液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水蝦中氯霉素殘留的前處理優(yōu)化研究

蘆珊珊 黎川 杜美娜

摘 要：目的：分別建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡水紅蝦、青蝦中氯霉素殘留量的前處理方法。方法：分別采用3種前處理方法對淡水紅蝦、青蝦進(jìn)行氯霉素提取凈化的優(yōu)化試驗，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果：采用方法c處理淡水紅蝦，回收率為90.7%～93.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.7%～9.7%；采用方法a處理淡水青蝦，回收率為90.2%～92.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%～6.7%，均可滿足實驗室質(zhì)量控制要求。結(jié)論：建立的適用于淡水紅蝦、青蝦的兩種前處理試驗方法，操作簡便，可以滿足淡水紅蝦、青蝦的氯霉素殘留量的檢測。

關(guān)鍵詞：淡水蝦；氯霉素；前處理；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

Abstract： Objective： To establish a pre-treatment method for the determination of chloramphenicol residues in freshwater red shrimp and green shrimp by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： The extraction and purification of chloramphenicol from freshwater red shrimp and green shrimp were optimized by three pretreatment methods， and the recovery rate and relative standard deviation were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Result： The recoveries of freshwater red shrimp were 90.7%～93.6% with relative standard deviation （RSD） of 6.7%～9.7% with method c in this paper， and the recoveries of freshwater green shrimp were 90.2%～92.6% with relative standard deviation of 5.0%～6.7% with method a in this paper， both of which could meet the requirements of laboratory quality control. Conclusion： The two pretreatment methods for fresh water red shrimp and green shrimp are easy to operate and can satisfy the determination of chloramphenicol residues in fresh water red shrimp and green shrimp.

Keywords： freshwater shrimp; chloramphenicol; pretreatment; liquid chromatography tandem mass spectrometry

在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中，為了高效地防治疾病和加快水生動物的生長，會添加使用抗生素[1-2]。近年來，抗生素殘留引發(fā)的一系列問題也越來越受到國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注[3]。

氯霉素作為一種廣譜類抗生素藥物，因具有良好的抗菌效果而被水產(chǎn)養(yǎng)殖戶廣泛使用。因此，建立高效的氯霉素檢測方法對水產(chǎn)品食品安全具有重要意義[4]。目前，已報道的氯霉素檢測方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、液相色譜法[8-9]和酶聯(lián)免疫法[10]等。有效的前處理是影響氯霉素殘留量檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要環(huán)節(jié)之一。本文采用3種不同的前處理方法對淡水蝦進(jìn)行試驗，分別建立了適用于淡水紅蝦和青蝦的快速、高效的氯霉素殘留量檢測的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

淡水蝦（紅蝦、青蝦）為本地農(nóng)貿(mào)市場采購的活鮮。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（999.1 ?g·mL-1）、氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.1 ?g·mL-1），購于北京曼哈格生物科技公司；乙腈、正己烷、甲醇和甲酸均為色譜純，F(xiàn)isher公司；無水硫酸鈉和無水硫酸鎂均為優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C18固相萃取柱（500 mg/3 mL），深圳逗點生物技術(shù)有限公司。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters Xevo TQD）；渦旋儀（IKA lab dance）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

（1）氯霉素（9.991 ?g·mL-1）第一標(biāo)準(zhǔn)中間液配制。準(zhǔn)確吸取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（999.1 ?g·mL-1）100 ?L至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

（2）氯霉素（99.91 ng·mL-1）第二標(biāo)準(zhǔn)中間液配制。準(zhǔn)確吸取氯霉素（9.991 ?g·mL-1）第一標(biāo)準(zhǔn)中間液100 ?L至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。現(xiàn)用現(xiàn)配。

（3）氯霉素-D5（20.02 ng·mL-1）內(nèi)標(biāo)工作溶液配制。準(zhǔn)確吸取氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.1 ?g·mL-1）100 ?L至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為1 001 ng·mL-1的氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)溶液；準(zhǔn)確吸取上述氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)溶液（1 001 ng·mL-1）200 ?L至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為20.02 ng·mL-1的氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)工作溶液。

