］。

1.2 儀器設(shè)備與試驗(yàn)試劑

乙氧氟草醚、百草枯，廣州佳途科技有限公司；乙腈，德國Fisher Chemica 公司；RN40 RNA 提取試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司；ZH120 多糖多酚植物RNA 提取試劑盒，北京華越洋生物科技公司；Nanodrop 2000 超微量紫外可見分光光度計(jì)、ABI7500 fast Real-Time PCR system，美國Thermo Fisher 公司；2100 芯片實(shí)驗(yàn)室GX，安捷倫科技（中國）有限公司；Tissuelyser-48研磨儀，中國凈信公司；SHIMADZUCBM 30A 超高效液相色譜，日本島津公司；4500QTRAP 串聯(lián)質(zhì)譜，美國AppliedBiosystems公司；SteREO Discovery V20體視鏡，德國蔡司公司；EcLipse 80i顯微鏡，日本尼康株式會社；Novaseq 6000 測序儀，美國因美的公司；BE-110四維旋轉(zhuǎn)儀，上海量壹科學(xué)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乙氧氟草醚和百草枯處理 配制濃度為40、60、80、100、120 μmol·L-1乙氧氟草醚和50 μmol·L-1百草枯，選擇無風(fēng)、晴朗、干燥的早晨，以水處理為對照，利用噴霧器對11月末到12月初有新的嫩梢抽出、長勢相近的桂味荔枝果樹自上而下均勻噴霧，至葉片均勻噴濕為止，剩余藥液切忌反復(fù)噴施。樣品組織處理時(shí)間及試驗(yàn)用途等見表1。

表1 試驗(yàn)材料及其處理方式和用途Table 1 Experimental materials and their preservation process and uses

臺盼藍(lán)染色具體步驟：將80 μmol·L-1乙氧氟草醚和50 μmol·L-1百草枯處理20 h 后的嫩梢的葉片剪下，置于5 mL離心管中，于試管中加入2 mL臺盼藍(lán)染色劑以浸沒葉片，再將試管置于水浴鍋中開蓋沸煮2 min，利用脫色液將葉片材料背景洗凈，置于體視鏡及顯微鏡下拍照，組織死細(xì)胞將會被染成藍(lán)色斑。

1.3.2 總RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組建庫及測序 使用CLB+RN40 RNA 提取試劑盒、CTAB+RN40 RNA 提取試劑盒進(jìn)行測序。使用2100 芯片實(shí)驗(yàn)室GX 對RNA完整性進(jìn)行檢測。將mRNA Capture Beads置于四維旋轉(zhuǎn)儀上充分混勻，平衡30 min 后建庫。對于構(gòu)建好的文庫使用Novaseq 6000進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3.3 荔枝數(shù)據(jù)處理、拼裝和激素信號途徑相關(guān)基因的檢索 對獲得的原始讀數(shù)（raw reads）進(jìn)行過濾，去除帶接頭（adapter）的、含N 的和低質(zhì)量的reads，對干凈讀數(shù)（clean reads）進(jìn)行Q20 和Q30 含量計(jì)算。使用HISAT2 v2.1.0 將配對末端clean reads 與參考基因組比對。使用feature Count（1.5.0-p3）計(jì)算映射到每個(gè)基因的讀數(shù)，然后根據(jù)基因的長度計(jì)算每個(gè)基因每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段。

1.3.4 植物激素色譜與質(zhì)譜聯(lián)用含量檢測流程 取桂味荔枝冬梢嫩梢鮮樣，加入液氮，利用研磨儀研磨（50 Hz，1 min）至粉末狀。稱量（100±1） mg 鮮樣粉末，加入1 mL 提取液（甲醇∶水∶甲酸=75∶23∶2），室溫下振蕩15 min，離心（12 000 r·min-1，4 ℃，10 min）后，取上清于新離心管中。向殘?jiān)屑尤?.5 mL 提取液，重復(fù)振蕩和離心，合并上清，4 ℃濃縮儀中濃縮干，加入200 μL 復(fù)溶液（甲醇∶水=4∶1）復(fù)溶，離心（轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1，10 min）后，吸取上清，用0.22 μm 微孔濾膜過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。利用超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)，基于代謝物標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜分析的離子對與保留時(shí)間等信息對目標(biāo)代謝物進(jìn)行定性分析。根據(jù)代謝物保留時(shí)間與峰型信息，對每個(gè)代謝物在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正，確保定性定量的準(zhǔn)確。利用標(biāo)樣制取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，獲取各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)定量信號的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，質(zhì)譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制不同代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將檢測到的所有樣本中目標(biāo)代謝物的積分峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計(jì)算，最終得到實(shí)際樣本中目標(biāo)代謝物的絕對含量數(shù)據(jù)。

