秋水仙素誘導(dǎo)薄荷染色體加倍技術(shù)研究

王倩，錢榮，溫賽群，齊琳琳，劉靈娣，武玉翠，溫春秀*

（1.河北工程大學(xué)，河北 邯鄲 056038；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/河北省藥用植物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050051）

薄荷（Mentha haplocalyxBriq.）別名蘇薄荷、冰薄荷、野薄荷等，為唇形科薄荷屬多年生草本植物，性涼、味辛，歸肝、肺兩經(jīng)。其以全草入藥，對(duì)治療風(fēng)熱感冒、頭痛目赤、咽喉腫痛等病癥均有較好療效。薄荷主要含有揮發(fā)油、有機(jī)酸類以及黃酮類等成分，其中揮發(fā)油為薄荷的主要藥效成分之一，具有疏散風(fēng)熱、抗炎止痛、抑菌止癢等作用，藥用價(jià)值較高[1～3]。近年來(lái)，野生薄荷已經(jīng)無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，人工栽培的薄荷成為了供給市場(chǎng)需求的主要來(lái)源，隨之出現(xiàn)的品種混雜、產(chǎn)量不高、品質(zhì)下降等問題逐漸暴露出來(lái)，極大地制約著薄荷產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，選育優(yōu)良的薄荷種質(zhì)顯得十分重要。

研究表明，染色體加倍能夠創(chuàng)制出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的新種質(zhì)[4，5]。與二倍體植物相比，多倍體植物在獲得一些優(yōu)勢(shì)性狀的同時(shí)，遺傳方面往往具有更大的可塑性，其生理上具有更強(qiáng)的適應(yīng)性[6]。對(duì)于藥用植物來(lái)說(shuō)，經(jīng)過人工誘變使其染色體加倍，得到多倍體器官呈巨型性、抗逆性增強(qiáng)、有效成分含量升高等特性的植株，正是中藥材優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)育種期望達(dá)到的目的[7]。因此，通過人工誘導(dǎo)進(jìn)行植物多倍體材料的創(chuàng)制及育種已成為當(dāng)前重要的研究方向。而有效的倍性鑒定作為了解植物遺傳背景和進(jìn)一步應(yīng)用于實(shí)際的前提，在育種過程中同樣是至關(guān)重要的。倍性鑒定的準(zhǔn)確性在很大程度上影響著植物新品種的育種效果[8]?；诖耍瑸榱思涌煊N進(jìn)程，本研究以秋水仙素為誘變劑對(duì)薄荷莖段進(jìn)行處理，通過形態(tài)學(xué)和根尖染色體觀察以及流式細(xì)胞分析對(duì)其變異株進(jìn)行倍性鑒定，并對(duì)不同濃度與處理時(shí)間的植株生長(zhǎng)和誘變效果進(jìn)行比較，篩選適宜薄荷染色體加倍的誘導(dǎo)體系，可為薄荷種質(zhì)創(chuàng)新研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，且變異植株經(jīng)進(jìn)一步的培育后有望作為新品種在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用[9～11]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所藥用植物研究中心培育的安徽薄荷組培苗。

儀器主要有SW-CJ-18U 型超凈工作臺(tái)（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、Thermo ST8 ST8R熱電高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)）、Beckman CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國(guó)） 和Olympus BH-2 型顯微鏡（日本）等。

藥劑主要有秋水仙素（C22H25NO6）、乙醇、冰醋酸、改良卡寶品紅染液、鹽酸和DAPI 染色液等。除秋水仙素購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司外，其他試劑均購(gòu)于北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

培養(yǎng)基有再生試管苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基2 種。其中，再生試管苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖20 mg/L+瓊脂6.5 g/L，pH 值5.8。

1.2 試驗(yàn)方法

采用秋水仙素加入培養(yǎng)基的方法，對(duì)帶有腋芽的薄荷莖段進(jìn)行處理，誘導(dǎo)薄荷多倍體的產(chǎn)生；通過形態(tài)學(xué)和根尖染色體觀察以及流式細(xì)胞分析對(duì)其變異株進(jìn)行倍性鑒定，并對(duì)不同濃度與處理時(shí)間的植株誘變效果進(jìn)行比較；對(duì)變異株與親本植株的田間生物學(xué)性狀和揮發(fā)油含量進(jìn)行比較。

