HOXD3 在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義*

陳小友 李隆玉 江維#

（1 南昌大學(xué)2016 級研究生 江西南昌 330006；2 江西省南昌市經(jīng)開區(qū)樂化中心衛(wèi)生院 南昌 330114；3 江西省婦幼保健院 南昌 330006）

宮頸癌（Cervical Cancer, CC）是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，是唯一可以通過三級預(yù)防措施消除的惡性腫瘤[1]。2018 年全球范圍有569 847 新發(fā)病例，311 365 死亡病例，全球?qū)m頸癌的發(fā)病率和病死率均居第四位[2]。我國每年有超過13 萬新發(fā)病例，約6 萬人死于宮頸癌。國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期為ⅠA～ⅡA 期的早期宮頸癌五年生存率（OS）可以達(dá)到80%～90%，ⅡB 期60%～70%，Ⅲ期約40%，ⅣA 期只有20%。宮頸癌以直接蔓延、淋巴轉(zhuǎn)移及血行轉(zhuǎn)移為主，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌最為常見的轉(zhuǎn)移途徑之一，也是決定宮頸癌預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有資料顯示，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者術(shù)后五年生存率為80%～100%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者五年生存率降至約47%[3]。InoueInoue 和Morita的研究也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的多少與ⅢC1 期患者預(yù)后有密切關(guān)系，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)1 個(gè)、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)2～3個(gè)、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)≥4 個(gè)的ⅢC1 期患者5 年OS 分別是81%、41%和23%[4]。手術(shù)和靶向治療CC 有一定的發(fā)展，但是晚期CC 患者生存率不高，因此如何尋找治療宮頸癌的新靶點(diǎn)，減少治療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，改善存活率，具有重要意義。

近年來，研究者開始著重關(guān)注宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的基因突變和蛋白表達(dá)，同源盒（Homebox,HOX）基因從胚胎發(fā)育到癌變的全過程中發(fā)揮著多類作用。HOX 基因最早于1915 年由卡耳文·布里吉斯（Calvin Bridges）在果蠅中發(fā)現(xiàn)[5]，HOX 基因能使果蠅按照正常的空間順序進(jìn)行肢體發(fā)育，同時(shí)調(diào)控其形態(tài)的改變，避免畸變的發(fā)生[6]。HOX 基因編碼轉(zhuǎn)錄因子家族是一種在進(jìn)化上高度保守的基因家族，它廣泛存在于真核細(xì)胞中，并主要參與動物肢體和形態(tài)發(fā)育等方面的調(diào)控[7]。此外，HOX 基因作為細(xì)胞增殖及分化的主控基因，其表達(dá)異常被證明與多種腫瘤（如白血病、前列腺癌、腎癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤等）的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8～9]。

HOXD3 屬于HOX 基因家族的一員，其表達(dá)產(chǎn)物為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化及腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用，現(xiàn)已知其調(diào)控的基因包括黏附分子、生長因子和胞外蛋白等。目前研究表明HOXD3 具有多種生物學(xué)功能，并與多種腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，如在肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中異常表達(dá)[10]，且與腫瘤的預(yù)后及分期密切相關(guān)。HOXD3 基因可以通過調(diào)節(jié)不同的靶點(diǎn)，發(fā)揮對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。本研究探討HOXD3 在宮頸癌組織中的表達(dá)水平及臨床意義，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，采取針對性的干預(yù)措施，提高生存率至關(guān)重要?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集并篩選77 例宮頸組織石蠟標(biāo)本，于2020 年10 月至2022 年10 月病理確診的33 例宮頸癌早期（ⅠB1～ⅠB2 期）、10 例局部晚期癌（ⅠB3 期）、20 例中晚期癌（Ⅱ～Ⅲ期）及5 例正常宮頸患者、9 例宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）為研究對象。本研究采用的宮頸癌組織、癌旁組織（與病灶之間的距離大于3 cm）標(biāo)本由江西省婦幼保健院腫瘤科及病理科提供。研究中所需要的組織標(biāo)本和臨床病理資料，都是經(jīng)本院倫理委員會索取，并征得患者知情同意。按FIGO 2018 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。選擇的癌組織及癌旁組織均經(jīng)過有一定資質(zhì)的病理科主任醫(yī)師確定。在本研究中使用的患者病例資料均真實(shí)、完整。記錄患者的一般臨床病理資料：年齡、病理類型。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）除手術(shù)外，患者未經(jīng)歷免疫治療、化學(xué)治療或放射性治療；（2）根據(jù)病理結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充放化療；（3）納入患者僅包括病理結(jié)果顯示為宮頸鱗狀細(xì)胞癌的患者；（4）其他部位沒有原發(fā)的第二腫瘤；（5）患者沒有嚴(yán)重糖尿病、高血壓或嚴(yán)重心臟病史。

