靶向表皮生長(zhǎng)因子受體的泛素化修飾

張夢(mèng)，湯雋，張樹(shù)玲，趙健竹

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1.腫瘤科；2.胸外科，沈陽(yáng) 110004）

泛素是一類由76個(gè)氨基酸組成的高度保守的蛋白質(zhì)，分子量約為8.5×103，廣泛存在于所有真核細(xì)胞中。泛素分子攜帶7個(gè)賴氨酸殘基（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63），底物蛋白可以在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的賴氨酸殘基進(jìn)行泛素化，底物蛋白結(jié)合的賴氨酸殘基不同，底物蛋白的去向不同。泛素化修飾是一個(gè)主要由泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2 和泛素連接酶E3等介導(dǎo)的多級(jí)酶聯(lián)反應(yīng)。首先，E1 利用 ATP 提供的能量，在泛素 C 端賴氨酸殘基上的羧基基團(tuán)與自身的半胱氨酸殘基上的巰基基團(tuán)間形成高能硫酯鍵，從而活化泛素分子。然后，激活的泛素通過(guò)硫酯鍵被接合到 E2 的半胱氨酸殘基上。最終，激活的泛素或者通過(guò)E2直接連接到蛋白底物上，或是在E3作用下，通過(guò)泛素的羧基末端與靶蛋白賴氨酸殘基的氨基之間形成氨基異肽鍵，將泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。在這一系列酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，E3在靶蛋白的特異性識(shí)別以及泛素化系統(tǒng)的調(diào)控中起最重要的作用。根據(jù)E3的特征結(jié)構(gòu)域及泛素傳遞到靶蛋白的作用機(jī)制，E3被分為3個(gè)家族類型：含RING finger結(jié)構(gòu)域的E3、含HECT結(jié)構(gòu)域的E3以及含U-box結(jié)構(gòu)域的E3［1-4］。泛素化參與體內(nèi)各種蛋白質(zhì)的降解和（或）信號(hào)通路的變化，調(diào)控機(jī)體的各種生理功能［5-6］。

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是由Erbb-1基因編碼的具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受體，參與細(xì)胞增殖、有絲分裂等，在腫瘤發(fā)展、腫瘤靶向治療藥物耐藥中起重要作用。EGFR具有3個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域，包括胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。EGFR通過(guò)結(jié)合各種細(xì)胞外表皮生長(zhǎng)因子配體如表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）而被激活，導(dǎo)致其形成二聚體，二聚體刺激受體固有的酪氨酸激酶活性，并觸發(fā)自磷酸化。隨后，受體傳遞細(xì)胞反應(yīng)，介導(dǎo)各種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化、存活和生長(zhǎng)。EGFR基因擴(kuò)增或突變、基因重排和不同剪接變異體的產(chǎn)生是EGFR參與腫瘤轉(zhuǎn)化或癌癥進(jìn)展的重要途徑［7-11］。EGFR可以通過(guò)配體結(jié)合泛素化的方式，進(jìn)行翻譯后修飾。目前發(fā)現(xiàn)有多種E3參與EGFR的泛素化修飾，直接參與EGFR蛋白降解、介導(dǎo)EGFR通路信號(hào)改變、增強(qiáng)EGFR蛋白穩(wěn)定性等，泛素后的EGFR可經(jīng)蛋白酶體途徑、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的或非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑降解［12］。

1 野生型EGFR蛋白的泛素化修飾

1.1 Casitas B家系淋巴瘤（Casitas B-lineage lymphoma，Cbl）家族為最早鑒定的泛素EGFR的E3

泛素連接酶Cbl家族成員（Cbl、Cbl-b和Cbl-c）是受體酪氨酸激酶的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，Cbl家族蛋白依賴性泛素化在配體誘導(dǎo)溶酶體靶向和降解中發(fā)揮重要作用。其中，Cbl-c聯(lián)合表皮生長(zhǎng)因子受體途徑底物15（epidermal growth factor receptor pathway substrate 15，EPS15）中功能性泛素相互作用基序來(lái)介導(dǎo)EGFR的內(nèi)吞。Cbl-c結(jié)合于EPS15中功能性泛素相互作用基序，募集活化的EGFR進(jìn)入含有EPS15的囊泡。泛素后的EGFR復(fù)合物作為EPS15的對(duì)接位點(diǎn)，將受體招募到網(wǎng)格蛋白的囊泡中。Cbl-c可以通過(guò)2種不同的機(jī)制引導(dǎo)泛素化的EGFR進(jìn)入含有EPS15的內(nèi)化路徑：一種為依賴直接與EGFR結(jié)合的Cbl-c的磷酸酪氨酸結(jié)合區(qū)域；另一種為依賴鋅指結(jié)構(gòu)的C端，從而間接結(jié)合于受體。因此，Cbl-c介導(dǎo)EPS15參與活化后EGFR的內(nèi)吞降解［13］。