1.3.5 總RNA 提取和cDNA 反轉(zhuǎn)錄 選用ZH120 RNA 提取試劑盒，按照說明書提取荔枝總RNA，利用Nanodrop 2000 超微量紫外可見分光光度計(jì)測定總RNA 濃度及純度。為驗(yàn)證乙氧氟草醚處理荔枝冬梢過程中植物細(xì)胞凋亡相關(guān)的激素途徑（乙烯、茉莉酸和水楊酸途徑）的關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，利用qRT-PCR技術(shù)對處理后10、20 和36 h 這3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的15 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證。mRNA 第一鏈cDNA 合成使用2 μg RNA和北京全式金生物TransScript?mRNA RT酶混合系統(tǒng)，使用Nanodrop 2000超微量紫外可見分光光度計(jì)對提取的核酸進(jìn)行濃度檢測。利用常規(guī)qRT-PCR 對差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。cDNA 合成使用2 μg RNA、基因組DNA 清除劑和TransScript?- Uni RT/RI 酶混合系統(tǒng)。

1.3.6 qRT-PCR檢測 qRT-PCR均使用PerfectStart?Green qPCR Super Mix 系統(tǒng)，在ABI7500 fast Real-Time PCR system 儀器上操作。為了獲取荔枝基因組中乙烯、茉莉酸和水楊酸信號途徑相關(guān)基因序列，從擬南芥信息資源（theArabidopsisinformation resource，TAIR）數(shù)據(jù)庫（http：//www. arabidopsis. org/）中查找乙烯生物合成關(guān)鍵基因（AtACS1）、信號途徑關(guān)鍵基因（AtERF1）、茉莉酸生物合成關(guān)鍵基因（AtLOX1、AtAOS1、AtAOC1和AtOPR3）、水楊酸生物合成關(guān)鍵基因（AtEDS1和AtPAD4）的核酸序列，然后在無患子科基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.sapindaceae.com）中比對搜索，獲得荔枝中對應(yīng)的同源基因。最后選取同源性高的15 個(gè)同源基因作為候選基因進(jìn)行表達(dá)量的檢測，包括：2個(gè)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS）基因（LITCHI025775和LITCHI022037），4 個(gè)乙烯反應(yīng)因子（ethylene response factor，ERF）基因（LITCHI026054、LITCHI015333、LITCHI003587和LITCHI015335），2 個(gè)脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）基因（LITCHI003969和LITCHI004066），1 個(gè)丙二烯氧化物合成酶（allene oxide synthase，AOS）基因（LITCHI011121），1個(gè)氧化烯環(huán)化酶（allene oxide cyclase，AOC）基因（LITCHI005484），2 個(gè)氧化植物二烯酸還原酶（oxo-phytodienoic acid reductase，OPR）基因（LITCHI011707和LITCHI017668），1 個(gè)疾病增強(qiáng)易感性（enhanced disease susceptibility，EDS）基 因（LITCHI023136），2 個(gè)植物抗毒素缺陷（phytoalexin deficient，PAD）基因（LITCHI003725和LITCHI016561）。利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)這些基因的qRT-PCR 引物（表2）。反應(yīng)體系共20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq（日本TaKaRa公司）10 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)程序（兩步法）：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品3 次生物學(xué)重復(fù)。使用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

現(xiàn)代物流不僅指原材料、產(chǎn)品等從生產(chǎn)到消費(fèi)的全程實(shí)物流動，還包括伴隨物流活動過程中的物流信息交流，而且，現(xiàn)代物流在使用信息技術(shù)以及網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，將以往分離的物流、商流、信息流和運(yùn)輸、采購、代理、倉儲、配送等環(huán)節(jié)緊密聯(lián)系起來，成為了一條完整的供應(yīng)鏈。因此可以講，現(xiàn)代物流又是信息流、貨物流、資金流和人才流的統(tǒng)一。