（4）氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制。分別準(zhǔn)確吸取氯霉素（99.91 ng·mL-1）第二標(biāo)準(zhǔn)中間液5 ?L、10 ?L、20 ?L、50 ?L和100 ?L至1.0 mL容量瓶中，各加入氯霉素-D5（20.02 ng·mL-1）內(nèi)標(biāo)工作溶液250 ?L，用50%甲醇水溶液定容，得到系列濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：Waters C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.2 mL·min-1；流動相甲醇-水（50∶50）。

（2）質(zhì)譜條件。離子化模式：ESI，負(fù)離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子化電壓：-4 500 V；離子源溫度：550 ℃。

1.2.3 前處理優(yōu)化方法

對已知陰性的生鮮淡水紅蝦和青蝦，分別取可食用部分進(jìn)行絞碎，并使其均質(zhì)勻漿。

取淡水紅蝦、青蝦勻漿樣品，分別進(jìn)行加標(biāo)試驗，氯霉素加標(biāo)濃度均為0.10 ?g·kg-1、0.50 ?g·kg-1和1.00 ?g·kg-1這3個加標(biāo)水平。分別按前處理方法a、b、c充分提取凈化后進(jìn)行儀器測定，每個樣品重復(fù)測定6次，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD），考察精密度。

（1）方法a。稱取5 g勻漿樣品于50 mL離心管中，加入250 ?L氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)工作液，加20 mL 1%乙腈、10 g無水硫酸鈉，渦旋混合，經(jīng)超聲波提取，離心后取上清液，殘渣重復(fù)提取1次，合并上清液，于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加1.0 mL 50%甲醇溶液溶解殘留物，再加2 mL正己烷，渦旋振蕩后離心，上層液轉(zhuǎn)移到離心管中，取下層清液過濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

（2）方法b。在方法a的基礎(chǔ)上，加入2.0 mL 50%甲醇溶液溶解殘留物和5 mL正己烷，萃取兩次，渦旋混勻，離心，取下層清液置于離心管中，在進(jìn)行液液分配時，加入少量乙醚，稀釋有機(jī)相，使之比重減小，出現(xiàn)分層。合并兩次萃取的下層清液，氮氣吹干，用1.0 mL 50%甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

（3）方法c。稱取5 g勻漿樣品于50 mL離心管中，加入250 ?L氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)工作液、5 mL乙腈、5 mL 4%氯化鈉溶液，渦旋振蕩，離心后取上清液，殘渣重復(fù)提取1次，合并上清液。再加5 mL正己烷，渦旋振蕩后離心，上層液轉(zhuǎn)移到離心管中，重復(fù)提取一次，合并提取液，氮氣吹干，加入3 mL 5%乙腈使其溶解。過C18固相萃取柱，50%甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。然后加入經(jīng)水飽和的乙酸乙酯溶液4 mL，渦旋振蕩1 min，取上清液，重復(fù)操作一次，合并上清液，進(jìn)行液液萃取，氮氣吹干，再加入1.0 mL 50%甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

方法a、b、c均采用具有高分離效能的鈉鹽析分層，實現(xiàn)待測物從水相到有機(jī)相的轉(zhuǎn)移，方法a、b采取液液萃取的方式進(jìn)行提取凈化，方法b較a增加了液液萃取的凈化步驟，方法c在a的基礎(chǔ)上增加了固相萃取進(jìn)行凈化。

2.1 線性關(guān)系考察

將氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按1.2.2項下儀器條件方法進(jìn)行測定，內(nèi)標(biāo)法定量，記錄色譜圖。以氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，以氯霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，得到線性方程為y=2.288 71x+0.099 520 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 239，表明該檢測方法在0.5～10.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好。

