葡萄果實(shí)成熟軟化機(jī)制研究進(jìn)展※

●朱紹坤 喬 軍 馬 麗※※

（1.遼寧省果樹(shù)科學(xué)研究所 遼寧 營(yíng)口 115009；2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 遼寧 營(yíng)口 115009）

葡萄屬于典型的非呼吸躍變型果實(shí)[1]。果實(shí)軟化發(fā)生時(shí)間比呼吸躍變型果實(shí)要早，且由于其為漿果，果實(shí)皮薄，汁多，在食用、運(yùn)輸貯存過(guò)程中易發(fā)生破裂、腐爛等問(wèn)題。因此，果實(shí)軟化程度已成為判斷鮮食葡萄果實(shí)新鮮程度的一個(gè)重要指標(biāo)。隨著葡萄果實(shí)成熟軟化，果實(shí)質(zhì)地發(fā)生一系列變化，當(dāng)前研究普遍認(rèn)為果實(shí)成熟軟化是由多種細(xì)胞壁水解酶、調(diào)節(jié)蛋白相互作用引發(fā)的。不同葡萄品種間果實(shí)質(zhì)地存在較大差異，脆肉型品種一直備受關(guān)注，現(xiàn)已成為重要的育種材料及目標(biāo)品種[2]。然而造成不同品種間質(zhì)地差異的機(jī)制還不清楚。因此，了解葡萄果實(shí)成熟軟化調(diào)控機(jī)制，對(duì)于葡萄綜合品質(zhì)改良有著非常重要的意義。本文介紹了葡萄細(xì)胞壁中果膠組成及其分子結(jié)構(gòu)，綜述了葡萄軟化過(guò)程中果膠、纖維素和半纖維素等成分的含量變化，歸納了葡萄果實(shí)軟化時(shí)細(xì)胞壁降解酶基因表達(dá)水平變化，總結(jié)了轉(zhuǎn)錄組和QTL 定位在果實(shí)軟化方面的應(yīng)用進(jìn)展，以期為葡萄新品種選育及保鮮貯運(yùn)研究提供參考。

1 果實(shí)成熟軟化與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組分關(guān)系

軟化是果實(shí)成熟的主要特征之一，直接影響果品的貯運(yùn)品質(zhì)和貨架期，不同樹(shù)種和品種的果實(shí)都需要一定程度的軟化，然而過(guò)度軟化則會(huì)造成采收后腐爛甚至失去商品性[3]。果實(shí)在軟化過(guò)程中，細(xì)胞壁組分和結(jié)構(gòu)發(fā)生了復(fù)雜的變化[4]。肉質(zhì)果實(shí)初生壁主要由35%的果膠、25%的纖維素、20%的半纖維素和10%的結(jié)構(gòu)蛋白組成[5]。從結(jié)構(gòu)上看，纖維素微纖絲構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，果膠、半纖維素和糖蛋白組成的矩陣多糖嵌入在骨架中，各組分間相互聯(lián)系，使細(xì)胞壁成為一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)態(tài)復(fù)合體。果實(shí)在成熟軟化過(guò)程中各組分降解，復(fù)合體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞間隙變大。細(xì)胞壁內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞是導(dǎo)致果實(shí)軟化的直接原因[6]。

1.1 纖維素和半纖維素

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，它通過(guò)纖維素合酶復(fù)合體在細(xì)胞質(zhì)膜上形成，大約2000個(gè)纖維素分子可通過(guò)鏈間氫鍵組成一個(gè)微纖絲，再通過(guò)木糖-纖維素微纖維構(gòu)成細(xì)胞壁的網(wǎng)絡(luò)骨架[7]。半纖維素也是初生壁的主要成分，是由木糖、阿拉伯糖和半乳糖等不同類型單糖以共價(jià)鍵、氫鍵、醚鍵和酯鍵連接構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，各種單糖又形成不同的主鏈和側(cè)鏈。有研究認(rèn)為纖維素與果實(shí)成熟軟化有關(guān)，但并非關(guān)鍵因子，而半纖維素結(jié)構(gòu)變化與果實(shí)軟化密切相關(guān)，是果實(shí)質(zhì)地變化的重要因子[8]。張群等[9]研究發(fā)現(xiàn)葡萄在采后貯藏過(guò)程中的自溶軟化與細(xì)胞壁代謝密切相關(guān)，纖維素和半纖維素含量顯著降低，內(nèi)果皮的超微結(jié)構(gòu)被破壞。