表2 目標(biāo)基因的qRT-PCR引物相關(guān)信息Table 2 Information about qRT-PCR primers of the target genes

1.4 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算校正內(nèi)源激素含量及實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，通過方差分析及P檢驗(yàn)比較數(shù)據(jù)間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙氧氟草醚濃度梯度的篩選

由圖1 可知，水處理的冬梢在整個(gè)試驗(yàn)過程中一直保持綠色狀態(tài)。10 h 時(shí)，各濃度處理的荔枝冬梢嫩葉和嫩梢沒有明顯的萎蔫，或只有零星水漬狀斑點(diǎn)。20 h 時(shí)，40、100 和120 μmol·L-1濃度乙氧氟草醚處理的嫩葉出現(xiàn)輕度萎蔫、輕微卷縮或皺褶，或有少量水漬狀斑點(diǎn)，嫩梢生長受抑制，不彎曲；而60和80 μmol·L-1濃度乙氧氟草醚處理的嫩葉明顯褐化、萎蔫、卷曲，有較多水漬狀斑塊轉(zhuǎn)為灼燒狀斑塊，嫩梢卷曲或有大量斑點(diǎn)。36 h 時(shí)，40 μmol·L-1濃度乙氧氟草醚處理的嫩葉有少量水漬狀斑點(diǎn)，嫩梢生長受抑制，嫩葉微卷曲；60 μmol·L-1濃度乙氧氟草醚處理的嫩葉高度褐化、萎蔫，嚴(yán)重卷曲甚至凋落，有較大面積灼燒；80、100 和120 μmol·L-1濃度乙氧氟草醚處理的嫩葉嚴(yán)重褐化、萎蔫，干枯或凋落，嫩梢嚴(yán)重褐化、卷曲甚至干枯。

圖1 對照、乙氧氟草醚處理后0、10、20、36 h時(shí)的荔枝冬梢形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of litchi winter shoots at 0， 10， 20 and 36 h after treatment with control and oxyfluorfen

控梢反應(yīng)時(shí)間顯示，60和80 μmol·L-1濃度乙氧氟草醚處理的反應(yīng)時(shí)間較40、100和120 μmol·L-1濃度的時(shí)間早，在20 h 即可看到明顯的褐化表型。控梢效果顯示，40 μmol·L-1濃度處理的效果不足以抑制荔枝冬梢的生長，60 μmol·L-1濃度處理在36 h 時(shí)的殺梢效果較更高濃度較差，80、100和120 μmol·L-1濃度乙氧氟草醚處理的荔枝冬梢在36 h之后均可達(dá)到較理想的抑制效果（圖1）。綜合處理時(shí)間和抑制效果，80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理是抑制5～8 cm 荔枝冬梢生長最有效的處理濃度。

2.2 乙氧氟草醚與百草枯處理對荔枝冬梢的抑制效果

由圖2 可知，50 μmol·L-1百草枯處理荔枝冬梢在20 h時(shí)嫩葉有較多灼燒狀斑塊，明顯萎蔫卷曲，嫩梢卷曲或有大量斑點(diǎn)；36 h時(shí)嫩葉嚴(yán)重褐化，嫩梢嚴(yán)重褐化干枯。與50 μmol·L-1百草枯處理相比，80 μmol·L-1以上濃度的乙氧氟草醚處理均可達(dá)到相近的效果（圖1、2），可以有效抑制荔枝冬梢生長，使其褐化死亡。

圖2 對照、乙氧氟草醚和百草枯處理后20、36 h時(shí)的荔枝冬梢形態(tài)變化Fig.2 Winter shoots in Litchi treated with oxyfluorfen，paraquat and control， respectively， changed in color after 20 and 36 hours

細(xì)胞膜受損死亡的細(xì)胞可以被臺盼藍(lán)染液染色。觀察用臺盼藍(lán)處理20 h 后的3 組荔枝冬梢細(xì)胞的染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)被80 μmol·L-1乙氧氟草醚和50 μmol·L-1百草枯處理后的荔枝冬梢細(xì)胞均能著色，而對照組的離體嫩梢細(xì)胞幾乎未被染色（圖3）。說明80 μmol·L-1乙氧氟草醚和50 μmol·L-1百草枯處理20 h的荔枝冬梢細(xì)胞膜受損，部分細(xì)胞已經(jīng)死亡，該處理可有效殺死冬梢。

