巨細(xì)胞病毒IgM 抗體檢測(cè)試紙條的改良與性能評(píng)價(jià)

陳亨莉

（英科新創(chuàng)（廈門(mén)）科技股份有限公司，福建廈門(mén)361022）

0 引言

巨細(xì)胞病毒是一種皰疹病毒，能引起受感染細(xì)胞腫大，主要通過(guò)血液、性行為及垂直傳播[1]。如果孕婦感染巨細(xì)胞病毒，可導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)宮內(nèi)感染，造成流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或胎兒畸形[2-4]。巨細(xì)胞病毒是“優(yōu)生五項(xiàng)”檢查項(xiàng)目中的一項(xiàng)。在我國(guó)和其他國(guó)家，“優(yōu)生五項(xiàng)”檢查已被列為孕前健康檢查的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，國(guó)內(nèi)主要通過(guò)篩查血清抗體進(jìn)行積極的預(yù)防和控制[5-6]。目前，檢測(cè)血清抗體的常用方法有膠體金免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法和化學(xué)發(fā)光法。ELISA 法手工操作步驟煩瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不能滿(mǎn)足臨床快速診斷的要求；化學(xué)發(fā)光法成本高，對(duì)設(shè)備和人力有較高要求，在基層衛(wèi)生單位實(shí)施起來(lái)有一定難度；而膠體金免疫層析法則簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)成本低、無(wú)需儀器設(shè)備，十幾分鐘即可用肉眼觀察結(jié)果，可實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)，在臨床篩查檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。

膠體金免疫層析法雖有眾多優(yōu)點(diǎn)，但其在檢測(cè)IgM 抗體時(shí)存在一定的漏檢率，易產(chǎn)生假陰性結(jié)果[7]。如樣本中含有高效價(jià)的病原體特異性IgG 抗體，則病原體IgG 抗體與病原體IgM 抗體會(huì)在檢測(cè)線(xiàn)處競(jìng)爭(zhēng)病原體抗原結(jié)合位點(diǎn)而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性[8]。為了消除IgG 抗體的干擾，一般采用抗人IgG抗體結(jié)合去除樣本中的IgG 抗體，該方法多應(yīng)用于ELISA、化學(xué)發(fā)光、免疫比濁檢測(cè)試劑中，在免疫層析試劑中的應(yīng)用較少。目前可采取的方式是將抗人IgG 抗體加入到標(biāo)記物墊、濾過(guò)墊或樣品處理液中[9]。添加至標(biāo)記物墊或者濾過(guò)墊中處理工藝較為煩瑣，而添加在樣品處理液中常溫保存容易造成IgG 抗體失效。鑒于此，為獲得更高的檢測(cè)準(zhǔn)確度，本研究對(duì)巨細(xì)胞病毒IgM 抗體檢測(cè)試紙條進(jìn)行改良，將抗人IgG 抗體直接包被于硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上，即在NC 膜的檢測(cè)線(xiàn)下方設(shè)置一條包被有高濃度鼠抗人IgG 抗體的攔截線(xiàn)以結(jié)合樣本中的干擾IgG 抗體，工藝簡(jiǎn)單合理、高效方便、可操作性強(qiáng)。

1 試紙條的制備

1.1 材料與試劑

巨細(xì)胞病毒重組抗原、鼠抗人IgM 單克隆抗體及鼠抗人IgG 抗體均由北京新創(chuàng)生物工程有限公司提供；NC 膜購(gòu)自德國(guó)Sartorius 公司；玻璃纖維、聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）底板、吸水紙購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司。氯金酸、檸檬酸鈉、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、碳酸鉀（K2CO3）購(gòu)自美國(guó)SIGMA 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱為上海雙五金牌；離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；劃膜儀和數(shù)控切條機(jī)購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.3 膠體金標(biāo)記抗體的制備

1.3.1 膠體金粒徑的選擇

采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金[10]。選擇粒徑大小約為40 nm 的膠體金，觀察膠體金溶液的物理性狀，采用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)300～700 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測(cè)定其最大吸收峰。