1.3 主要試劑 HOXD3 兔多克隆抗體購自美國賽默飛公司；于北京中杉金橋生物技術(shù)公司購買兔二步法檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠二抗、免疫組化技術(shù)（IHC）抗體稀釋液。武漢博士德生物公司購買即用型正常山羊血清。

1.4 免疫組化步驟及結(jié)果判定方法 IHC 又名免疫細(xì)胞化學(xué)，其原理是用帶顯色劑標(biāo)志的特異性抗體與組織細(xì)胞原位發(fā)生抗原抗體反應(yīng)及組織化學(xué)呈色反應(yīng)來達(dá)到定性，定位目的、對相應(yīng)的抗原物質(zhì)進(jìn)行了定量測定。該技術(shù)將免疫反應(yīng)特異性與組織化學(xué)可見性巧妙融合，并且借助于顯微鏡可對多種抗原物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞及亞細(xì)胞層面的檢測。

1.4.1 免疫組織化學(xué)方法 檢測宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者石蠟標(biāo)本中HOXD3 蛋白的表達(dá)情況。（1）將載玻片進(jìn)行預(yù)處理：先把玻片事先放入濃酸溶液中、酒精中，再充分洗滌，干燥。其次把玻片泡在稀釋多聚-L- 賴氨酸溶液10 s 左右，再拿出來，放入烤箱（45℃）晾干，避免組織切片脫落。（2）組織切片：在切片機(jī)上取石蠟包埋標(biāo)本，切取厚度為4～5 μm 的組織，與玻片密貼。（3）撈取切片：待切組織樣本勻速攤開，撈取攤開的切片，鋪上載玻片，再把架子放在溫箱內(nèi)干燥，設(shè)定溫度30℃。（4）脫蠟：干燥切片按順序置于乙醇、二甲苯液濃度不等，實(shí)施梯度脫水脫蠟，每試劑脫蠟10 min，再經(jīng)過雙蒸水處理及磷酸緩沖鹽溶液（PBS）處理。（5）修復(fù)抗原：于檸檬酸中高溫高壓修復(fù)。（6）增加一抗，二抗：把HOXD3 抗體按1:100 的比例稀釋，慢慢地將50 μl 一抗工作液滴到玻片上，保證充分浸潤組織。把載玻片放在4℃的濕盒內(nèi)孵化一晚，并設(shè)陰性對照，以血清替代一抗。注意不要在濕盒中加水。次日用PBS 液清洗載玻片3次，每次5 min。利用濾紙將組織周圍的液體吸出，滴100 μl 反應(yīng)增強(qiáng)液于標(biāo)本玻片上用37℃濕盒孵化20 min。然后滴100 μl 增強(qiáng)酶山羊/ 小鼠/ 兔IgG 聚合物37℃濕盒內(nèi)孵化20 min。（7）DAB 顯色；37℃室溫滴加顯色劑，計(jì)時(shí)4～5 min，呈現(xiàn)棕黃色沉淀物，說明有顯色反應(yīng)。隨即以蒸餾水清洗玻片，結(jié)束顯色反應(yīng)，最后置于氨水中，組織返藍(lán)，然后用自來水清洗2 min。（8）蘇木素伊紅染色封片：二甲苯中透明。透明化處理完成之后，將切片烘干，再用中性樹膠進(jìn)行封片，將其置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4.2 顯微鏡圖像采集及結(jié)果判定 HOXD3 主要在胞漿著色，隨著臨床病理分級不同，細(xì)胞的染色強(qiáng)度也不同，陽性染色呈棕褐色、棕黃色、淡棕黃色；采用半定量方法，由2 位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度及陽性染色面積進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)：無色為0 分，淡棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性胞漿面積：隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野（×400）對陽性腫瘤胞漿面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算陽性細(xì)胞染色所占百分比：陽性面積≤10%，為1 分，10%～50%為2 分，50%～75%為3 分，＞75%為4 分。將上述兩分相加，＜2 分為（－），2～3 分為（1+），4～5 分為（2+），＞6 分為（3+）。依據(jù)HOXD3 免疫組化結(jié)果：0～1+ 為不表達(dá)（陰性），2+～3+為表達(dá)（陽性）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最后使用Canvas 12 和Adobe Photoshop 2022 進(jìn)行照片排版處理。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測HOXD3 在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達(dá)情況 HOXD3 在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織，在高-中-低分化宮頸癌組織中陽性率顯著高于宮頸正常組織，隨著CIN 病情進(jìn)展，HOXD3 的表達(dá)率逐漸升高，顏色逐漸加深，呈明顯的遞增趨勢（P=0.001），在中晚期（Ⅱ～Ⅲ期）表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05），陽性染色趨勢主要呈淡棕黃色、棕黃色、棕褐色，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.595，P=0.001）。見圖1、圖2、表1。

表1 HOXD3 與FIGO2018 CC 臨床病理分期之間的關(guān)系[例（%）]