圖3 臺盼藍(lán)分別被水（CK）、乙氧氟草醚和百草枯處理20 h后的荔枝冬梢細(xì)胞的染色情況Fig.3 Trypan blue staining of Litchi winter shoot cells treated with H2O（CK）， oxyfluorfen and paraquat for 20 h， respectively

由圖4可知，被80 μmol·L-1乙氧氟草醚和50 μmol·L-1百草枯處理72 h后，無切口的成熟葉片（包括完整葉片的內(nèi)部組織和邊緣組織）仍然保持與對照組相似的綠色。對有切口的成熟葉片，相比水處理的對照組，百草枯處理能夠明顯造成靠近切口附近的多層細(xì)胞的死亡，而乙氧氟草醚處理切口附近1～2 層組織損傷。因此，在無傷口的成熟葉片正常使用上述兩種試劑無明顯毒害作用，但對有傷口的葉片，乙氧氟草醚的傷害性更弱。

圖4 顯微鏡下，對照、50 μmol·L-1百草枯和80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理72 h后不同狀態(tài)成熟葉片組織的情況Fig.4 Photograph from microscope about the tissue in three different position of mature leaves of Litchi tree from treated with H2O （CK）， 50 μmol·L-1 paraquat and 80 μmol·L-1 oxyfluorfen for 72 h

2.3 乙氧氟草醚處理荔枝冬梢轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果

為了進(jìn)一步分析差異基因（differential expression gene， DEG）的生物學(xué)功能，采用京都基因和基因組大百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對DEGs 進(jìn)行通路富集分析。在處理組中，4 482 個(gè)差異基因涉及57 個(gè)KEGG 途徑，包括細(xì)胞過程、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、新陳代謝、有機(jī)體系統(tǒng)等5 個(gè)方面，大部分途徑屬于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類別。差異基因富集的代謝通路有植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、植物與病原菌互作、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路、植物和淀粉蔗糖代謝途徑（圖5-A），分別涉及118、114、68和67個(gè)相關(guān)基因，聚類基因數(shù)最多的KEGG 途徑是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)信號途徑。Mapman分析結(jié)果顯示，激素信號途徑中，與脅迫反應(yīng)相關(guān)的乙烯、茉莉酸和水楊酸途徑中有大量的基因差異表達(dá)（圖5-B）。

圖5 乙氧氟草醚處理荔枝冬梢中差異基因最富集的KEGG途徑和Mapman脅迫處理后富集途徑Fig.5 The enriched KEGG and Mapman pathways between the DEGs identified in litchi winter shoots treatment with control and oxyfluorfen

2.4 乙氧氟草醚處理荔枝冬梢激素含量測定結(jié)果

轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果顯示（圖5），顯著差異基因富集代謝通路中，基因數(shù)量最多的是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，推測激素可能在乙氧氟草醚抑制的荔枝冬梢生長過程中起到關(guān)鍵性的作用。利用超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對水處理和80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理荔枝冬梢樣品中5 大類激素（生長素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、水楊酸、茉莉酸）中20 種激素物質(zhì)和乙烯前體ACC 的含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示（表3），生長素和細(xì)胞分裂素類激素中各種物質(zhì)的含量變化趨勢不一致，其中吲哚-3-乙酸、吲哚-3-甲醛、吲哚-3-乳酸和吲哚-3-乙酸甲酯含量在乙氧氟草醚處理后較對照升高，吲哚乙酸-天冬氨酸和N-（3-吲哚乙酰基）-L-苯丙氨酸含量則降低。細(xì)胞分裂素中順式-玉米素-D-核糖甙、雙氫玉米素核苷、反式玉米素和玉米素核苷的含量在處理后增加，而6-芐氨基嘌呤、N6-異戊烯腺嘌呤、異戊烯腺嘌呤核苷和反式-玉米素-9-Β-葡萄糖苷的含量在處理后下降。1-氨基環(huán)丙烷羧酸、茉莉酸類（二氫茉莉酸、茉莉酸、茉莉酸-異亮氨酸和茉莉酸甲酯）和水楊酸類（水楊酸和水楊酸-2-O-β-葡萄糖苷）激素物質(zhì)含量在乙氧氟草醚處理后均呈增加趨勢。

