豬場(chǎng)PRRSV攻毒試驗(yàn)探索及陽(yáng)性血清的制備

施瑩　謝孟娟

摘要：良圻原種豬場(chǎng)長(zhǎng)期采用血清馴化的方式進(jìn)行豬藍(lán)耳病的防控，并摸索出一定的經(jīng)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上開(kāi)展本試驗(yàn)。近期，經(jīng)PRRSV陽(yáng)性樣品采集、PRRSV測(cè)序和同源性對(duì)比確認(rèn)豬場(chǎng)可能存在2種以上的PRRSV毒株，為了制備優(yōu)勢(shì)毒株血清，本試驗(yàn)對(duì)雙陰性豬只（35日齡）進(jìn)行PRRSV攻毒試驗(yàn)，在對(duì)PRRSV攻毒試驗(yàn)進(jìn)行探索的同時(shí)，為后期血清馴化提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：PRRSV；攻毒試驗(yàn)；陽(yáng)性血清；制備

豬藍(lán)耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），是由豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）引起的一種高接觸性傳染病，其感染性無(wú)品種、年齡和用途的差異，對(duì)所有豬均能造成不同程度的危害，為豬場(chǎng)的發(fā)展帶來(lái)直接和間接經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)，還致使豬場(chǎng)長(zhǎng)期發(fā)展受到制約。多年來(lái)，本豬場(chǎng)也一直采用血清馴化的方式來(lái)控制豬藍(lán)耳病，取得了較好的防控效果。一是通過(guò)人為干預(yù)控制豬群的感染時(shí)間，切實(shí)做好監(jiān)控和應(yīng)對(duì)措施，盡可能使豬群保持一致的狀態(tài)。二是選用本場(chǎng)的病毒株來(lái)進(jìn)行血清馴化，借助馴化血清的單一性獲得一致性的抗體，提升豬群的免疫力，提升母豬的繁殖性能和生產(chǎn)性能，為豬場(chǎng)長(zhǎng)期健康發(fā)展夯實(shí)基礎(chǔ)。

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1.1 PRRSV攻毒試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)豬場(chǎng)血清馴化的寶貴經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)已掌握豬藍(lán)耳病樣本Ct值在23左右的時(shí)候，直接將血清稀釋500倍進(jìn)行血清馴化效果最佳。為進(jìn)一步驗(yàn)證是否CT值為23的血清稀釋后攻毒效果更佳，并更明確PRRSV攻毒試驗(yàn)的要點(diǎn)，特開(kāi)展此試驗(yàn)，用兩個(gè)不同Ct值的血清對(duì)抗原抗體雙陰性豬（35日齡）進(jìn)行攻毒，跟蹤攻毒后臨床癥狀和抗原抗體的變化情況，為豬場(chǎng)血清馴化提供技術(shù)指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持。

1.2 陽(yáng)性血清的制備

近期，本豬場(chǎng)血清馴化不穩(wěn)定，為了確認(rèn)豬場(chǎng)存在的PRRSV毒株種類，采集陽(yáng)性樣品進(jìn)行測(cè)序、同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)豬場(chǎng)可能存在2種以上的PRRSV毒株。為滿足血清馴化的血清要求，決定重新進(jìn)行攻毒并制備血清。選用PRRSV雙陰性豬進(jìn)行PRRSV攻毒試驗(yàn)，對(duì)攻毒前后的PRRSV進(jìn)行測(cè)序和基因比對(duì)，確定同源性一致、Ct值滿足要求后殺豬取血制備血清，為后期豬場(chǎng)的血清馴化提供安全血清。

2 試驗(yàn)材料

豬場(chǎng)制備的PRRSV血清，選取2022年9月29日與本豬場(chǎng)優(yōu)勢(shì)毒株序列一致的流產(chǎn)母豬耳號(hào)2B26-Y333702血清（CT值19.92），公司內(nèi)部保存；PRRS抗原抗體雙陰豬，35日齡，來(lái)源于本豬場(chǎng)；抗原檢測(cè)試劑盒（ANIMAL-20220919），抗體檢測(cè)試劑盒（ID.Vet-I0701，IDEXX-EU610）；儀器ABI 7500、ABI QuantsudioTM5、BioTek 50TS、BioTek酶標(biāo)儀ELX800。

