草地早熟禾蛋白激酶CIPK32基因克隆及非生物脅迫響應(yīng)分析

陳 陽,王 琦,高巖松,尤 學(xué),熊 毅,金一鋒

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蛋白激酶(Protein kinase)具有添加磷酸基調(diào)節(jié)靶蛋白的活性定位、蛋白-蛋白相互作用等特性,其在植物對逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[1]。蔗糖非發(fā)酵1(SNF1)蛋白激酶(SnRK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類,包含3個家族:SnRK1、SnRK2和SnRK3,該蛋白的磷酸化途徑在被激活的條件下調(diào)節(jié)下游基因表達,從而調(diào)節(jié)不同的應(yīng)激反應(yīng)和生理過程[2]。其中,植物SnRK3激酶亞家族中的結(jié)構(gòu)包含N端激酶區(qū)和C端調(diào)控區(qū),可與鈣傳感器鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶B樣蛋白(CBL)相互作用,形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),介導(dǎo)鈣信號和一系列復(fù)雜的環(huán)境刺激[3-5],所以,SnRK3又被稱為CIPK(Calcineurin B-like protein interacting protein kinase)。研究發(fā)現(xiàn),CIPK家族基因參與多種應(yīng)對非生物脅迫(環(huán)境脅迫、營養(yǎng)缺乏和植物激素)、ROS信號傳導(dǎo)以及植物生長發(fā)育相關(guān)的過程[6-8]。

Kanwar等[9]研究發(fā)現(xiàn),水稻(OryzasativaL.)OsCIPK31和OsCIPK32等多個CIPK成員在干旱處理中轉(zhuǎn)錄上調(diào)。過表達水稻OsCIPK3、OsCIPK12和OsCIPK15可增強幼苗期的耐寒性、耐旱性和耐鹽性[9]。過表達玉米(ZeamaysL.)ZmCIPK8提高了植株的耐旱性[10]。大麥(HordeumvulgareL.)HbCIPK2會通過維持K+/Na+穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)耐鹽性[11]。Hu等[12]研究發(fā)現(xiàn),CIPK8在低氮脅迫下的硝酸鹽低親和力反應(yīng)中起著積極調(diào)節(jié)作用。油菜(BrassicanapusL.)BnCIPK6可參與植物對低磷脅迫的反應(yīng),在低磷條件下,油菜BnCIPK6的表達上調(diào),過表達BnCIPK6的擬南芥(Arabidopsisthaliana)表現(xiàn)出比野生型更多的生物量積累[13]。研究發(fā)現(xiàn),擬南芥AtCIPK26的過度表達增加了發(fā)芽種子對ABA抑制作用的敏感性[14]。CIPK9和CIPK23也與低K+應(yīng)激有關(guān),CIPK9和CBL3的過表達表現(xiàn)出類似的低K+敏感性表型[13]。綜上可見,CIPK基因家族對生物應(yīng)對非生物脅迫有重要作用。

草地早熟禾(PoapratensisL.)屬于禾本科多年生草本,具有質(zhì)地纖細、觀賞性良好、成坪速度較快、抗寒性強等優(yōu)良性狀,可用于綠地、公園以及園林綠化中。但是在面對非生物脅迫時,經(jīng)常會造成植株出苗難、生長慢、綠期短、秋季早衰甚至死亡等現(xiàn)象的發(fā)生[15-17]。因此,在草坪草應(yīng)用領(lǐng)域中應(yīng)注重提高草地早熟禾抗逆境脅迫能力,對草地早熟禾抗逆境脅迫基因的研究也至關(guān)重要。本研究擬克隆獲得草地早熟禾CIPK32基因,并進行生物信息學(xué)分析。利用實時熒光定量PCR檢測CIPK32基因不同組織及干旱、鹽、氮素和磷素脅迫下的表達模式。本研究結(jié)果不僅有助于理解CIPK32基因的結(jié)構(gòu)特征,也為進一步探索CIPK32基因在逆境脅迫應(yīng)答等過程中的作用機制提供了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理方法

