水中大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類和喹諾酮類抗生素前處理分析方法優(yōu)化★

楊 栩，陳弘麗

（廣東省中山生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，廣東 中山 528400）

抗生素是一類由微生物或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的即次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細胞發(fā)育功能的化學物質(zhì)[1]。作為一種消炎藥物被廣泛應用于各種病痛的治療當中，但是抗生素被濫用的危害也是顯而易見的。近20 年來，中國的湖泊被報道檢測出有39 種抗生素，其主要類型為磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)類脂類以及β-內(nèi)酰胺類等[2]。其中，單一磺胺類抗生素的質(zhì)量濃度最高達940 ng/L，是檢出濃度最高的種類之一，而單一喹諾酮類抗生素濃度最高可達713 ng/L[2]。正是因為對環(huán)境持續(xù)輸入，抗生素對生態(tài)環(huán)境帶來危害，同時通過物質(zhì)與能量循環(huán)，對人體健康產(chǎn)生影響。因此，提升抗生素的檢測分析技術(shù)有助于在“環(huán)境-生物-人類”系統(tǒng)中了解抗生素在各要素間的相互聯(lián)系和作用，對環(huán)境中抗生素的痕量分析、溯源追蹤和循環(huán)流動，為后續(xù)抗生素的處理和有效使用有著積極的指導意義。

1 抗生素前處理分析研究發(fā)展現(xiàn)狀

我國目前還沒有建立適用于水中多組分抗生素的檢測標準，根據(jù)已有的檢測技術(shù)大部分暫時不能實現(xiàn)多種類型抗生素的同時檢測，導致檢測耗時較長、操作過程繁瑣[3]。經(jīng)過多年的技術(shù)發(fā)展，UPLC-MS/MS技術(shù)可對復雜的樣品進行快速分析，準確定性、定量目標化合物，顯著提高信噪比和靈敏度[4]，目前已經(jīng)成為抗生素檢測與研究最常用的分析儀器技術(shù)。根據(jù)大量研究抗生素分析的文獻顯示，固相萃取法作為抗生素分析的預處理方法最為普遍[5]。然而較少文獻對預處理方法優(yōu)化進行深入研究，部分已有研究成果在適用種類或目標物數(shù)量方面具有局限性，主要集中在過濾條件、淋洗液種類及比例用量和干燥時長[6]這幾個因素，鮮有文獻在不同pH 值的水樣條件下探討不同種類抗生素的預處理效果，而縱觀多數(shù)文獻對各自地方河流或其他載體進行抗生素污染空間分布特征和環(huán)境風險評估等研究時，采用的都是酸性條件下的水樣，但并沒有在其他條件下和種類數(shù)量上進行更深入的探討，而且同類抗生素中回收率高的目標物數(shù)量并不多[7]。

本文主要考慮在5 種不同pH 值和添加不同濃度EDTA 的水樣條件下，對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、磺胺類抗生素和喹諾酮類抗生素部分目標物回收率的影響。

2 實驗部分

2.1 主要儀器和試劑耗材

主要儀器：液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀，LC-30AD Triple Quad 4500；色譜柱，島津XRD-ODS，100 mm×2.0 mm；全自動固相萃取儀，GL Sciences 799；氮吹濃縮儀，TurboVapⅡ；棕色采樣瓶（2 500 mL，棕色磨口硬質(zhì)玻璃瓶）；其他一些實驗室常用儀器和設(shè)備。

主要試劑、耗材：甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；甲酸，色譜純；鹽酸，分析純；氨水，分析純；EDTA，分析純；無水硫酸鈉，分析純；標準溶液、固相萃取柱（HLB，200 mg，6 mL）和濾膜（0.22 μm）。

2.2 高效液相色譜儀器條件（表1）

流動相A：水相（0.1%甲酸）；流動相B：乙腈（0.1%甲酸）；洗針液：甲醇喝水（1∶1）混合。梯度洗脫程序見表1：流速0.4 mL/min；柱溫，40 ℃；進樣體積，10 μL。

2.3 水樣預處理條件（固相萃取條件）

分別取5 組共10 個1 000 mL 水樣，分別加入10 μg 標準物質(zhì)，通過氨水或鹽酸分別按照pH 值為2、4、7、9 和12 的范圍調(diào)節(jié)水樣的酸堿性，及同一pH值條件加入不同量的EDTA 進行研究。HLB 固相萃取柱安裝在全自動固相萃取儀上，設(shè)置參數(shù)10 mL 甲醇5 mL/min 流速活化。將上述水樣以15 mL/min 的流速上樣，抽干固相萃取柱，加入10 mL 純水淋洗兩次，最后吹干柱子。用2 mL 甲醇3 mL/min 的流速洗脫。收集洗脫溶液后，再通過無水硫酸鈉脫水，在氮吹濃縮儀上濃縮至1 mL，水浴溫度為40 ℃，氮吹流量調(diào)至液面輕微晃動，用0.22 μm 濾膜過濾，待測。每一個同等條件的水樣全程序重復測定6 次，計算每種條件下的平均回收率。

2.4 曲線的建立

移取適量的抗生素混合標準溶液，配制至少7 個濃度點的標準系列，各組分質(zhì)量濃度分別為2.50、6.25、12.5、25.0、62.5、100、125 μg/L。按照儀器條件，由低濃度到高濃度依次對標準系列溶液進行測定，以標準系列溶液中的目標組分的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，建立標準曲線。

3 結(jié)果與討論

化合物在不同條件下的平均回收率見表2。由表2可知，pH 值對這三類抗生素的形態(tài)和作用有顯著性影響，而EDTA 的添加對各化合物的影響有特別顯著的規(guī)律性。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素有8 種化合物在pH=4條件下加標回收率在80.0%～112%；磺胺類抗生素在pH=4 條件下均有良好的回收率（80.9%～107%）；喹諾酮類抗生素在pH=12 條件下有著良好的回收率（84.4%～112%），三類抗生素添加EDTA的回收率更佳。

表2 各化合物在不同條件下的平均回收率 %

4 結(jié)論

在5 種不同pH 值和是否添加EDTA 試劑的水樣條件下，對8 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、16 種磺胺類抗生素和9 種喹諾酮類抗生素采用固相萃取-HPLC 法進行加標回收率的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和磺胺類抗生素在酸性（pH=4）條件下可以獲得較好的回收率，喹諾酮類抗生素在堿性（pH=12）條件下可以獲得較好的回收率，而對于三類抗生素物質(zhì)，EDTA 的添加對目標物回收率更佳。對不同種類的抗生素目標物進行前處理技術(shù)的探索和優(yōu)化有助于促進抗生素檢測分析技術(shù)的發(fā)展，有效提高水中抗生素分析的準確性，同時抗生素檢測分析方法可以應用于區(qū)域水域的抗生素生態(tài)毒性和健康風險評估，對于未來更好建立和完善水系抗生素檢測分析技術(shù)方法和標準具有積極的意義。