3 試驗(yàn)方法

3.1 豬場(chǎng)毒株種類鑒定

采集6份陽(yáng)性樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增后送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，用DNAstar lasergene與本豬場(chǎng)優(yōu)勢(shì)毒株進(jìn)行同源性對(duì)比。

3.2 PRRSV攻毒方法

每只豬編號(hào)、對(duì)應(yīng)的血清及攻毒時(shí)間如表1，另設(shè)置一只豬（FD013861）不進(jìn)行攻毒，與FD013890、FD013899共同飼喂，觀察其能否被自然感染，作為血清制備的備選。

3.3 采血檢測(cè)

攻毒后每天進(jìn)行采血和檢測(cè)，時(shí)間為12d，檢測(cè)Ct值，以此判斷抗原結(jié)果；檢測(cè)抗體S/P值，以此判斷抗體結(jié)果。需要注意，由于本試驗(yàn)進(jìn)行兩次攻毒，第二次攻毒（第3d）前要先采血測(cè)定后再進(jìn)行攻毒，以免攻毒影響當(dāng)日檢測(cè)結(jié)果。

3.4 攻毒前后同源性對(duì)比

對(duì)兩只試驗(yàn)豬的陽(yáng)性樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增后送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，用DNAstar lasergene與本豬場(chǎng)優(yōu)勢(shì)毒株進(jìn)行同源性對(duì)比。

4 結(jié)果和分析

4.1 豬場(chǎng)毒株鑒定結(jié)果

本場(chǎng)6個(gè)樣品測(cè)序后，跟現(xiàn)用馴化血清進(jìn)行兩兩相互比對(duì)，同源性從83.0%～100%不等（見(jiàn)圖1），整體分為兩大類，表明豬場(chǎng)內(nèi)至少存在2種不同PRRSV，為防沿用自存的血清導(dǎo)致血清馴化失敗，豬場(chǎng)決定重新制備血清。

4.2 攻毒前豬只PRRS監(jiān)測(cè)情況

PRRS雙陰豬檢測(cè)情況見(jiàn)表2，通過(guò)檢測(cè)抗原抗體雙陰性，證明試驗(yàn)動(dòng)物符合PRRS攻毒要求；通過(guò)檢測(cè)證明豬只不存在非瘟、PED、TGE、PDCV、豬瘟、豬偽狂犬等影響PRRS血清制備的疾病因素，證明試驗(yàn)動(dòng)物符合制備血清的要求。

4.3 攻毒后PRRS抗原監(jiān)測(cè)情況

PRRS雙陰性豬攻毒后Ct值檢測(cè)結(jié)果及PRRS抗原結(jié)果見(jiàn)表3。本試驗(yàn)中通過(guò)試劑盒Ct值的測(cè)定對(duì)抗原結(jié)果進(jìn)行判定，結(jié)合本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，Ct值≤38或有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期判定為陽(yáng)性；Ct值＞38的樣本建議重做，重做后無(wú)CT值判定為陰性，否則判為陽(yáng)性。由表3分析，PRRSV攻毒后，F(xiàn)D013890第4d開(kāi)始呈抗原陽(yáng)性；FD013899從第2d起即開(kāi)始呈現(xiàn)抗原陽(yáng)性；陰性對(duì)照則截至12d抗原皆為陰性。

4.4 攻毒后PRRS抗體監(jiān)測(cè)情況

PRRS雙陰性豬攻毒后PRRS抗體檢測(cè)情況見(jiàn)表4。由表4分析，PRRSV攻毒后，F(xiàn)D013890第12天開(kāi)始呈抗體陽(yáng)性；FD013899從第6d起即開(kāi)始呈現(xiàn)抗體陽(yáng)性；陰性對(duì)照至試驗(yàn)結(jié)束未呈現(xiàn)抗體陽(yáng)性。

4.5 攻毒后臨床癥狀

FD013890攻毒后第3d開(kāi)始出現(xiàn)嗜睡、喘氣異常等癥狀并伴隨體溫升高至40℃以上；FD013899攻毒后第5d開(kāi)始出現(xiàn)嗜睡、喘氣異常等癥狀并伴隨體溫升高至40℃以上；陰性對(duì)照未出現(xiàn)臨床癥狀。

4.6 攻毒前后同源性比對(duì)

