蘋果甘油二酯激酶基因MpDGK7過表達對擬南芥植株抗旱性的影響

譚延肖 韓梅梅 張 超 常培培 徐文勝

（德州市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 德州 253015）

在自然界中，干旱、高鹽、極端溫度以及病蟲害等生物和非生物脅迫常常會對植物的生長發(fā)育造成嚴重的不良影響［1］。為了在各種不利的生存環(huán)境下維持生命并進行持續(xù)的生長發(fā)育，植物進化出一系列復雜的調(diào)控機制以應對外部環(huán)境刺激并保護自身免受脅迫傷害，其中包括磷脂酸（phosphatidic acid，PA）信號調(diào)控網(wǎng)絡［1-2］。

PA 是植物中一種重要的信號分子［2］，可以被各種生物及非生物逆境脅迫觸發(fā)，包括干旱［1］、病原菌侵染［3］、脫落酸［4］、高鹽［5］、冷害［6］和物理傷害［7］等。PA的合成有利于提高植物對不利環(huán)境的適應性。在植物細胞中，PA 可以通過兩種不同的代謝途徑產(chǎn)生：1）通過磷脂酶D（phospholipase D，PLD）的不同亞型作為結構磷脂的水解產(chǎn)物；2）通過磷脂酶C（phospholipase C，PLC）和甘油二酯激酶（diacylglycerol kinase，DGK）的聯(lián)合活性［8］。其中，DGK 可以通過磷酸化甘油二酯（diglycerylester， DAG）催化合成PA。

DGK 在高等植物中以不同亞型存在，其活性已在不同物種中得到證實，包括擬南芥（Arabidopsisthaliana）［9］、水 稻（Oryza sativa）［10］、番 茄（Solanum lycopersicum）［11］、玉 米（Zea mays）［12］、小 麥（Triticum aestivum）［13］等。植物DGK 具有保守的催化結構域和激酶活性所必需的ATP 結合位點（GXGXXG/A），同時DGK 的活性受到嚴格調(diào)節(jié)，以協(xié)調(diào)DAG 和PA 的水平，使細胞能夠正常執(zhí)行其生理功能［14］。大量研究表明，DGK 在植物生長、發(fā)育以及響應生物和非生物脅迫過程中起著至關重要的作用。在擬南芥中，除莖外，AtDGK2基因表達在整個植株中均有發(fā)現(xiàn)，并且受低溫（4 ℃）脅迫誘導，表明AtDGK2可能參與了冷信號轉(zhuǎn)導［14］；而AtDGK7基因轉(zhuǎn)錄本主要存在于莖、葉和花中，其活性受pH 值、去污劑和R59022 抑制劑的影響［9］。另外，在水稻中發(fā)現(xiàn)的OsBIDK1基因轉(zhuǎn)化煙草增強了轉(zhuǎn)基因植物的抗病性［15］，而通過抑制DGK的活性則大大降低了植物的生長和根系的伸長［16］。但目前仍鮮見DGK家族基因在木本植物中的功能研究。

本研究前期通過對蘋果DGK 家族成員進行全基因組鑒定和分析，從蘋果屬楸子（Malus prunifolia）中成功克隆到出4 個DGK基因（GenBank 登錄號分別為KM099880，KM099881，KM099882 和KM099883），其中MpDGK7（KM099883）基因表達受高鹽、干旱以及外源脫落酸（abscisic acid， ABA）處理調(diào)控［1］。本研究通過農(nóng)桿菌介導法將MpDGK7基因在擬南芥Columbia中進行過量表達，鑒定過表達株系材料的抗旱性，探索MpDGK7基因在干旱脅迫響應過程中的功能，以期為進一步揭示該基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗用擬南芥為Columbia 生態(tài)型，克隆載體pMD18T-simple 購于日本TaKaRa，植物表達載體pBI121 為德州市農(nóng)業(yè)科學研究院實驗室保存。大腸桿 菌（Escherichia coli）Top10 感受態(tài)細胞、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 購于北京天根生化科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1MpDGK7過表達擬南芥植株的獲得 采用Weigel 等［17］的方法對擬南芥種子進行消毒，然后置于1/2 MS 固體培養(yǎng)基中，4 ℃暗箱條件下孵育3 d。轉(zhuǎn)移到人工氣候箱發(fā)芽7～10 d 后，成苗移栽到土壤中。人工氣候箱培養(yǎng)條件：溫度22 ℃，空氣相對濕度70%，光強度100 μmol·m-2·s-1，光周期16 h光/8 h暗。