1.2.1 變異植株的獲得 在無(wú)菌工作臺(tái)中，將薄荷試管苗莖段（帶有腋芽）分別接到含有不同濃度秋水仙素的MS 培養(yǎng)基上，進(jìn)行不同時(shí)間的暗處理培養(yǎng)；后接種至再生試管苗培養(yǎng)基中，在溫度（25±2）℃、光照12 h/黑暗12 h 的光照培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)薄荷試管苗的產(chǎn)生。試驗(yàn)秋水仙素濃度設(shè)50 mg/L（T1）、100 mg/L（T2）和200 mg/L（T3）3 個(gè)處理，以不添加秋水仙素處理為對(duì)照（CK），每個(gè)處理均接20 個(gè)莖段，3 組重復(fù)；暗處理時(shí)間均設(shè)1、2 和3 d。

接種后，以周期性觀察并記錄莖段或再生苗的生長(zhǎng)狀態(tài)，每15 d 為1 個(gè)記錄周期；第60 天時(shí)統(tǒng)計(jì)再生苗數(shù)量，計(jì)算誘變率。參考趙忠娟等[4]方法，將褐化、未產(chǎn)生再生苗判定為莖段死亡，將葉片明顯較大、顏色較綠的再生苗植株初步判定為變異植株。

1.2.2 變異植株的移栽 將變異植株和CK 植株從組培瓶中取出，先用流水沖洗干凈，再用0.1%多菌靈浸泡滅菌，之后移栽到事先用高錳酸鉀溶液消毒過的蛭石中，編號(hào)并覆膜，在常溫條件下通風(fēng)培養(yǎng)。

1.2.3 流式細(xì)胞檢測(cè)分析 取適量葉片置于培養(yǎng)皿中，加提取緩沖液1.5～2.0 mL，用刀片將其切碎，以便提取出完整細(xì)胞核。使用濾網(wǎng)過濾至新的離心管中，1 000 r/min 離心3 min，倒出提取液后，向試管中加入50 μL 染液，避光染色1 min，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)植株倍性，熒光通道選擇PB450-A。

1.2.4 根尖染色體數(shù)目鑒定 8：00～11：00 取薄荷1 cm 左右的幼根放入冰水混合物中，4 ℃條件下預(yù)處理24 h，蒸餾水清洗過后用卡諾固定液〔V（95%乙醇） ∶V（冰醋酸） =3 ∶1〕處理24 h（不超過24 h），轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存。60 ℃下用1 mol/L 的鹽酸解離4 min，用蒸餾水將其沖洗后使用改良卡寶品紅染液進(jìn)行染色，壓片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 移入田間多倍體植株的生物學(xué)性狀調(diào)查 多倍體植株和CK 植株移栽成活后，將其移入試驗(yàn)田，在相同條件進(jìn)行培養(yǎng)。達(dá)到采收標(biāo)準(zhǔn)后，觀察變異植株與親本植株葉片及植株長(zhǎng)勢(shì)形態(tài)方面的差異。每個(gè)處理隨機(jī)選取3 株，用尺子測(cè)量葉長(zhǎng)、葉寬和株高等，并采用常規(guī)方法測(cè)定植株的鮮重和干重。

1.2.6 移入田間多倍體植株的揮發(fā)油含量測(cè)定 將移入田間的多倍體植株和CK 植株的地上部分采收，陰干后切成段，用粉碎機(jī)粉碎成顆粒均勻細(xì)膩的粉末。取供試品適量，采用揮發(fā)油測(cè)定裝置測(cè)定薄荷揮發(fā)油含量，計(jì)算供試品的揮發(fā)油含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office Excel（2003）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理對(duì)薄荷莖段的誘導(dǎo)效果

秋水仙素的處理濃度和處理時(shí)間均對(duì)薄荷莖段的存活與突變具有較大影響（表1）。試驗(yàn)濃度秋水仙素處理的薄荷莖段均可成活，但觀察發(fā)現(xiàn)，其誘導(dǎo)出的再生苗生長(zhǎng)緩慢，且部分莖段出現(xiàn)了不同程度的褐化、死亡現(xiàn)象；而對(duì)照莖段的再生苗長(zhǎng)勢(shì)良好，成活率較高。