表3 水（CK）和80 μmol·L-1乙氧氟草醚（T）處理20 h后的荔枝冬梢激素含量變化Table 3 Changes of hormone concentration in litchi winter shoots after a 20-hour treatment with H2O （CK） and 80 μmol·L-1 oxyfluorfen （T）

2.5 荔枝冬梢激素信號途徑相關(guān)基因相對表達(dá)量對乙氧氟草醚的響應(yīng)特性

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性，從轉(zhuǎn)錄組鑒定到的差異基因中選取了乙烯、茉莉酸和水楊酸途徑中15 個(gè)可能參與乙氧氟草醚處理抑制荔枝冬梢過程的基因進(jìn)行qRT-PCR 分析。結(jié)果顯示，qRT-PCR 分析的基因表達(dá)模式與RNA-Seq 方法分析的基因表達(dá)模式相似，證實(shí)了RNA-Seq數(shù)據(jù)的可靠性。

為了研究乙烯、茉莉酸和水楊酸在乙氧氟草醚處理抑制荔枝冬梢過程中作用的分子機(jī)制，測定了2 個(gè)ACSs基因、4 個(gè)ERFs基因、2 個(gè)LOXs基因、1 個(gè)AOS基因、1 個(gè)AOC基因、2 個(gè)OPR基因、1 個(gè)EDS基因、2 個(gè)PADs基因在80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理后的表達(dá)量變化情況。結(jié)果顯示（圖6），當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到10 h 時(shí)，乙氧氟草醚處理后荔枝嫩梢中的乙烯、茉莉酸和水楊酸途徑基因的相對表達(dá)量與對照整體無顯著差異。當(dāng)處理后時(shí)間達(dá)到20 h 時(shí)，所有檢測基因的相對表達(dá)量與對照相比均出現(xiàn)不同程度的顯著上調(diào)。當(dāng)處理后時(shí)間延長至36 h 時(shí)，大部分檢測基因相對表達(dá)量較20 h時(shí)有不同程度的下調(diào)，但乙烯途徑基因LITCHI022037和茉莉酸途徑基因LITCHI003969和LITCHI011121相對表達(dá)量仍呈現(xiàn)上升趨勢。

圖6 荔枝嫩梢中乙烯、茉莉酸和水楊酸信號途徑內(nèi)各基因的相對表達(dá)量對乙氧氟草醚處理的響應(yīng)特性Fig.6 The characteristics of the genes responding to oxyfluorfen treatment in ethylene， jasmonic acid and salicylic acid signaling pathways of the winter shoots in Litchi

3 討論

二苯醚類除草劑在荔枝控梢上的應(yīng)用仍不廣泛，本研究驗(yàn)證了不同濃度乙氧氟草醚對荔枝嫩梢的殺傷效果，發(fā)現(xiàn)80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理控制荔枝冬梢生長的綜合效果最好，低于80 μmol·L-1則后期作用效果較弱，而更高濃度處理在前36 h 的反應(yīng)時(shí)間相較于80 μmol·L-1更長。乙氧氟草醚處理后的荔枝冬梢葉片細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生1O2，這些1O2能夠引起多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化作用，進(jìn)而破壞生物膜的完整性［17］。臺盼藍(lán)染色結(jié)果也證明80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理可以使荔枝嫩梢細(xì)胞膜破損，細(xì)胞出現(xiàn)死亡。對成熟荔枝葉片處理發(fā)現(xiàn)，利用80 μmol·L-1乙氧氟草醚和50 μmol·L-1百草枯處理荔枝成熟葉片72 h 后，無切口的包括完整葉片的內(nèi)部組織仍然保持與對照組相似的綠色。而對有傷口的葉片，80 μmol·L-1乙氧氟草醚傷害性更弱，使用更加安全。并通過對比50 μmol·L-1百草枯的使用效果，發(fā)現(xiàn)80 μmol·L-1乙氧氟草醚對冬梢嫩葉和嫩梢的殺梢效果相近，且具有對成熟葉損傷部位細(xì)胞損傷較小的優(yōu)點(diǎn)。前人在臍橙樹苗和沙糖橘嫩夏梢殺梢效果的研究中也發(fā)現(xiàn)，乙氧氟草醚對柑橘成熟葉片和成熟期果實(shí)無藥害［40-41］。以上結(jié)論為深入研究二本醚類除草劑控梢效果和開發(fā)以二苯醚類除草劑為基礎(chǔ)的新型荔枝殺梢劑提供了一定的參考依據(jù)。