首先將MpDGK7編碼區(qū)克隆到pBI121 載體CaMV 35S啟動子下游［15］，所用引物見表1。然后將重組將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 菌株感受態(tài)細胞，用花浸漬法轉(zhuǎn)化擬南芥［18］。最后將收獲的轉(zhuǎn)化T1 代種子進行表面消毒后，播種在含有50 mg·L-1卡那霉素的MS 篩選培養(yǎng)基上，篩選至T3代。

擬南芥DNA提取方法參考植物DNA提取試劑盒說明書（北京天根生化科技有限公司）進行，分別以野生型和轉(zhuǎn)基因T3代擬南芥葉片DNA為模板，進行目的基因PCR 檢測。對PCR 檢測呈陽性的轉(zhuǎn)化株系，采用改良CTAB法［19］提取葉片RNA，并利用半定量RT-PCR（semiquantitative real-time PCR）和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）［1］（所用引物見表1）檢測MpDGK7在轉(zhuǎn)基因株系中的表達水平。

1.2.2MpDGK7過表達擬南芥植株抗旱性鑒定 采用土壤控水的方式對生長3 周的擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因株系進行逐漸干旱處理7 d［1］，對照為正常供水。處理3 d時，采樣觀察葉片氣孔特性。處理7 d時，測定對照和處理植株的葉片鮮重、相對電導率及葉綠素含量，采樣液氮速凍，-80 ℃條件下保存。

1.2.3 葉片相對電導率及葉綠素含量測定 參考Dionisio-Sese 等［20］的方法，使用DSS-307 電導率儀（上海虹益儀器儀表有限公司）測定葉片相對電導率。蒸餾水空白電導率為C0；將10 個葉圓片投入10 mL 蒸餾水中，30 ℃水浴2 h 時，測定值記錄為初始電導率C1；沸水條件下10 min，冷卻，測定最終電導率C2。葉片相對電導率（electrical conductivity，EC）計算公式如下：

取1 g 葉片，加入10 mL 80%丙酮浸提24 h，使用UV-2550 分光光度計（日本島津）測定663、645 和470 nm 波長下的吸光值，計算葉綠素含量，計算方法參考文獻［21］。

1.2.4 葉片氣孔特征觀察 在JSM-6360LV 掃描電鏡（日本JEOL）下觀測葉片氣孔特征。樣品制備參考馬小衛(wèi)［22］的方法。使用Image J 1.8.0 軟件統(tǒng)計氣孔密度和氣孔開張度。

1.2.5 過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量測定H2O2提取和測定方法參考文獻［23］。使用UV-2550分光光度計在410 nm波長下測量吸光值，根據(jù)標準曲線計算H2O2的濃度，計算方法參考文獻［23］。

MDA含量測定：取1 g葉片，加入2 mL預冷的0.1%（w/v）三氯醋酸（trichloroacetic acid， TCA）溶液充分研磨，4 ℃下12 000×g離心20 min；取1 mL 上清，加入1 mL 0.65%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA），沸水浴30 min，移至冰中終止反應，4 ℃條件下5 000×g離心10 min。用UV-2550分光光度計測定532和600 nm波長下的吸光值，計算MDA 含量，計算方法參考文獻［24］。