第12d殺豬取血，對(duì)兩只攻毒豬的血清進(jìn)行測(cè)序后，和本豬場(chǎng)優(yōu)勢(shì)毒株兩兩相互比對(duì)，同源99.9%、100%，表明攻毒前后同源性一致，可以用于血清制備。

4.7 血清制備

第12d，以Ct值為判定依據(jù)（表3），Ct值＜23的豬只作為血清制備的選擇，確定攻毒豬FD013899用來(lái)制備血清，按照血清制備方法制備，血清制備量及處理保存方式見(jiàn)表5。

5 討論

5.1 PRRS抗原方面

通過(guò)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，攻毒豬13890和13899抗原轉(zhuǎn)陽(yáng)均早于抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)；豬只13899攻毒后較13890攻毒后抗原、抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)更早；豬只13899抗原與抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)間隔時(shí)間更短。證明，CT值23左右的血清用于本場(chǎng)血清馴化，豬只更早感染，可以縮短感染時(shí)間，降低生產(chǎn)成本，提高血清馴化的效率。陰性對(duì)照豬FD013861抗原至試驗(yàn)結(jié)束仍未轉(zhuǎn)陽(yáng)，分析原因可能是豬藍(lán)耳病的潛伏期差異較大，引入感染后，最短3d，最長(zhǎng)能達(dá)到37d，并且感染時(shí)間也受病毒株影響，此毒株可能毒性較弱，且健康豬只抵抗力強(qiáng)，因此自然感染時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)甚至不感染。在后期試驗(yàn)中可以延長(zhǎng)試驗(yàn)周期或增加平行樣品數(shù)量，以此增加檢測(cè)數(shù)據(jù)量，通過(guò)分析提高可信度。

5.2 PRRS抗體方面

攻毒豬13890抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)較抗原轉(zhuǎn)陽(yáng)延后8d，13899抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)較抗原轉(zhuǎn)陽(yáng)延后4d，鑒于抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)較抗原轉(zhuǎn)陽(yáng)的滯后性，在臨床中抗原檢測(cè)更可靠，并常將抗體檢測(cè)作為是否感染過(guò)PRRSV的依據(jù)。在臨床檢測(cè)中，要綜合判斷，不要只依賴于單一的檢測(cè)手段來(lái)判定豬只的感染狀態(tài)，以免造成誤判。

5.3 PRRSV同源性檢測(cè)的意義

一般來(lái)說(shuō)，PRRSV序列分析同源性越高，變異越小，對(duì)豬場(chǎng)造成的危害相對(duì)較小。為了提高防控效果，應(yīng)該對(duì)豬場(chǎng)PRRSV的種類有一個(gè)清晰的認(rèn)識(shí)，加強(qiáng)對(duì)馴化血清的管理，對(duì)病料進(jìn)行測(cè)序分析，選擇優(yōu)勢(shì)毒株，篩選同源性高的血清進(jìn)行血清馴化，保證馴化效果。

5.4 血清馴化的優(yōu)點(diǎn)和注意事項(xiàng)

血清馴化選用本豬場(chǎng)的毒株，防控時(shí)具有很好的交叉保護(hù)能力，能夠有效防控；對(duì)于豬藍(lán)耳病毒活躍的母豬場(chǎng)，血清馴化可以快速控制藍(lán)耳病，及時(shí)清除豬群的病毒量，大大降低損失；血清馴化后的豬場(chǎng)能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性，降低豬藍(lán)耳病的管控難度；血清馴化成本低，對(duì)于豬場(chǎng)效益提升和其他疾病的防控有很大的借鑒作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉英杰，齊六衛(wèi)，董彥龍，等.吉林某規(guī)模化豬場(chǎng)的豬藍(lán)耳病抗原抗體分析及防控建議[J].豬業(yè)科學(xué)，2022，39（11）：77-79.

[2] 張?zhí)鞂?，薛忠，張振?某豬場(chǎng)豬藍(lán)耳病暴發(fā)案例調(diào)查與防治[J].豬業(yè)科學(xué)，2022，39（8）：78-80.

[3] 沈葉盛，耿國(guó)芹，李焱，等.豬藍(lán)耳病的防控要點(diǎn)[J].山東畜牧獸醫(yī)，2022，43（6）：36-37.