1.2 果膠

果膠是植物細(xì)胞壁的重要組成部分之一，是細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)骨架之間的交聯(lián)物，發(fā)揮著細(xì)胞緩沖的功能。果實(shí)成熟軟化過(guò)程中，果實(shí)中的果膠物質(zhì)由難溶的原果膠降解為可溶性果膠，其形態(tài)、組分發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞間的黏著力下降，果實(shí)質(zhì)地變軟。管雪強(qiáng)等[10]研究發(fā)現(xiàn)葡萄果實(shí)成熟軟化時(shí)，果膠發(fā)生降解，可溶性果膠含量增多，而共價(jià)結(jié)合、離子型果膠含量減少。

2 果實(shí)成熟軟化與細(xì)胞壁降解酶的關(guān)系

果實(shí)細(xì)胞壁是一個(gè)動(dòng)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，果實(shí)在成熟軟化過(guò)程中，細(xì)胞壁水解酶單獨(dú)或與蛋白質(zhì)協(xié)同作用，引發(fā)中性糖損失，木葡聚糖解聚，細(xì)胞壁松弛[4]。參與細(xì)胞壁降解的酶主要包括果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶，研究表明至少有30余種酶參與果實(shí)的成熟軟化過(guò)程。

2.1 果膠甲酯酶

果膠甲酯酶（PME）是植物中廣泛存在的第八類碳水化合物酯酶家族，參與眾多的生理生化活動(dòng)。果膠甲酯酶可去除果膠半乳糖醛酸殘基C-6 酯化基團(tuán)，從而生產(chǎn)帶負(fù)電荷的果膠酸。帶負(fù)電的果膠酸又以2 種形式調(diào)控細(xì)胞壁代謝：第一種形式，細(xì)胞壁中富含Ca2+，果膠酸與Ca2+相互作用，形成果膠鈣，從而改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，抑制其他果膠酶對(duì)其進(jìn)行水解作用；第二種形式，果膠酸不與Ca2+作用，而直接成為PG、PL 酶的作用底物，果膠降解，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變，果實(shí)軟化[11]。近年來(lái)，有關(guān)葡萄果實(shí)軟化與果膠甲酯酶活性及基因表達(dá)關(guān)系已有報(bào)道。Balic 等研究發(fā)現(xiàn)脆肉型葡萄品種“NN107”在果實(shí)發(fā)育P1（轉(zhuǎn)色期）、P2、P3 時(shí)期PME 活性一直處于較高水平，P4（成熟期）迅速降低，軟肉型品種“湯姆遜無(wú)核”在P1-P3 時(shí)期PME 活性逐漸升高，在P4 降低，且脆肉“NN107”中PME 活性一直高于“湯姆遜無(wú)核”中的活性，并結(jié)合2個(gè)品種細(xì)胞壁中鈣含量，推測(cè)脆肉品種中較高的PME 活性有利于增加鈣橋的形成，提高果實(shí)硬度[12]。Deytieuxbelleau 等[13]發(fā)現(xiàn)在“赤霞珠”葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中PME 酶活性與PME 基因表達(dá)不同步，PME 隨著果實(shí)成熟表達(dá)量增加，得出PME 基因可能通過(guò)去甲酯化增加了其他細(xì)胞壁降解酶接觸底物的機(jī)會(huì)，促進(jìn)果實(shí)成熟。

2.2 多聚半乳糖醛酸酶

多聚半乳糖醛酸酶（PG）是第一個(gè)在番茄中利用轉(zhuǎn)基因方法檢測(cè)的水解酶，也是較早被發(fā)現(xiàn)在果實(shí)軟化過(guò)程中對(duì)細(xì)胞壁降解起作用的水解酶[14]。它可以催化斷裂未酯化的果膠主鏈上α-1，4 糖苷鍵，促使果膠降解，果實(shí)軟化。植物PGs 是一個(gè)基因家族，根據(jù)作用方式不同，可分為內(nèi)切PG（endo-PG）和外切PG（exo-PG）。內(nèi)切PG 對(duì)底物的特異性較強(qiáng)，主要表現(xiàn)為隨機(jī)裂解，而外切PG 對(duì)底物的特異性較弱，表現(xiàn)為依次水解聚糖鏈的非還原末端。有關(guān)PG 酶如何調(diào)節(jié)葡萄果實(shí)的成熟軟化過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)軟肉葡萄“湯姆遜無(wú)核”果實(shí)中PG 酶活性隨著果實(shí)成熟逐漸升高，而脆肉果實(shí)PG 酶活性呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，得出PG 活性不同是造成葡萄果實(shí)質(zhì)地差異的重要原因，只是在果實(shí)的軟化過(guò)程中起到一定作用，但PG 基因誘導(dǎo)果實(shí)軟化的機(jī)理還不是很清楚，有待于進(jìn)一步研究[13]。