（1）增值稅的計(jì)算和抵扣問(wèn)題。上文已經(jīng)提及三種不同的PPP項(xiàng)目付費(fèi)方式，根據(jù)付費(fèi)方式的不同，增值稅的計(jì)算方法也不同。譬如，在營(yíng)改增后，PPP項(xiàng)目增值稅計(jì)算依舊處于探索實(shí)踐中，在建設(shè)投資問(wèn)題上的操作方法不同，是否含稅的問(wèn)題對(duì)于融資成本影響巨大。智慧城市建設(shè)的PPP項(xiàng)目大都集中在軌道交通領(lǐng)域，投資金額巨大，而營(yíng)改增后建筑業(yè)稅率上升到10%。所以，怎樣取得可抵扣增值稅進(jìn)項(xiàng)稅成為項(xiàng)目公司的難題。一旦在建設(shè)期內(nèi)繳納過(guò)高的增值稅銷(xiāo)項(xiàng)稅，會(huì)直接降低后期項(xiàng)目建設(shè)的資金運(yùn)用率。而對(duì)于某些增值稅免征的PPP項(xiàng)目，會(huì)出現(xiàn)項(xiàng)目期間增值稅無(wú)法完全抵扣的問(wèn)題。

膠體金溶液視覺(jué)觀察呈清亮的紫紅色，溶液上層無(wú)漂浮物，底部無(wú)黑色聚集物。如圖1 所示，膠體金溶液的最大吸收峰在534 nm 處，峰寬較小，表明制備的膠體金溶液顆粒分布均勻，透光性和穩(wěn)定性良好。

圖1 膠體金溶液標(biāo)記前后紫外-可見(jiàn)光譜圖

1.3.2 膠體金標(biāo)記最適pH 的選定

取7 個(gè)1.5 mL 離心管，分別加入1 mL 膠體金溶液，然后依次加入5、6、7、8、9、10、11 μL 0.2 mol/L的K2CO3溶液，混勻。再分別加入10 μg 鼠抗人IgM單克隆抗體，混勻。靜置15 min 后，各加入200 μL 10%NaCl 溶液，混勻，靜置2 h，用分光光度計(jì)測(cè)定534 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。保持吸光度值變化最小的K2CO3溶液用量為最適pH。

如圖2 所示，當(dāng)0.2 mol/L K2CO3溶液用量在8～11 μL 時(shí)其吸光度值只有微小變化，溶液保持紫紅色，很穩(wěn)定。在其他用量時(shí)，顆粒出現(xiàn)團(tuán)聚，溶液顏色變?yōu)榛疑蜃仙?。因此，選擇在1 mL 膠體金中加入8 μL 0.2 mol/L K2CO3溶液時(shí)為標(biāo)記最適pH。

圖2 不同K2CO3 溶液用量條件下膠體金標(biāo)記溶液吸光度值的變化

1.3.3 標(biāo)記抗體最適標(biāo)記量的選定

取7 個(gè)1.5 mL 離心管，分別加入1 mL 膠體金溶液，再各加適量0.2 mol/L K2CO3溶液混勻調(diào)至最適pH。體依次加入1、2、5、10、15、20、25 μg 鼠抗人IgM 單克隆抗體，混勻。靜置15 min 后，分別加入200 μL 10%NaCl 溶液，混勻。靜置2 h 后，用分光光度計(jì)測(cè)定534 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。吸光度值最大處對(duì)應(yīng)的標(biāo)記量為穩(wěn)定膠體金的最低抗體量，在此基礎(chǔ)上加20%即為最適的抗體標(biāo)記量。

如圖3 所示，標(biāo)記量小于10 μg 時(shí)，膠體金溶液的吸光度值呈上升趨勢(shì)；標(biāo)記量大于10 μg 后，膠體金溶液吸光度值略微下降后趨于平緩，溶液顏色無(wú)明顯變化，表明10 μg 為穩(wěn)定膠體金的最低抗體量。因此，1 mL 膠體金溶液最適抗體標(biāo)記量為12 μg（最低抗體量基礎(chǔ)上加20%）。

圖3 不同抗體標(biāo)記量的膠體金標(biāo)記溶液吸光度值的變化

1.3.4 膠體金標(biāo)記抗體的表征

隨著標(biāo)記過(guò)程中膠體金顆粒表面與抗體和BSA的結(jié)合，其最大吸收峰會(huì)發(fā)生移動(dòng)，由圖1 可以看出，膠體金標(biāo)記鼠抗人IgM 單克隆抗體后，最大吸收峰所在波長(zhǎng)由534 nm 移至541 nm，說(shuō)明膠體金標(biāo)記成功。