草地早熟禾午夜Ⅱ號為供試材料,將種子均勻的播撒在營養(yǎng)土內(nèi),放置于光照培養(yǎng)箱中等待萌發(fā),培養(yǎng)條件為:白天/夜晚溫度25 ℃/15 ℃,相對濕度60%,光/暗為14 h/10 h,光照強度600 μmol/(m2·s),培育3個月后進行非生物脅迫處理。

選擇生長健康、長勢一致的草地早熟禾植株,將根部清洗干凈,轉(zhuǎn)移至1/2 Hoagland水培液中進行預(yù)培養(yǎng),培養(yǎng)15 d后,進行不同脅迫處理。處理方式為:對1/2 Hoagland水培液中生長14 d的草地早熟禾植株分別進行10% PEG6000模擬干旱處理、鹽處理(0,30,100,200 mmol/L NaCl)、氮處理(0,1.5,15.0 mmol/L NaNO3)、磷處理(0,0.1,1.0 mmol/L KH2PO4),配置3種不同濃度的NaNO3、KH2PO4溶液分別作為氮源、磷源。每3個處理作為一個生物學(xué)重復(fù),處理21 d后取樣,取根、莖、葉后迅速置于液氮中保存。

1.2 CIPK32基因克隆

利用BioXM2.7.1軟件設(shè)計CIPK32基因克隆引物,上游引物CIPK32-F:5′-CCAGAGGGGGAATAAGGCAG-3′,下游引物CIPK32-R:5′-CCTTCTTAGCAGCGATTTGG-3′。以草地早熟禾葉片提取的RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,通過PCR得到CIPK32基因的序列。PCR反應(yīng)總體系為25 μL,在PCR中加入12.5 μL的2×Es Taq MasterMix,1 μL cDNA,1 μLCIPK32-F/R,9.5 μL ddH2O。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳處理,找出相應(yīng)的基因產(chǎn)物,然后將PCR產(chǎn)物的測序送往上海生工來完成。

1.3 CIPK32基因生物信息學(xué)分析

通過SWISS-MODEL、NCBI-CDD、TMpred、SignaIP 4.1、Netphos、PSORT等在線軟件對編碼氨基酸序列進行蛋白結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)功能域、跨膜區(qū)域、信號肽、磷酸化位點、亞細胞定位進行預(yù)測分析;應(yīng)用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進化樹;采用ClustalW對CIPK32編碼氨基酸進行同源比對等。

1.4 草地早熟禾CIPK32基因?qū)Σ煌M織及不同逆境響應(yīng)分析

根據(jù)試劑盒提取生長期為3個月的草地早熟禾植株根、莖、葉3個部位的RNA,之后用于qRT-PCR測定草地早熟禾CIPK32基因在不同組織部位的相對表達量。提取經(jīng)過PEG6000、NaCl、N、P脅迫樣本的葉部RNA,用于qRT-PCR測定草地早熟禾CIPK32基因在逆境響應(yīng)過程中的相對表達量。qRT-PCR采用相對定量分析,UBQ為內(nèi)參基因[18],利用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒,總體系為50 μL。qRT-PCR程序為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地早熟禾CIPK32基因的克隆

采用設(shè)計的特異性引物CIPK32-F/R(表1)和草地早熟禾cDNA為模板,利用RT-PCR技術(shù)進行擴增,獲得1 354 bp的目的條帶(圖1)。測序結(jié)果顯示,CIPK32基因序列含有的ORF為1 320 bp,共編碼439個氨基酸,與預(yù)測結(jié)果一致。

M.DL2000.