1.2.6 抗氧化系統(tǒng)相關酶活性測定 取1 g葉片，加入2 mL 50 mmol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液（pH 值7.8，含1 mmol·L-1EDTA-Na2和11% Triton X-100）和2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮研磨至勻漿。4 ℃下12 000×g離心20 min，取上清測定過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性，測定方法參考文獻［25］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗處理重復3 次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計進行3 次生物學重復。采用Excel 2010 和SPSS 13.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用Sigma Plot 軟件作圖，并應用獨立樣本的t檢驗對變量進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 MpDGK7 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得及分子水平檢測

為研究MpDGK7的生物學功能，將MpDGK7基因的開放閱讀框（open reading frame， ORF）插入CaMV 35S啟動子下游，利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化擬南芥Columbia野生型。經(jīng)目的基因PCR 鑒定，共獲得6 個轉(zhuǎn)基因株系（圖1-A），隨后利用半定量RT-PCR 和qRT-PCR 檢測MpDGK7基因表達量，發(fā)現(xiàn)MpDGK7基因在所有轉(zhuǎn)化株系中均有表達，選取其中表達量較高的兩個株系（#3和#4）用于后續(xù)試驗（圖1-B、C）。

圖1 MpDGK7轉(zhuǎn)基因擬南芥分子檢測Fig.1 Molecular characterizations of MpDGK7 transgenic Arabidopsis plants

2.2 MpDGK7轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性鑒定

前期研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可以誘導MpDGK7基因上調(diào)表達［1］。為進一步明確MpDGK7基因在干旱脅迫響應過程中的生物學功能，本試驗對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進行了自然干旱處理。從圖2-A 可以看出，干旱處理前野生型和轉(zhuǎn)基因株系均生長良好且沒有明顯差異，經(jīng)過7 d 控水處理后，轉(zhuǎn)基因株系明顯比野生型長勢更強。在處理7 d 時，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系保持了較高的葉片鮮重（圖2-B）、較低的葉片相對電導率（圖2-C）和較高的葉綠素含量（圖2-D）。由此可以看出，MpDGK7基因過量表達有利于提高擬南芥植株的抗旱性。

圖2 MpDGK7轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性鑒定Fig.2 Drought tolerance test of MpDGK7 transgenic Arabidopsis

2.3 干旱脅迫下MpDGK7 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片氣孔特性的變化

干旱條件下，氣孔運動是影響植物葉片水分散失的重要因素。因此，在自然干旱3 d 后，對轉(zhuǎn)基因株系和野生型葉片氣孔特性進行觀察，如圖3-A 所示。正常供水和干旱處理后，轉(zhuǎn)基因株系與野生型葉片氣孔密度均無顯著差異（圖3-B），而在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因株系氣孔張開度更低（圖3-C）。這些結果表明，MpDGK7基因過量表達能夠促進干旱下擬南芥葉片氣孔的迅速關閉。

圖3 干旱脅迫下MpDGK7轉(zhuǎn)基因擬南芥的氣孔特征Fig.3 Stomatal characteristic of MpDGK7 transgenic Arabidopsis under drought stress

2.4 干旱脅迫下MpDGK7轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片H2O2水平和MDA含量的變化

H2O2的產(chǎn)生是植物遭受不利環(huán)境的特征和受到傷害的癥狀指標［26］。本研究中，正常供水下，葉片生長狀態(tài)良好，轉(zhuǎn)基因株系和野生型植株體內(nèi)H2O2的積累量都保持在較低的水平，而干旱脅迫導致H2O2大量積累，但轉(zhuǎn)基因植株積累的H2O2含量顯著低于野生型植株（P＜0.001）（圖4-A）。

圖4 干旱脅迫下MpDGK7轉(zhuǎn)基因擬南芥H2O2和MDA含量Fig.4 H2O2 content and MDA accumulation of MpDGK7 transgenic Arabidopsis under drought stress

同時，植物體積累的活性氧（reactive oxygen， ROS）可以直接與氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生反應，導致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 含量增加。本試驗中，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因株系和野生型葉片中MDA 含量均有所升高，但轉(zhuǎn)基因株系中MDA 的積累量顯著低于野生型植株（圖4-B）。這表明MpDGK7過量表達可以緩解干旱脅迫誘導的膜脂過氧化損傷。