1.4 膠體金墊的制備

1.5 改良NC 膜的制備

沿著層析方向在NC 膜上依次設(shè)置IgG 抗體攔截線(xiàn)I、檢測(cè)線(xiàn)T 及對(duì)照線(xiàn)C，如圖4 所示。根據(jù)前期研究[8]，最終確定攔截線(xiàn)I 上包被的鼠抗人IgG 抗體最佳使用濃度為3.0 mg/mL，檢測(cè)線(xiàn)T 上包被的巨細(xì)胞病毒重組抗原最佳使用濃度為1.5 mg/mL，對(duì)照線(xiàn)C 上包被的羊抗雞IgY 抗體最佳使用濃度為0.5 mg/mL。NC 膜制備完成后在37 ℃下干燥2 h 備用。

圖4 改良試紙條NC 膜俯視圖

1.6 試劑條的組裝

將樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水紙順次相互搭接粘貼在聚底板上，切割寬度為每條0.4 cm，裝入有干燥劑的鋁箔袋中密封保存。試紙條實(shí)物圖如圖5 所示。

圖5 試紙條實(shí)物圖

1.7 檢測(cè)方法及結(jié)果讀取

檢測(cè)時(shí)，取血清/血漿樣本10 μL 或全血樣本20 μL 加在試紙條的樣品墊上，隨后在樣品墊上滴加2 滴樣本稀釋液，靜置15～20 min 觀察結(jié)果。若對(duì)照線(xiàn)C 和檢測(cè)線(xiàn)T 處均出現(xiàn)紅色條帶，表明樣本巨細(xì)胞病毒IgM 為陽(yáng)性；若只有對(duì)照線(xiàn)C 處出現(xiàn)紅色條帶，檢測(cè)結(jié)果為陰性；若對(duì)照線(xiàn)C 處未出現(xiàn)紅色條帶，則說(shuō)明該試紙條失效。

2 試紙條的性能評(píng)價(jià)

2.1 材料與儀器

巨細(xì)胞病毒IgM 抗體國(guó)家參考品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，巨細(xì)胞病毒IgM 抗體檢測(cè)試劑盒（ELISA 法）為某試劑廠家上市產(chǎn)品；樣本來(lái)自福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院及本公司員工體檢樣本；酶標(biāo)儀購(gòu)自深圳匯松科技發(fā)展有限公司。

2.2 方法

2.2.1 干擾IgG 抗體的消除

選取3 份效價(jià)分別為1∶320、1∶640、1∶1 280 的巨細(xì)胞病毒IgG 抗體陽(yáng)性且IgM 陰性樣本（編號(hào)G1～G3）。選取5 份巨細(xì)胞病毒IgM 抗體強(qiáng)陽(yáng)性且IgG陰性樣本（編號(hào)M1～M5），分別用健康人陰性血清稀釋為巨細(xì)胞病毒IgM 抗體弱陽(yáng)性樣本（編號(hào)M1#～M5#）作為對(duì)照組，稀釋比例分別為1∶400、1∶128、1∶128、1∶256、1∶200。若IgG 抗體有干擾，其對(duì)弱陽(yáng)血清影響較大，可導(dǎo)致假陰性。將M1～M5 號(hào)樣本分別用G1～G3號(hào)樣本按1∶400、1∶128、1∶128、1∶256、1∶200 比例進(jìn)行稀釋?zhuān)玫降?5 份樣本編號(hào)為MG1～MG15，作為實(shí)驗(yàn)組。用制備的設(shè)有攔截線(xiàn)的改良試紙條和無(wú)攔截線(xiàn)的傳統(tǒng)試紙條分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本。

2.2.2 準(zhǔn)確度、最低檢出限及重復(fù)性

用巨細(xì)胞病毒IgM 抗體國(guó)家參考品檢驗(yàn)制備的改良試紙條的準(zhǔn)確度、最低檢出限及重復(fù)性。其中國(guó)家參考品包括5 份陽(yáng)性參考品（P1～P5）、9 份陰性參考品（N1～N9）、6 份檢出限參考品（S1～S6）及1 份重復(fù)性參考品。

2.2.3 交叉反應(yīng)