隨著秋水仙素處理濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，再生苗誘導(dǎo)數(shù)量趨于下降，莖段褐化現(xiàn)象加重，甚至失去生活力。處理時(shí)間為1 d 和2 d 時(shí)，誘變效果較好，成活的再生苗中均出現(xiàn)了一些突變株，誘變率最高可達(dá)33%。處理時(shí)間為3 d 時(shí)，各濃度處理下誘導(dǎo)產(chǎn)生的再生苗株數(shù)相對(duì)較少，且誘變率均為0。對(duì)莖段的誘導(dǎo)以及再生苗的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行綜合分析，認(rèn)為T21處理（秋水仙素處理濃度100 mg/L、處理時(shí)間1 d）效果最好。該處理下，薄荷莖段成活數(shù)量較多、突變數(shù)最多，誘變率最高，達(dá)到了33%。

2.2 秋水仙素誘導(dǎo)薄荷的倍性鑒定

2.2.1 組培苗形態(tài)學(xué)觀察 利用裸眼觀察法對(duì)相同組培條件下由秋水仙素誘導(dǎo)產(chǎn)生的再生苗與CK 再生苗的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行比較，結(jié)果（圖1）顯示，二者在形態(tài)上出現(xiàn)了顯著變化，由秋水仙素誘導(dǎo)產(chǎn)生的再生植株總體表現(xiàn)為葉片變大且肥厚、顏色濃綠、鋸齒較深、莖稈粗壯等，符合多倍體特性，但生長(zhǎng)速度明顯降低。

圖1 變異植株與親本植株（CK）的生長(zhǎng)狀態(tài)比較Fig.1 Comparison of growth status between variant plants and parent plants（CK）

2.2.2 流式細(xì)胞檢測(cè)及根尖染色體鑒定 利用流式細(xì)胞儀對(duì)初步鑒定的變異植株和親本植株（CK） 進(jìn)行染色體倍性鑒定，結(jié)果（圖2）顯示，CK 植株的二倍體峰值處于65×104道附近；變異植株T11-3-2、T22-1-4 和T32-1-1 的四倍體峰值處于130×104道左右，約為對(duì)照的2 倍?？梢钥闯?，峰值出現(xiàn)與染色體倍性關(guān)系準(zhǔn)確。

利用染色壓片法對(duì)變異植株和親本植株（CK）進(jìn)行根尖染色體鑒定，結(jié)果（圖3）顯示，變異植株的根尖染色體數(shù)量明顯多于CK。根尖染色體法的多倍體鑒定結(jié)果與流式細(xì)胞檢測(cè)法的多倍體鑒定結(jié)果一致。

圖3 薄荷變異植株與親本植株（CK）的根尖染色體比較Fig.3 Comparison of root tip chromosomes between variant plants and parent plants（CK）of peppermint

2.3 多倍體植株的田間生物學(xué)性狀和揮發(fā)油含量

2.3.1 田間生物學(xué)性狀 采收期的調(diào)查結(jié)果（表2）顯示，各多倍體植株的田間生物學(xué)性狀均與親本植株（CK）具有明顯差異。多倍體植株中，株高除T11-3-1 略＞CK外，其他植株均明顯＜CK；分枝數(shù)除T21-1-4＞CK 外，其他植株均＜CK，但所有植株與CK 差異均不顯著；葉片厚度均＞CK，且除T11-3-1 外，其他植株與CK 差異均達(dá)到了顯著水平；植株鮮重和干重均顯著＜CK；葉片長(zhǎng)度和寬度除T23-3-1、T11-2-2、T22-1-4 和T21-1-4＞CK 外，其他植株均＜CK。裸眼觀察也發(fā)現(xiàn)，與CK 植株相比，多倍體植株在田間普遍表現(xiàn)為葉厚、生長(zhǎng)緩慢（圖4）。

圖4 多倍體植株與親本植株（CK）的田間形態(tài)比較Fig.4 Comparison of field morphology between polyploid plants and parent plants（CK）

表2 采收期多倍體植株與親本植株（CK）的田間生物學(xué)性狀比較Table 2 Comparison of field biological traits between polyploid plants and parent plants（CK）at harvest time