2.3 果膠裂解酶

果膠裂解酶（PL）是通過(guò)β-反式消除作用切割α-1，4 糖苷鍵，降解去甲酯化的果膠產(chǎn)生寡聚糖，參與果實(shí)成熟軟化過(guò)程[15]。Nunan 等[16]發(fā)現(xiàn)葡萄果實(shí)中編碼PL 酶基因在果實(shí)成熟時(shí)顯著高表達(dá)，參與果膠多糖溶解，促進(jìn)果實(shí)軟化，認(rèn)為PL 基因可能是調(diào)節(jié)果實(shí)成熟軟化的一類重要的候選基因。

2.4 β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（β-Gal）是一類糖苷水解酶，在植物中廣泛存在。主要作用于具有半乳糖殘基支鏈的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖Ⅰ，切除β-D-半乳糖殘基，從而使細(xì)胞壁多糖降解或溶解，果實(shí)軟化[5]。近年來(lái)，研究者已在很多作物上發(fā)現(xiàn)了β-Gal 的同源基因，并對(duì)這些同源基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，β-Gal 表達(dá)模式大致分為四種：第一種，表達(dá)量逐漸升高，果實(shí)成熟時(shí)達(dá)到最高水平；第二種，表達(dá)量在發(fā)育前期較高，開(kāi)始成熟后表達(dá)量下降；第三種，表達(dá)量在果實(shí)整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一直處于較高水平；第四種，表達(dá)量一直處于非常低的水平。目前普遍研究認(rèn)為第一種表達(dá)模式的基因與果實(shí)成熟軟化關(guān)系密切[17]。有關(guān)β-Gal 酶在葡萄果實(shí)成熟軟化作用，研究者得出β-Gal 活性隨著果實(shí)的成熟軟化而增強(qiáng)，活性與葡萄果實(shí)硬度負(fù)相關(guān)，并對(duì)果實(shí)硬度起到了非常重要的作用[18]。

2.5 果實(shí)成熟軟化與擴(kuò)展蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系

植物細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)了一種沒(méi)有水解酶或轉(zhuǎn)糖基酶活性的細(xì)胞壁定位蛋白，擴(kuò)展蛋白（EXP）。前人在壓力松弛試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展蛋白可導(dǎo)致細(xì)胞壁松弛[19]。也有研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展蛋白可以破壞纖維素-半纖維素界面上非共價(jià)鍵，解鎖網(wǎng)絡(luò)，使細(xì)胞壁松弛[20]。Ishimaru 等[21]從“巨峰”葡萄果實(shí)中分離出Vlexp1-3 三種擴(kuò)展蛋白，發(fā)現(xiàn)Vlexp3 在果實(shí)中特異性表達(dá)，且轉(zhuǎn)色期表達(dá)量明顯增加，并推測(cè)Vlexp1-3 基因可以與VXET1 協(xié)同作用，裂解細(xì)胞壁的纖維素-木葡聚糖網(wǎng)絡(luò)，使“巨峰”葡萄果實(shí)在轉(zhuǎn)色期變軟。

近年來(lái)，有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控果實(shí)成熟軟化的研究也日益增多，研究表明LBD[22]，NAC[23]，MADS-box[24]，ERF[25]，bHLH[26]等 轉(zhuǎn) 錄 因 子 都 參與了果實(shí)的成熟軟化過(guò)程。