將10 種相近病原體強(qiáng)陽(yáng)性樣本[弓形蟲(chóng)IgM 抗體（TOX-IgM）、風(fēng)疹病毒IgM 抗體（RV-IgM）、單純皰疹病毒Ⅰ型IgM 抗體（HSV-Ⅰ-IgM）、單純皰疹病毒Ⅱ型IgM 抗體（HSV-Ⅱ-IgM）、肺炎支原體IgM 抗體（MP-IgM）、副流感病毒IgM 抗體（PIV-IgM）、水痘-帶狀皰疹病毒IgM 抗體（VZV-IgM）、甲型肝炎病毒IgM 抗體（HAV-IgM）、細(xì)小病毒B19 IgM 抗體（PVB19-IgM）、巨細(xì)胞病毒IgG 抗體（CMV-IgG）]作為交叉物，用制備的改良試紙條進(jìn)行檢測(cè)，研究其交叉反應(yīng)。

2.2.4 臨床評(píng)價(jià)

用制備的傳統(tǒng)試紙條、改良試紙條和ELISA 試劑盒分別對(duì)收集的620 份血清同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)試紙條的性能指標(biāo)及臨床應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)定性檢測(cè)體外診斷試劑的一般臨床試驗(yàn)方案[11]，評(píng)價(jià)的主要性能指標(biāo)為敏感度、特異度、總符合率、總符合率95%的置信區(qū)間、Kappa 值和約登指數(shù)等。其中Kappa 值評(píng)估的是檢測(cè)結(jié)果之間的一致性，Kappa 值若≥0.75 說(shuō)明一致性較好，二者具有較好的等效性[12]。約登指數(shù)綜合了檢測(cè)結(jié)果的敏感度和特異度信息，值越大，試驗(yàn)方法的真實(shí)性越高[13]。約登指數(shù)＞0.7，試驗(yàn)結(jié)果具有一定的準(zhǔn)確性，而≤0.5時(shí)則沒(méi)有診斷價(jià)值。

2.3 結(jié)果

2.3.1 干擾IgG 抗體的消除

在無(wú)攔截線(xiàn)的傳統(tǒng)試紙條上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的巨細(xì)胞病毒IgG 抗體會(huì)對(duì)巨細(xì)胞病毒IgM 抗體弱陽(yáng)性樣本的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾，使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。而在設(shè)有攔截線(xiàn)的改良試紙條上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的巨細(xì)胞病毒IgG 抗體對(duì)巨細(xì)胞病毒IgM 抗體弱陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果未產(chǎn)生影響，可有效結(jié)合樣本中效價(jià)≤1 280 的巨細(xì)胞病毒IgG 抗體，從而降低樣本中IgG 抗體對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，提高IgM 抗體檢測(cè)的準(zhǔn)確性。詳見(jiàn)表1、2。

表1 對(duì)照組樣本檢測(cè)結(jié)果

表2 實(shí)驗(yàn)組樣本檢測(cè)結(jié)果

2.3.2 準(zhǔn)確度、最低檢出限及重復(fù)性

如圖6 所示，5 份陽(yáng)性參考品均清晰顯示陽(yáng)性結(jié)果，9 份陰性參考品均顯示為陰性結(jié)果，說(shuō)明改良試紙條具有良好的準(zhǔn)確性。當(dāng)檢測(cè)最低檢出限參考品S5 時(shí)，檢測(cè)線(xiàn)仍可顯示清晰。用重復(fù)性參考品重復(fù)檢測(cè)10 次，顯色均一，表明改良試紙條具有較好的重復(fù)性。

圖6 巨細(xì)胞病毒IgM 抗體國(guó)家參考品檢測(cè)結(jié)果

2.3.3 交叉反應(yīng)

如圖7 所示，10 份強(qiáng)陽(yáng)性交叉樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明制備的改良試紙條與弓形蟲(chóng)IgM 抗體（TOX-IgM）、風(fēng)疹病毒IgM 抗體（RV-IgM）、單純皰疹病毒Ⅰ型IgM 抗體（HSV-Ⅰ-IgM）、單純皰疹病毒Ⅱ型IgM 抗體（HSV-Ⅱ-IgM）、肺炎支原體IgM 抗體（MP-IgM）、副流感病毒IgM 抗體（PIV-IgM）、水痘-帶狀皰疹病毒IgM 抗體（VZV-IgM）、甲型肝炎病毒IgM 抗體（HAV-IgM）、細(xì)小病毒B19 IgM 抗體（PVB19-IgM）、巨細(xì)胞病毒IgG 抗體（CMV-IgG）均無(wú)交叉反應(yīng)。

圖7 交叉反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

2.3.4 臨床評(píng)價(jià)