利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較分析水處理和80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理的荔枝冬梢樣品發(fā)現(xiàn)，顯著差異基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物與病原菌互作、MAPK 信號通路等代謝途徑。說明乙氧氟草醚可引起荔枝冬梢中植物激素代謝途徑變化。因此，利用超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定對照和乙氧氟草醚處理20 h后的荔枝冬梢樣品激素或前體含量。結(jié)果顯示6 大類激素中，茉莉酸、水楊酸和乙烯前體ACC 的含量在處理后呈上升趨勢，說明這三種物質(zhì)在荔枝冬梢中響應(yīng)乙氧氟草醚處理。

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組學(xué)和激素含量測定的結(jié)果，利用qRTPCR技術(shù)對荔枝冬梢對照和不同處理時(shí)間樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，使用80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理荔枝嫩梢后10 h 時(shí)還未明顯激活茉莉酸、乙烯和水楊酸信號途徑基因，20 h 時(shí)所有關(guān)鍵基因相對表達(dá)量顯著提高，但在處理36 h后激活效應(yīng)有所降低。當(dāng)處理后時(shí)間延長至36 h時(shí)，大部分基因表達(dá)量水平有不同程度的下調(diào)，僅有乙烯途徑基因LITCHI022037及茉莉酸途徑基因LITCHI003969和LITCHI011121相對表達(dá)量仍呈現(xiàn)上升趨勢。水楊酸信號基因LITCHI023136、LITCHI003725和LITCHI016561相對表達(dá)量在20 h 時(shí)較10 h 明顯提高，而乙烯和茉莉酸基因LITCHI025775、LITCHI026054、LITCHI015333、LITCHI003587、LITCHI015335、LITCHI004066、LITCHI005484、LITCHI011707和LITCHI017668不 僅 在20 h 時(shí)表達(dá)量明顯提高，在處理36 h 仍有部分基因（LITCHI022037、LITCHI003969和LITCHI011121）的表達(dá)量較20 h升高?；虮磉_(dá)趨勢結(jié)果與表型結(jié)果相吻合，說明這三種激素信號基因在乙氧氟草醚處理荔枝冬梢時(shí)通過脅迫響應(yīng)及介導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡途徑參與到抑制荔枝冬梢生長的過程。其中乙稀和茉莉酸信號基因在處理36 h 時(shí)仍有顯著升高的結(jié)果，與前人研究結(jié)果一致［37-38］。近年來，采用生化藥物控制荔枝嫩梢的技術(shù)在不斷完善，主要通過嘗試不同藥物、時(shí)間、計(jì)量來總結(jié)在施用過程中的適用比例［42-43］。本研究利用乙氧氟草醚處理后，荔枝嫩梢內(nèi)生成的單線態(tài)氧會造成荔枝冬梢細(xì)胞膜的損傷。同時(shí)，單線態(tài)氧可能作為信號誘導(dǎo)乙烯、水楊酸鹽和茉莉酸代謝，導(dǎo)致荔枝冬梢生長被抑制并最終死亡。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理控殺桂味荔枝冬梢效果最好。利用臺盼藍(lán)染色證明80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理可使荔枝冬梢細(xì)胞膜受損并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與水處理相比，80 μmol·L-1乙氧氟草醚處理后的荔枝冬梢中乙烯、茉莉酸和水楊酸類激素物質(zhì)的含量在處理后20 h 增加。由于荔枝生長周期長，且再生體系技術(shù)尚未成熟，一些激素信號途徑關(guān)鍵基因并沒有得到確證，這使得荔枝激素調(diào)控分子機(jī)制的研究難以順利開展。本研究對乙氧氟草醚處理后荔枝冬梢中與單線態(tài)氧信號途徑互相關(guān)聯(lián)的乙烯、水楊酸鹽和茉莉酸信號、代謝途徑關(guān)鍵基因在10、20 和36 h 的相對表達(dá)量進(jìn)行了檢測，變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果一致，說明植物激素及其相關(guān)基因在乙氧氟草醚控制荔枝冬梢生長中可能發(fā)揮著重要作用。