圖1 HOXD3 蛋白在各級組織中的表達(dá)情況（×400）

圖2 HOXD3 在臨床病理分期與各組之間的關(guān)系

2.2 HOXD3 基因表達(dá)與患者各年齡段的相關(guān)性不同臨床分析與正常組織的HOXD3 基因表達(dá)與患者各年齡段無顯著相關(guān)性（χ2=18.838，P＞0.05）。見圖3、表2。

表2 HOXD3 與各年齡段之間的關(guān)系[例（%）]

圖3 HOXD3 在各年齡段之間的關(guān)系

3 討論

宮頸癌是一種常見的惡性腫瘤，導(dǎo)致患者病死率增加。全球?qū)m頸癌的發(fā)病率和病死率均居第四，我國每年有超過13 萬新發(fā)病例，6 萬人死于宮頸癌。進(jìn)展期宮頸癌患者的生存率并不高，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其主要死因。因此，積極探索宮頸癌細(xì)胞增殖侵襲遷移的研究，對宮頸癌的治療有重大意義。早期宮頸癌患者可行手術(shù)治療，治愈率較高；而化療、放療、手術(shù)和靶向治療CC 取得了進(jìn)展，但晚期CC 患者生存率并不高。

近年來的研究表明，多種HOX 基因與實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中人類HOX 基因有39個(gè)基因成員組成，分布在4 個(gè)保守基因簇中，HOXD包含9 個(gè)成員，分別為HOXD1、HOXD3、HOXD4、HOXD8、HOXD9、HOXD10、HOXD11、HOXD12 和HOXD13[11]。HOXD3 基因?qū)儆贖OX 基因家族的第三旁系成員，是一種轉(zhuǎn)錄因子和信號傳導(dǎo)蛋白。該蛋白質(zhì)參與生物化學(xué)反應(yīng)或細(xì)胞信號傳遞中，調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、分化等生理過程。

在本部分研究中，通過免疫組化檢測對77 例宮頸石蠟標(biāo)本中宮頸癌組織和正常宮頸組織中HOXD3 的表達(dá)水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HOXD3 在各組中的表達(dá)水平存在顯著差異。隨著CIN 病情的惡化，HOXD3 的高表達(dá)率逐漸升高，呈現(xiàn)遞增趨勢，特別是在中晚期（Ⅱ～Ⅲ期）表達(dá)顯著增強(qiáng)。此外，隨著臨床病理分級的提高，HOXD3 的表達(dá)水平也相應(yīng)增加，顏色更深，陽性染色呈淡棕黃色、棕黃色、棕褐色。然而，HOXD3 的表達(dá)與患者各年齡段之間并無顯著相關(guān)性。研究表明，HOXD3 在促癌基因中發(fā)揮作用。在結(jié)腸癌癌旁組織中，HOXD3 基因表達(dá)水平較低，而在癌組織中表達(dá)水平較高。此外，HOXD3基因表達(dá)水平與腫瘤TNM 臨床分期、腫瘤浸潤深度呈正相關(guān)關(guān)系[12]。研究表明，HOXD3 mRNA 在胃癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（t=10.48，P＜0.01）[13]，與正常乳腺組織相比，HOXD3 在乳腺癌組織中過表達(dá)[14]。CHEN 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中HOXD3 的高表達(dá)能夠在體外上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的HOXD3 表達(dá)，明顯促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖，并且降低細(xì)胞凋亡水平，這表明HOXD3 具有促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用，Litovkin 等[16]發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織內(nèi)HOXD3 高度甲基化，并與前列腺癌的高危風(fēng)險(xiǎn)明顯相關(guān)。Miyazaki 等[17]的研究表明，HOXD3 可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549 中轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β） 的表達(dá)，從而上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的表達(dá)，這表明HOXD3 可能具有促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的作用。此外，研究人員還分析了HOX 基因在人類肺小細(xì)胞癌移植小鼠中的表達(dá)，并指出HOXD3 在一些原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)水平較低[18]。

綜上所述，本研究中HOXD3 在CC 中表達(dá)水平的改變與HOXD3 在乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌等研究結(jié)果相一致。提示HOXD3 在CC 中表達(dá)可能是一種促癌基因。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出結(jié)論：HOXD3 在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著增加，并與宮頸癌的FIGO 分期相關(guān)，推測HOXD3基因與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可能在促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮一定作用，因此可以作為評估宮頸癌惡性程度的重要參考指標(biāo)。但是HOXD3 在宮頸癌組織中異常表達(dá)的具體機(jī)制以及其對宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程的具體影響和作用機(jī)制等問題還需要進(jìn)一步深入研究。未來，HOXD3 有望作為一種監(jiān)測宮頸癌進(jìn)展和新治療方法敏感性的生物標(biāo)記物。

本研究存在一定的局限性，因此需要對結(jié)果進(jìn)行謹(jǐn)慎解釋。為了更好地服務(wù)于病患，未來的研究應(yīng)該努力擴(kuò)大研究樣本的規(guī)模并改進(jìn)研究方法，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為疾病治療提供依據(jù)。