2.2 淡水紅蝦的前處理優(yōu)化結(jié)果分析

由表1可知，淡水紅蝦采用方法a進(jìn)行前處理，氯霉素的平均回收率為9.6%～16.4%，這是因為采用方法a進(jìn)行前處理的過程中，即“加1.0 mL 50%甲醇溶液溶解殘留物，再加2 mL正己烷，渦旋振蕩后離心”，出現(xiàn)嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，采用室溫過夜靜置乳化層仍舊不能消除。乳化現(xiàn)象導(dǎo)致正己烷層與50%甲醇水溶液層無法完全分層，致使目標(biāo)物提取不完全，從而導(dǎo)致回收率低。

采用方法b進(jìn)行前處理，氯霉素的平均回收率為70.5%～72.5%，這是因為方法b增加了液液萃取步驟，同時在進(jìn)行液液分配時，加入少量乙醚，稀釋有機(jī)相，使之比重減小，容易分層，消除了乳化現(xiàn)象，使回收率有所提升。

采用方法c進(jìn)行提取和固相萃取凈化，結(jié)果顯示紅蝦的回收率較方法a、b有明顯提升，可以達(dá)到90.7%～93.6%。綜上可知，方法b、c的樣品回收率及RSD符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F的要求，即加標(biāo)量小于0.1 mg·kg-1時回收率為60%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%的要求。方法a的回收率和RSD結(jié)果不符合實驗室質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)要求。對比方法b、c可以看出，方法c的平均回收率更高，因此，淡水紅蝦選用方法c進(jìn)行前處理提取凈化。

2.3 淡水青蝦的前處理優(yōu)化結(jié)果分析

由表2可知，淡水青蝦采用方法a進(jìn)行前處理，回收率為90.2%～92.6%，RSD在5.0%～6.7%，符合GB/T 27404—2008附錄F的要求。

采用方法b的氯霉素的回收率為91.2%～93.1%，RSD在4.6%～6.2%，較方法a變化不大，采用方法c的氯霉素的回收率為90.5%～92.1%，RSD在5.4%～6.3%，較方法a變化不明顯。對比方法b和方法c，比較平均回收率和RSD，數(shù)據(jù)變化不大。因此，淡水青蝦采用方法a進(jìn)行前處理即可滿足實驗室質(zhì)量控制要求。同時，方法a試驗操作步驟少，較b和c在試驗材料與試劑的使用上也更經(jīng)濟(jì)、更環(huán)保。

3 討論

在對氯霉素殘留的檢測中，淡水紅蝦與淡水青蝦在前處理的方法上有所不同，本文中淡水紅蝦所采用的方法c，前處理過程首先經(jīng)過4%氯化鈉溶液鹽析分層，去除蛋白，然后經(jīng)過正己烷脫脂，再經(jīng)乙酸乙酯提取，實現(xiàn)待測物從水相到有機(jī)相的轉(zhuǎn)移，最后采用固相萃取，實現(xiàn)對待測物的凈化。淡水青蝦則使用方法a，即前處理首先經(jīng)過4%氯化鈉溶液鹽析分層，去除蛋白，然后經(jīng)過正己烷脫脂，再經(jīng)乙酸乙酯提取，即可實現(xiàn)待測物從水相到有機(jī)相的轉(zhuǎn)移及凈化。筆者分析主要原因是淡水紅蝦脂肪、蝦青素等大分子化合物含量較青蝦更高，在進(jìn)行前處理時，大分子化合物難以去除，因此淡水紅蝦與青蝦的前處理方法不同。

4 結(jié)論

本方法通過對兩種水產(chǎn)品（淡水紅蝦、淡水青蝦）進(jìn)行前處理優(yōu)化研究，分別建立了適用于淡水紅蝦和青蝦的氯霉素殘留量快速檢測的提取凈化方法，操作簡便，經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，內(nèi)標(biāo)法定量，采用方法c處理淡水紅蝦，回收率為90.7%～93.6%，采用方法a處理淡水青蝦，回收率為90.2%～92.6%，符合實驗室質(zhì)量控制要求，可以滿足淡水紅蝦、青蝦中的氯霉素殘留量檢測。

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