表1 基因克隆及熒光定量所需引物

2.2 生物信息學(xué)分析

用ProtPrarm對CIPK32蛋白進行理化性質(zhì)分析,結(jié)果顯示,CIPK32相對分子質(zhì)量50.28 ku,等電點為6.82,蛋白質(zhì)分子式為C2249H3574N608O665S16,為不穩(wěn)定蛋白。在CIPK32蛋白中亮氨酸(Leu)成分含量最高,為10.3%。氨基酸殘基中具有正/負(fù)電荷的殘基Asp+Glu、Arg+Lys,分別為68,67個,平均親水系數(shù)為-0.463,為親水性蛋白(表2)。亞細胞定位預(yù)測顯示,CIPK32蛋白定位于細胞質(zhì)中。利用Netphos對磷酸化位點進行預(yù)測分析,結(jié)果表明,草地早熟禾CIPK32氨基酸磷酸化位點包含:絲氨酸14個,蘇氨酸18個,酪氨酸4個(圖2)。

圖2 草地早熟禾CIPK32蛋白的磷酸化位點

表2 草地早熟禾CIPK32編碼氨基酸組成

NCBI在線分析分析結(jié)果表明,CIPK32蛋白包含典型的結(jié)構(gòu)域STKc_SnRK3和CIPK_C(圖3)。用MEGA 7.0對多物種CIPK編碼氨基酸進行進化樹分析,發(fā)現(xiàn)草地早熟禾CIPK32編碼氨基酸與山羊草(Aegilopstauschii)CIPK32(XP_020198391.1)、黑麥草(Loliumrigidum)CIPK32(XP_047091407.1)、大麥CIPK32(XP_044980943.1)編碼氨基酸同源性較高,分別為95.90%,95.90%,95.67%(圖4)。通過MEME,將草地早熟禾CIPK32保守序列區(qū)域分析MEME設(shè)定為12個保守的基序,可以看出,草地早熟禾與大麥、黑麥草、小麥(TriticumaestivumL.)等禾本科植物CIPK32蛋白結(jié)構(gòu)域非常相似。將草地早熟禾CIPK32與山羊草、黑麥草、大麥、小麥CIPK32氨基酸序列進行多序列比較,發(fā)現(xiàn)其含有酰胺化位點、N-糖基化位點、N-肉豆蔻?；稽c、蛋白激酶C磷酸化位點、CBL作用位點、PP2C等結(jié)合位點(圖5)。

圖3 草地早熟禾CIPK32的CDD結(jié)構(gòu)域

圖4 草地早熟禾CIPK32氨基酸序列的進化樹及MEME分析

①.酰胺化位點;②.N-糖基化位點;③.亮氨酸拉鏈圖案;④.N-肉豆蔻?；稽c;⑤.cAMP-cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點;⑥.CBL作用位點;⑦.PP2C結(jié)合位點;+.酪氨酸激酶磷酸化位點;=.蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)信號;#.絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點信號;紅線.酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點;藍線.蛋白激酶C磷酸化位點。

應(yīng)用SOPMA軟件對CIPK32蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測,發(fā)現(xiàn)CIPK32的二級結(jié)構(gòu)包括:α-螺旋、不規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈,占比分別為39.64%,32.80%,10.93%,16.63%。通過SWISS-MODEL在線分析,發(fā)現(xiàn)CIPK32蛋白三級結(jié)構(gòu)的組成與蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果一致(圖6)。

2.3 草地早熟禾CIPK32基因在非生物脅迫下的表達模式

2.3.1 草地早熟禾CIPK32基因組織特異性 從圖7可以看出,草地早熟禾CIPK32基因的表達水平在組織部位中存在著顯著性差異,其中葉部表達量最高,根部表達量最低。