1.2 具有RING finger結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑1（cell growth regulator with RING finger domain 1，CGRRF1）在乳腺癌中調(diào)控EGFR泛素化

CGRRF1是一種生長(zhǎng)抑制因子，由一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)RING finger結(jié)構(gòu)域組成。許多含有RING finger結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)具有E3的功能，可以將泛素從E2轉(zhuǎn)移到底物蛋白上。CGRRF1在體內(nèi)和體外都能抑制乳腺癌的生長(zhǎng)，敲除CGRRF1基因可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)CGRRF1基因可以抑制乳腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)，RING finger結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渖L(zhǎng)抑制活性至關(guān)重要。在異種移植實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)CGRRF1基因的異種移植細(xì)胞中EGFR表達(dá)較低，相反，在CGRRF1基因敲除或敲低細(xì)胞中EGFR表達(dá)增強(qiáng)。CGRRF1通過(guò)K48鏈接的泛素化作用使EGFR泛素化，從而導(dǎo)致EGFR通過(guò)蛋白酶體降解［14］。

1.3 瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）在胰腺癌中調(diào)控EGFR泛素化

TRPV1首先在感覺(jué)神經(jīng)元中被發(fā)現(xiàn)，它被認(rèn)為是緩解疼痛的治療靶點(diǎn)。在胰腺癌細(xì)胞PANC-1中，過(guò)表達(dá)TRPV1基因后，EGFR表達(dá)降低，然而沉默TRPV1基因后，EGFR表達(dá)增加。TRPV1基因過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，顯著降低KRAS和AKT2兩種癌基因的mRNA水平。更重要的是，TRPV1通過(guò)誘導(dǎo)EGFR泛素化和降解來(lái)下調(diào)EGFR水平，從而調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞中EGFR/MAPK信號(hào)通路。這些結(jié)果揭示了TRPV1對(duì)胰腺癌細(xì)胞EGFR的調(diào)控作用及其機(jī)制，為設(shè)計(jì)新的靶向EGFR的抗胰腺癌藥物提供了新思路［15］。

1.4 包含HECT、UBA和WWE結(jié)構(gòu)域的蛋白1（HECT，UBA，and WWE domain-containing protein 1，HUWE1）促進(jìn)EGFR泛素化和降解

HUWE1是一個(gè)分子量約為482×103的E3，被認(rèn)為具有腫瘤促進(jìn)和（或）腫瘤抑制功能。TGF-β1是腎臟纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)，它抑制HK-2細(xì)胞中HUWE1表達(dá)，增加EGFR表達(dá)。HUWE1與EGFR相互作用，過(guò)表達(dá)HUWE1基因的HK-2細(xì)胞中，EGFR蛋白顯著降低，而EGFRmRNA未顯著降低，表明HUWE1對(duì)EGFR的下調(diào)發(fā)生在翻譯后水平。用MG132處理HK-2細(xì)胞以抑制蛋白質(zhì)降解時(shí)，EGFR表達(dá)增加，這表明HUWE1對(duì)EGFR的調(diào)控與蛋白質(zhì)降解泛素-蛋白酶體途徑之間存在聯(lián)系。HK-2細(xì)胞中，HUWE1基因過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)EGFR蛋白的半衰期縮短。EGFR蛋白在HUWE1基因過(guò)表達(dá)的HK-2細(xì)胞中，偶聯(lián)的泛素量是載體控制細(xì)胞中的2倍多，這表明HUWE1是參與EGFR降解的E3［16］。

1.5 環(huán)指蛋白144A（RING finger protein 144A，RNF144A）促進(jìn)EGFR泛素化并維持EGFR穩(wěn)定

RNF144A是一種含RING finger結(jié)構(gòu)域的E3，RNF144A包含1個(gè)RING finger結(jié)構(gòu)域和1～2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。在幾種類型癌癥中，RNF144A的表達(dá)與EGFRmRNA和蛋白水平呈正相關(guān)。EGFR的配體誘導(dǎo)RNF144A和EGFR相互作用。RNF144A在EGF刺激過(guò)程中促進(jìn)EGFR泛素化，維持EGFR穩(wěn)定性，延長(zhǎng)EGF/EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)多種方法消耗RNF144A，會(huì)導(dǎo)致EGFR表達(dá)和EGF/EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的降低。RNF144A的消耗減少了依賴EGF的細(xì)胞增殖［17］。

1.6 Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2（Smad ubiquitination regulatory factor 2，SMURF2）促進(jìn)EGFR泛素化并維持EGFR穩(wěn)定