3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在葡萄果實(shí)成熟軟化研究中的應(yīng)用

RNA-seq 又稱全轉(zhuǎn)錄組鳥(niǎo)槍法測(cè)序，是以高通量測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的，可以便利地從整體水平上獲得基因表達(dá)情況的測(cè)序方法。RNA-seq已經(jīng)成為生命科學(xué)中研究基因表達(dá)水平最常用的方法，現(xiàn)幾乎應(yīng)用于植物科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域[27]。Wong 等[28]以果實(shí)硬度存在差異的“梅鹿輒”果實(shí)為試材，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)17 個(gè)與細(xì)胞壁降解相關(guān)的基因在大果型“梅鹿輒”中較在小果型中顯著高表達(dá)，推測(cè)這可能是造成大果型葡萄的軟化速率高于小果型的主要因素。Balic 等[12]對(duì)“湯姆遜無(wú)核”葡萄不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)的成熟與軟化，細(xì)胞壁降解相關(guān)的基因表達(dá)水平顯著提高，認(rèn)為果實(shí)硬度降低可能與這些基因的高表達(dá)有關(guān)。Wei 等[29]對(duì)“夏黑”及其早熟芽變“天工墨玉”5 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選到多個(gè)可能加速果實(shí)成熟軟化的關(guān)鍵基因。

4 QTL 定位在葡萄果實(shí)成熟軟化及質(zhì)地研究中的應(yīng)用

葡萄果實(shí)成熟軟化后的質(zhì)地是影響果實(shí)品質(zhì)的關(guān)鍵因素，近年來(lái)有關(guān)葡萄果實(shí)質(zhì)地的QTL 定位已有一些報(bào)道，但相對(duì)其他性狀而言，研究進(jìn)展較慢。Carreno 等[30]分別以2 個(gè)分離群體構(gòu)建圖譜，首次定位到與果實(shí)硬度相關(guān)7 個(gè)QTL 位點(diǎn)，分別位于第1，4，5，9，10，13 和18 號(hào)連鎖群上，這些位點(diǎn)中，最高可解釋19?8%的表型變異，所有QTL 位點(diǎn)共解釋44?5%的表型變異。Correa 等[31]以“紅寶石無(wú)核”和“無(wú)核白”雜交的137 株后代構(gòu)建遺傳圖譜，鑒定到2 個(gè)與果實(shí)硬度相關(guān)的QTL 位點(diǎn)，分別位于第8 和第18號(hào)連鎖群上，2 個(gè)QTL 位點(diǎn)共同解釋表型變異的27?6%，置信區(qū)間為10 cM，其中位于LG8 的QTL位 于 標(biāo) 記UDV125 和VMCNG2H2?2 之 間，解 釋表型變異的15?6%，LG18 上的QTL 位于VVIN16標(biāo)記和VVCSIE103N17FMI 標(biāo)記之間，可解釋表型變異的15?6%。Ban 等[32]在第3 和第10 連鎖群上發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)與果實(shí)硬度相關(guān)的QTL 位點(diǎn)，3號(hào)連鎖群的QTL 位于VMC2E7 標(biāo)記附近，解釋表型變異的15?7%，10 號(hào)連鎖群上的QTL 位于標(biāo)記VVIH01 和標(biāo)記UDV073 的中間區(qū)域，解釋表型變異的14?4%，經(jīng)連續(xù)四年鑒定發(fā)現(xiàn)3 號(hào)連鎖群上的QTL 位點(diǎn)比10 號(hào)連鎖群上的位點(diǎn)更加穩(wěn)定。Jiang 等[33]利用區(qū)間作圖法在18 號(hào)連鎖群上鑒定到了3 個(gè)與果實(shí)硬度相關(guān)的QTL 位點(diǎn)，命名為qBF18-2016，qBF18-2017 和qBF18-2018， 分別解釋了22?3%、21?5%和28?6%的表型變異。

5 總結(jié)

葡萄果實(shí)軟化程度是衡量其鮮食品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)也是重要的育種指標(biāo)，然而果實(shí)軟化及不同質(zhì)地形成是個(gè)非常復(fù)雜的生理生化過(guò)程，與細(xì)胞壁組分及細(xì)胞壁降解酶活性密切相關(guān)，是由多基因控制的數(shù)量性狀，不僅受基因型和遺傳因素影響，也與環(huán)境因素密切相關(guān)。在今后研究中，要針對(duì)不同軟化類型果實(shí)進(jìn)行軟化機(jī)制研究，應(yīng)從組學(xué)入手，篩選與果實(shí)成熟軟化及果實(shí)質(zhì)地形成相關(guān)的基因及代謝通路，發(fā)掘相關(guān)的候選基因，開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，為今后葡萄品質(zhì)育種和貯藏保鮮技術(shù)研究提供理論參考。