在ELISA 試劑盒檢出的312 份陽(yáng)性樣本中，傳統(tǒng)試紙條檢出陽(yáng)性266 份，陽(yáng)性檢出率為85.3%；改良試紙條檢出陽(yáng)性291 份，陽(yáng)性檢出率為93.3%（見(jiàn)表3），出現(xiàn)假陰性的25 份樣本均確認(rèn)為巨細(xì)胞病毒IgG 抗體強(qiáng)陽(yáng)性。對(duì)陽(yáng)性檢出率結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05，說(shuō)明配對(duì)樣本之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明改良后的試紙條提高了陽(yáng)性檢出率，改善了假陰性問(wèn)題，使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。

表3 傳統(tǒng)試紙條與改良試紙條的陽(yáng)性檢出率比較

分析制備的改良試紙條與ELISA 試劑盒的檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表4）可得出，改良試紙條敏感度為93.3%、特異度為96.8%，與ELISA 試劑盒的總符合率為95.0%，總符合率95%置信區(qū)間為93.0%～96.5%。采用Mc-Nemar 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P=0.071，顯示2 種檢測(cè)方法差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Kappa 值為0.907，表明改良試紙條與ELISA 試劑盒具有較高的一致性。約登指數(shù)為0.909，說(shuō)明試驗(yàn)方法真實(shí)性好、準(zhǔn)確性較高，具有診斷價(jià)值。

表4 改良試紙條與ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果 單位：份

3 討論

巨細(xì)胞病毒感染者大多無(wú)癥狀或僅表現(xiàn)有輕微癥狀，多數(shù)婦女對(duì)此感染了解甚少，常由于忽視而造成不良妊娠后果。因此，加強(qiáng)備孕人群巨細(xì)胞病毒感染篩查，以便早期診斷和治療，對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育具有極其重要的意義。

目前在巨細(xì)胞病毒的檢測(cè)方式中，膠體金免疫層析相比ELISA、化學(xué)發(fā)光和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）等方法可更加快捷地獲得檢測(cè)結(jié)果，對(duì)操作人員、設(shè)備要求較低，非常適合基層對(duì)大批量樣本的現(xiàn)場(chǎng)篩查[14]。王丹等[15]的研究顯示，膠體金免疫層析法檢測(cè)巨細(xì)胞病毒IgG 抗體和IgM 抗體的陽(yáng)性率高于化學(xué)發(fā)光法，可作為巨細(xì)胞病毒感染的篩查方法。

膠體金免疫層析法檢測(cè)一般包括間接法、捕獲法、夾心法等，間接法即檢測(cè)線(xiàn)上包被的為病原體抗原，標(biāo)記膠體金的為抗人IgM 抗體。采用間接法檢測(cè)病原體IgM 抗體時(shí)，樣本中含有的高效價(jià)病原體特異性IgG 抗體會(huì)使得IgG 抗體與IgM 抗體在檢測(cè)線(xiàn)處競(jìng)爭(zhēng)抗原結(jié)合位點(diǎn)而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

本研究針對(duì)目前膠體金免疫層析法檢測(cè)IgM 抗體的缺陷，通過(guò)優(yōu)化膠體金標(biāo)記條件、改良NC 膜結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，制備出改良巨細(xì)胞病毒IgM 抗體檢測(cè)試紙條并對(duì)其性能進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)價(jià)。結(jié)果表明改良試紙條可去除樣本中效價(jià)≤1 280 的干擾IgG 抗體，檢測(cè)國(guó)家參考品的準(zhǔn)確度、最低檢出限及重復(fù)性均符合要求，且對(duì)10 種相近病原體強(qiáng)陽(yáng)性樣本無(wú)交叉反應(yīng)。臨床評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，改良試紙條可有效改善方法學(xué)上的假陰性問(wèn)題，在ELISA 試劑盒檢出的312 份陽(yáng)性樣本中，陽(yáng)性檢出率由傳統(tǒng)試條的85.3%提高至93.3%，檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。由改良試紙條與ELISA 試劑盒臨床檢測(cè)結(jié)果分析比較得出，改良試紙條具有良好的敏感度（93.3%）和特異度（96.8%），且與ELISA 法具有較高的一致性。

本研究的改良方法可為其他病原體IgM 抗體的檢測(cè)提供參考。由于目前檢測(cè)的樣本數(shù)量有限，后期將收集更多的臨床樣本，對(duì)改良試紙條的性能進(jìn)行完善。