SMURF2是一種HECT型E3，SMURF2可以泛素化EGFR，但通過(guò)保護(hù)EGFR不受Cbl-c介導(dǎo)的降解而穩(wěn)定EGFR。相反，小干擾RNA 介導(dǎo)的SMURF2基因敲除會(huì)使EGFR蛋白不穩(wěn)定，誘導(dǎo)自噬反應(yīng)，并降低表達(dá)EGFR的癌細(xì)胞的存活率，而對(duì)EGFR陰性癌細(xì)胞、正常成纖維細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞的影響極小。頭頸部鱗狀癌細(xì)胞UMSCC74B在裸鼠體內(nèi)形成侵襲性腫瘤，在小干擾RNA介導(dǎo)的SMURF2基因敲除后，其體內(nèi)成瘤能力顯著喪失。EGFR和SMURF2mRNA和蛋白表達(dá)具有很強(qiáng)的相關(guān)性。這些結(jié)果表明，SMURF2介導(dǎo)的EGFR泛素化可能是某些腫瘤中EGFR高表達(dá)的原因，并支持靶向SMURF2-EGFR相互作用作為治療EGFR依賴性腫瘤的新治療方法［19］。

1.7 假性激酶Tribble 3（pseudokinase Tribble 3，TRIB3）招募含有WW結(jié)構(gòu)域的E3泛素蛋白連接酶1（WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1，WWP1）促進(jìn)EGFR泛素化并維持EGFR穩(wěn)定

TRIB3作為一種壓力傳感器，對(duì)各種壓力源做出反應(yīng)，通過(guò)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和功能蛋白相互作用，參與慢性炎癥、代謝和惡性疾病。TRIB3通過(guò)與自噬受體P62相互作用，破壞自噬體和蛋白酶體降解癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)的功能，從而促進(jìn)幾種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。TRIB3缺失導(dǎo)致多種腫瘤促進(jìn)因子（包括EGFR）表達(dá)顯著降低。TRIB3基因過(guò)表達(dá)增強(qiáng)K63鏈接的EGFR泛素化，并且修飾發(fā)生在EGFR的近膜區(qū)。TRIB3與EGFR相互作用，招募蛋白激酶C-α，使EGFR在T654位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致WWP1催化K63鏈接的K689泛素化EGFR，增強(qiáng)EGFR的再循環(huán)，從而增強(qiáng)了EGFR的穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［20］。

2 突變型EGFR蛋白的泛素化修飾

2.1 Hsc70相互作用蛋白的C端（C-terminus of Hsc70-interacting protein，CHIP）促進(jìn)突變的EGFR泛素化和降解

CHIP是一個(gè)HSP70/HSP90共伴侶，具有E3活性。CHIP自身的E3活性獨(dú)立于HSP70/HSP90。CHIP選擇性地與EGFR突變體（G719S、L747_E749del A750P和L858R）相互作用，降低其表達(dá)。CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域具有E3活性，是EGFR突變體通過(guò)泛素化下調(diào)所必需的。CHIP在肺腺癌細(xì)胞中選擇性相互作用，并下調(diào)內(nèi)源性EGFR突變體。CHIP降低細(xì)胞增殖和致瘤性，尤其是在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中。CHIP基因過(guò)表達(dá)抑制了EGFR突變株的細(xì)胞增殖和異種移植瘤的生長(zhǎng)，但對(duì)野生型EGFR細(xì)胞株沒(méi)有抑制作用。EGFR突變體特異性泛素化修飾，可能是肺腺癌中EGFR調(diào)控的重要機(jī)制。CHIP可以有望成為克服EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）耐藥的新的治療靶點(diǎn)［21］。

2.2 姜黃素促進(jìn)EGFR泛素化和降解

姜黃素是一種名為二氟乙烯基甲烷的天然化合物，可以通過(guò)多種機(jī)制抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗轉(zhuǎn)移。姜黃素還通過(guò)調(diào)節(jié)EGFR蛋白水平下調(diào)前列腺癌細(xì)胞中的EGFR信號(hào)，表明姜黃素抑制內(nèi)在的EGFR酪氨酸激酶活性，抑制配體誘導(dǎo)的EGFR激活。姜黃素能通過(guò)泛素化野生型EGFR和突變型EGFR（T790M細(xì)胞），誘導(dǎo)EGFR蛋白降解。姜黃素誘導(dǎo)的EGFR降解，可能通過(guò)增強(qiáng)吉非替尼耐藥細(xì)胞的泛素-蛋白酶體能力來(lái)實(shí)現(xiàn)［22］。