2.3.2 揮發(fā)油含量 《中國(guó)藥典》2020 版規(guī)定薄荷藥材的揮發(fā)油含量不得少于0.80%。測(cè)定結(jié)果（圖5）顯示，親本植株（CK）的揮發(fā)油含量為1.12%；多倍體植株的揮發(fā)油含量為0.77%～2.21%，有8 個(gè)植株的揮發(fā)油含量＞CK，其中T11-3-1 的揮發(fā)油含量最高，為親本植株的1.97 倍。有2 個(gè)多倍體植株的揮發(fā)油含量＜CK，其中T32-1-1 的揮發(fā)油含量（0.87%）最低，但其揮發(fā)測(cè)量油含量也達(dá)到了藥典標(biāo)準(zhǔn)?？梢钥闯觯啾扼w植株的揮發(fā)油含量普遍高于親本植株。

圖5 采收期多倍體植株與與親本植株（CK）的揮發(fā)油含量比較Fig.5 Comparison of volatile oil content between polyploid plants and parent plants（CK） at harvest time

3 結(jié)論與討論

多倍體是植物存在于自然界的一種普遍現(xiàn)象，能夠使植物以跳躍的方式改變其外觀形態(tài)和生理指標(biāo)，同時(shí)發(fā)生染色體加倍，快速產(chǎn)生新的種質(zhì)資源[12～14]。目前在多倍體植物資源創(chuàng)新中，利用秋水仙素誘導(dǎo)是應(yīng)用較廣泛且有效的手段之一。但高濃度的秋水仙素容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，使植株難以恢復(fù)分裂能力，甚至死亡[15]。周玉麗[16]研究顯示，用濃度為0.3%的秋水仙素處理連翹幼苗，變異率相對(duì)較高，但成活率較低；當(dāng)濃度調(diào)節(jié)至0.2%并處理72 h 后，誘導(dǎo)效果最為理想，變異率高達(dá)58.3%。施和平等[17]研究顯示，用0.05%的秋水仙素處理廣藿香毛狀根36 h，誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)率可達(dá)40%；延長(zhǎng)處理時(shí)間并增大秋水仙素濃度后，誘導(dǎo)率趨于下降。因此，選擇適宜的誘變材料，以及把握合適的秋水仙素濃度和處理時(shí)間至關(guān)重要。本研究中，以不同濃度的秋水仙素為誘變劑，對(duì)帶有腋芽的薄荷試管苗莖段進(jìn)行誘變處理，結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加秋水仙素誘導(dǎo)薄荷產(chǎn)生多倍體植株的方法是可行的，且誘導(dǎo)效果明顯，通過流式細(xì)胞檢測(cè)、根尖染色體數(shù)目觀察等方法共鑒定出多倍體植株10 個(gè)；同時(shí)，在多個(gè)梯度條件下篩選得到秋水仙素誘導(dǎo)薄荷染色體加倍的最適體系為秋水仙素處理濃度100 mg/L、處理時(shí)間1 d。

在薄荷染色體加倍的研究中，趙忠娟等[4]發(fā)現(xiàn)通過秋水仙素誘導(dǎo)的椒樣薄荷，其變異植株較親本植株長(zhǎng)勢(shì)快，株高明顯高于親本植株。于盱等[18]則認(rèn)為不同品種在染色體加倍后變異現(xiàn)象和生長(zhǎng)速度存在一定的差異，在相同組培條件下68-7 薄荷的染色體加倍植株與正常植株相比長(zhǎng)勢(shì)緩慢，但73-8 和滬-39 薄荷的染色體加倍后植株生長(zhǎng)速度與其正常植株相比無(wú)明顯變化。本研究結(jié)果顯示，薄荷誘導(dǎo)染色體加倍后的植株，無(wú)論是在形態(tài)特征方面還是在生理特征和揮發(fā)油含量等方面均與親本植株存在不同程度的差別，主要表現(xiàn)為葉片變得肥大且厚、莖稈變粗、鋸齒相對(duì)更深，但生長(zhǎng)速度緩慢；多數(shù)變異植株的揮發(fā)油含量高于親本植株，最高含量可達(dá)2.21%，為親本植株（1.12%）的1.97 倍。后期將采用其他誘變手段，在誘變劑的選擇、濃度及時(shí)間的處理上進(jìn)行更多嘗試，探索能夠更直觀反映基因水平變異的快速、有效檢測(cè)評(píng)價(jià)技術(shù)[19]，以期在強(qiáng)化誘變效果的同時(shí)，為多倍體鑒定技術(shù)的進(jìn)步提供強(qiáng)有力的支撐，這對(duì)加快我國(guó)藥用植物新品種的開發(fā)以及優(yōu)良品種的篩選起到重要作用[20]。