2.3.2 非生物脅迫對草地早熟禾CIPK32基因表達水平的影響 本研究測定了10% PEG6000模擬干旱不同時間段的草地早熟禾CIPK32基因表達水平。從圖8-A中可以看出,隨著干旱時間的增加,草地早熟禾CIPK32基因相對表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,16 h的相對表達量最高,是0 h的6.2倍,而24 h的相對表達量比16 h降低了43.97%。由圖8-B可以看出,草地早熟禾CIPK32基因表達水平隨NaCl濃度的升高呈上調(diào)的趨勢,200 mmol/L NaCl是0 mmol/L NaCl的6.9倍,可見,鹽脅迫促進該基因的表達。圖8-C中可見,NaNO3處理顯著影響CIPK32基因的表達水平,0 mmol/L NaNO3>15.0 mmol/L NaNO3>15.0 mmol/L NaNO3,無氮或低氮環(huán)境均促進該基因的表達。圖8-D中可見,隨著KH2PO4濃度的增加,草地早熟禾CIPK32基因的表達呈先上升后下降的趨勢,相對表達量為:0.1 mmol/L KH2PO4>0 mmol/L KH2PO4>1.0 mmol/L KH2PO4,低磷處理(0.1 mmol/L KH2PO4)更有利于其表達。綜上,干旱、鹽、氮素或磷素脅迫均顯著影響草地早熟禾CIPK32基因的表達。

3 結(jié)論與討論

蔗糖非發(fā)酵1(SNF1)相關(guān)蛋白激酶(SnRKs)通過激活蛋白磷酸化途徑在應(yīng)對非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[15]。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和序列相似性,這些基因在植物中分為3個亞科:SnRK1、SnRK2和SnRK3。研究發(fā)現(xiàn),擬南芥含有3個AtSnRK1、10個AtSnRK2、26個AtSnRK3基因[19],水稻中含有50個SnRK基因,其中4個OsSnRK1、11個OsSnRK2和35個OsSnRK3,大麥HvSnRK基因家族3個亞科中最多樣化的一組。SnRK1s成員的特征是存在N末端蛋白激酶(Pkinase)結(jié)構(gòu)域、泛素相關(guān)(UBA)結(jié)構(gòu)域和激酶相關(guān)1(KA1)結(jié)構(gòu)域。SnRK2s成員含有一個N端激酶域和另一個C端調(diào)節(jié)域。SnRK3s成員又被稱為CIPK,結(jié)構(gòu)上包括N-末端的激酶結(jié)構(gòu)域和C-末端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域,其含有保守NAF(Asn-Ala-Phe)結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是自調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域并且含有能夠與2C型蛋白質(zhì)磷酸酶(PP2C)相互作用的PPI結(jié)構(gòu)域[4]。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)水稻、棉花(GossypiumhirsutumL.)、木薯(Manihotesculenta)等CIPK成員含有NAF結(jié)構(gòu)域和PPI結(jié)構(gòu)域[20-21]。本研究中,草地早熟禾CIPK32包含N-末端的激酶結(jié)構(gòu)域STKc_SnRK3和CBL相互作用蛋白激酶的C端調(diào)節(jié)域(CIPK_C),其中312—314aa為NAF(Asn-Ala-Phe)結(jié)構(gòu)域。

研究發(fā)現(xiàn),水稻OsCIPK基因(OsCIPK11、OsCIPK14、OsCIPK18、OsCIPK20和OsCIPK24)穗期差異表達中上調(diào),在種子期表達量較低[9]。研究發(fā)現(xiàn),小麥GzCIPK19在葉中表達量高于根、莖和籽粒[22]。甜瓜(CucumismeloL.)CmCIPKs(CmCIPK3、CmCIPK8、CmCIPK9、CmCIPK24等)在各組織中表達水平都很高,CmCIPK20僅在葉中表達[23]。大豆(GlycinemaxL.)GmCIPK6、GmCIPK34和GmCIPK15在葉部和花部中表達較高[24]。陳小晶等[25]研究發(fā)現(xiàn),玉米ZmCIPK32在授粉后葉部的表達量顯著高于冠根和根尖。煙草(NicotianatabacumL.)NtCIPK3的表達量排序為葉>莖>根>花[26]。這與本研究結(jié)果相似,草地早熟禾葉部CIPK32相對表達量顯著高于根部與莖部。