2.3 SMURF2促進(jìn)突變的EGFR泛素化并維持突變的EGFR穩(wěn)定

SMURF2與EGFR相互作用，對(duì)EGFR的穩(wěn)定性和TKI的反應(yīng)至關(guān)重要。L858R/T790M突變的EGFR優(yōu)先被SMURF2-UBCH5（一種E3-E2介導(dǎo)的多聚泛素化）穩(wěn)定。4個(gè)賴氨酸殘基作為泛素化位點(diǎn)，用擬乙?；墓劝滨０啡〈渲幸粋€(gè)殘基，會(huì)增加突變體EGFR對(duì)厄洛替尼誘導(dǎo)的降解敏感性。在肺癌細(xì)胞株中，SMURF2基因過(guò)表達(dá)增加了L858R/T790M突變的EGFR蛋白水平，增加了TKI耐受性，而SMURF2基因敲低可降低L858R/T790M 突變的EGFR蛋白水平，使肺癌細(xì)胞對(duì)TKI敏感。總體來(lái)說(shuō)，SMURF2介導(dǎo)的L858R/T790M突變的EGFR多聚泛素化可能與乙?；閷?dǎo)的受體內(nèi)化相競(jìng)爭(zhēng)，而后者與增強(qiáng)受體穩(wěn)定性相關(guān)。因此，SMURF2增強(qiáng)L858R/T790M 突變的EGFR蛋白的穩(wěn)定性和對(duì)TKI的抗性［23］。

3 展望

泛素對(duì)蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾在維持蛋白穩(wěn)態(tài)、參與蛋白定位和轉(zhuǎn)位、調(diào)控蛋白活性和蛋白相關(guān)作用等方面扮演重要角色，使細(xì)胞對(duì)外部和內(nèi)部刺激變化做出迅速、敏感的反應(yīng)。蛋白質(zhì)泛素化修飾廣泛參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)吞等病理生理過(guò)程，為更好地認(rèn)知蛋白質(zhì)的功能提供更寬泛的視角。EGFR的泛素化修飾被認(rèn)為與EGFR的膜定位、降解、活化和內(nèi)吞等過(guò)程密切相關(guān)。一般認(rèn)為EGFR的泛素化為多位點(diǎn)的單泛素化，其泛素化形式包括以K48鏈為主和以K63鏈為主的2種不同形式。其中，K48鏈泛素化易被26S蛋白酶體識(shí)別和降解，而K63鏈泛素化則可被內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體識(shí)別，誘導(dǎo)EGFR通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)涵體，并進(jìn)一步通過(guò)溶酶體降解［24-25］。這一過(guò)程在下調(diào)EGFR相關(guān)通路及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、負(fù)性調(diào)控酪氨酸酶等過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Cbl家族是既往研究最為廣泛的泛素EGFR的E3。除此之外，近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，仍有部分E3參與EGFR泛素化過(guò)程，系統(tǒng)梳理其種類和功能，從而為進(jìn)一步尋找新的臨床靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)依據(jù)。EGFR及其下游通路的異?；罨欠核鼗袕V泛存在的驅(qū)動(dòng)因素，目前針對(duì)EGFR的抑制劑已被廣泛用于臨床，如針對(duì)非小細(xì)胞肺癌中EGFR通路的TKI，已被臨床指南推薦作為EGFR敏感突變的一線治療首選。然而，目前第3代TKI奧西替尼在臨床治療中的主要瓶頸為治療后耐藥，其耐藥形式主要以EGFR通路依賴的突變?yōu)橹鳎?0外顯子的C797S突變、20外顯子插入突變、18外顯子G724S突變以及EGFR擴(kuò)增等［26］。因此，從泛素化蛋白降解的角度下調(diào)EGFR水平，成為扭轉(zhuǎn)耐藥的關(guān)鍵。

近年來(lái)被廣泛關(guān)注的蛋白水解靶向嵌合體（proteolysis targeting chimera，PROTACT）人工合成異源嵌合型分子，是針對(duì)EGFR TKI耐藥后治療策略的研究熱點(diǎn)。PROTACT技術(shù)是以招募靶蛋白相關(guān)E3為基礎(chǔ)，靶向識(shí)別目的蛋白，并通過(guò)泛素化降解靶蛋白的方法。目前，針對(duì)不同突變類型的EGFR蛋白的PROTACT分子研發(fā)正在開(kāi)展廣泛的基礎(chǔ)研究，并已獲得初步研究結(jié)果［27］。因此，加強(qiáng)對(duì)EGFR E3的理解和分析，能夠促進(jìn)尋找靶向泛素-蛋白酶體系統(tǒng)治療新靶點(diǎn)，為拓寬基礎(chǔ)研究和臨床策略提供多角度的理解和思路。