2.5 干旱脅迫下MpDGK7 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化

CAT、POD 和APX 可以促進H2O2的降解［26-28］，在ROS清除過程中發(fā)揮重要作用。通過對轉(zhuǎn)基因株系和野生型葉片中幾種關鍵抗氧化酶活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下，CAT、POD和APX的活性都出現(xiàn)了明顯變化，然而在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)這些抗氧化酶的活性顯著高于野生型（P＜0.01 或P＜0.001）（圖5-A～C）。表明MpDGK7可能通過影響抗氧化酶活性調(diào)控植株體內(nèi)H2O2的平衡進而影響對干旱脅迫的抗性。

圖5 干旱脅迫下MpDGK7轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗氧化酶活性Fig.5 Antioxidant enzyme activities of MpDGK7 transgenic Arabidopsis under drought stress

3 討論

真核細胞中，由PLD 或PLC/DGK 偶聯(lián)途徑合成PA是重要的信號轉(zhuǎn)導過程［8］。在植物中，DGK、DAG和PA 參與植株的生長、發(fā)育和對環(huán)境脅迫的響應過程［16，29-30］。本試驗對蘋果MpDGK7基因在干旱脅迫下的生物學功能進行了相關研究，結果表明，當遭受干旱脅迫時，MpDGK7基因的過量表達提高了擬南芥植株的抗旱性，使轉(zhuǎn)基因植株的細胞活力得以更好地維持，包括電導率、葉綠素濃度和脂質(zhì)過氧化水平（即MDA含量）。

氣孔的開放和關閉受外部環(huán)境變化和內(nèi)部調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，進而維持細胞水平衡和完成復雜的信號轉(zhuǎn)導過程［31-32］。通過調(diào)節(jié)氣孔，植物可以對干旱、低溫和鹽堿化等環(huán)境脅迫做出快速響應，以減少水分流失，維持正常生長發(fā)育［33］。本研究發(fā)現(xiàn)，MpDGK7轉(zhuǎn)基因株系和野生型植物在氣孔密度上無顯著差異，而在干旱處理下轉(zhuǎn)基因植物的氣孔關閉比野生型植物更敏感。這說明MpDGK7可能會影響環(huán)境刺激誘導的葉片氣孔關閉過程，從而最大程度地減少干旱環(huán)境下通過蒸騰作用造成的水分散失，進而調(diào)控植株的抗旱性。

不利的生存環(huán)境也會導致植物體ROS 的產(chǎn)生，ROS 與蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等直接反應，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，最終導致細胞損傷甚至死亡［26］。ROS 積累通常是干旱脅迫造成植株細胞損傷的一個主要原因。本研究結果表明，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植物葉片中H2O2積累明顯低于野生型。與野生型植株相比，CAT、POD 和APX 作為主要的H2O2清除酶，在轉(zhuǎn)基因株系中始終保持較高活性。因此，MpDGK7可能在調(diào)節(jié)H2O2穩(wěn)態(tài)和抗氧化酶活性中發(fā)揮重要作用，從而有效減輕逆境脅迫誘導的氧化損傷，提高植物對不利環(huán)境的適應性。

綜上，某些DGK基因在調(diào)控植物應對不利環(huán)境的響應中發(fā)揮關鍵作用，但DGKs應答逆境脅迫的分子調(diào)控機制仍不明晰，在進一步研究中需要明確其調(diào)控的靶蛋白，以及逆境環(huán)境下如何影響PA合成及其信號轉(zhuǎn)導過程。

4 結論

本研究結果表明，MpDGK7在植物體對干旱脅迫的響應過程中發(fā)揮積極作用，能夠通過影響氣孔運動，調(diào)節(jié)H2O2穩(wěn)態(tài)，從而增強植株對不利環(huán)境的適應性。