隨著多個物種中全基因組數(shù)據(jù)的公布,CIPK家族成員進行了分析與功能鑒定,例如,水稻[9]、棉花[20]、葡萄(VitisviniferaL.)[27]、白梨(Pyrusbretschneideri)[28]、茄子(SolanummelongenaL.)[29]、小麥[30]、大豆[31]等植物。研究發(fā)現(xiàn),棉花GhCIPK6的過度表達增加了轉(zhuǎn)基因擬南芥中對鹽、干旱和激素脅迫的抗逆境能力[32]。例如在干旱條件下,GhCIPK在葉片和根部均上調(diào),在干旱處理12 h后高表達[20]。大豆GmCIPK2基因在葉部、莖部相對表達量較高[31]。干旱處理促進甘蔗ScCIPK1的表達,響應(yīng)NaCl脅迫,ABA脅迫下ScCIPK21在3,6 h的表達上調(diào)[33]。Wang等[34]發(fā)現(xiàn),小麥TaCIPK27的過表達可以增加轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱的耐受性,但降低了對ABA處理的敏感性。在擬南芥中,AtCIPK3的表達水平在幼苗的早期發(fā)育階段增強,并且AtCIPK3突變體在種子萌發(fā)期間在脫落酸(ABA)脅迫下表現(xiàn)出高度敏感性[35]。而二穗短柄草(BrachypodiumdistachyonL.)BdCIPK31基因表達受到ABA的顯著抑制,并參與ABA信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),超表達BdCIPK31基因還能夠降低鹽脅迫導(dǎo)致的根部K+流失[36]。

研究發(fā)現(xiàn),在水稻OsCIPK基因家族中,OsCIPK6、OsCIPK16、OsCIPK17、OsCIPK19、OsCIPK25和OsCIPK29在干旱脅迫和鹽脅迫中上調(diào)[9]。鹽(NaCl:200 mmol/L)和干旱脅迫(PEG:10%)處理促進葡萄VvCIPK基因家族中VvCIPK3、VvCIPK24和VvCIPK39基因的上調(diào)[27]。黃石連[37]發(fā)現(xiàn),狗牙根(Cynodonspp.)CdCIPK5可能參與調(diào)控植物多種信號途徑,過表達CdCIPK5可以提高水稻對鹽脅迫的耐性。二穗短柄草BdCIPK31基因也在調(diào)節(jié)植物對干旱和鹽脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮作用。干旱脅迫抑制BdCIPK31基因的表達,200 mmol/L NaCl水培處理對BdCIPK31基因的表達有促進作用[38]。這與本研究結(jié)果相似,干旱脅迫及NaCl脅迫顯著地提升草地早熟禾CIPK32基因的表達水平。這可能因為二穗短柄草CIPK31與CIPK32在同一個進化樹分支且距離較近,而草地早熟禾CIPK32與二穗短柄草CIPK32高度同源,其功能相似。研究發(fā)現(xiàn),CIPK8不僅參與硝酸鹽調(diào)控的快速轉(zhuǎn)錄控制,還參與硝酸鹽長期調(diào)控的根系生長[12]。本研究中,CIPK32積極響應(yīng)低氮或低磷處理,但是其功能還需進一步驗證。綜上所述,CIPK基因家族在非生物脅迫中具有潛在的作用,尤其是在干旱、鹽脅迫下積極響應(yīng)表達。

本研究克隆草地早熟禾CIPK32基因并對其進行表達模式分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),草地早熟禾CIPK32基因表達具有組織特異性,并能夠積極響應(yīng)非生物脅迫。綜上,該基因可能參與調(diào)控草地早熟禾多種非生物脅迫過程。這為后續(xù)挖掘草地早熟禾CIPK家族基因的功能提供了理論基礎(chǔ)。