附加華山新麥草不同Ns染色體對小麥耐鹽性的影響及其生理機制分析

耿 強,張亮亮,王亮明,楊群慧,劉淑會,陳新宏,武 軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點實驗室,陜西楊凌 712100)

小麥?zhǔn)侨祟愔匾募Z食作物之一,不斷加劇的土壤鹽漬化嚴(yán)重制約了小麥的種植面積和產(chǎn)量,全球糧食安全面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1-2]。土壤環(huán)境改良、抗鹽調(diào)節(jié)劑研發(fā)等手段對鹽堿地小麥的生產(chǎn)有很大作用,但需要耗費很多財力;通過遺傳改良提高小麥品種的耐鹽性是最經(jīng)濟、有效的方法,也是目前鹽堿地開發(fā)利用的研究熱點[3-4]。

多數(shù)小麥近緣物種具有較強的抗病、抗逆性,通過遠緣雜交的方式將優(yōu)異外源基因?qū)氲狡胀ㄐ←溨?可擴大小麥育種的基因庫[5]。朱 晨等[6]報道,含有十倍體長穗偃麥草一對5J(E)染色體的附加系材料CH1115-B15較親本耐鹽性更好;韓 冉等[7]通過對215份小麥-近緣物種染色體系進行耐鹽性鑒定,發(fā)現(xiàn)小麥-纖毛披堿草1Yc附加系的萌發(fā)期、苗期耐鹽性顯著優(yōu)于親本普通小麥中國春(CS),并推測纖毛披堿草1Yc染色體上可能含有耐鹽基因;Darko等[8]將兩芒山羊草2M、3M染色體附加到小麥后,發(fā)現(xiàn)新創(chuàng)制衍生后代的耐鹽能力顯著提升;Türk?si等[9]發(fā)現(xiàn),利用7B缺體小麥和小麥-大麥7H附加系創(chuàng)制的7BS/7HL小麥-大麥羅伯遜易位系較親本小麥耐鹽能力更強。這些研究結(jié)果揭示,小麥近緣物種的遺傳物質(zhì)對提高小麥耐鹽能力有著極大應(yīng)用潛力。

華山新麥草(PsathyrostachyshuashanicaKeng; 2n=2x=14, NsNs)屬于小麥族(Triticeae)、大麥亞族(Hordeinae)、新麥草屬,是我國華山獨有的小麥近緣種質(zhì)資源,具有耐旱、抗寒、耐貧瘠、早熟、抗病等優(yōu)良性狀[10-11]。本課題組通過將華山新麥草和普通小麥7182遠緣雜交,獲得了攜帶外緣染色體類型豐富的多種衍生后代,并在部分材料中驗證了不同外緣染色體在小麥品質(zhì)[12]、白粉病抗性[13]、條銹病抗性[14]、生育期及穗部性狀[15]、分蘗[16]等方面的改良作用,而有關(guān)華山新麥草在小麥耐鹽育種中的應(yīng)用鮮有報道。本研究以小麥-華山新麥草1Ns-7Ns全套二體附加系為主要研究對象,測定其在150、250 mmol·L-1NaCl脅迫處理下芽期、苗期的7個生長指標(biāo)和6個生理指標(biāo),以探究不同Ns染色體對受體小麥7182耐鹽能力的效應(yīng)及其生理機制,為華山新麥草遺傳物質(zhì)在小麥育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為小麥-華山新麥草全套染色體附加系(1Ns-7Ns),親本為普通小麥7182,對照品種德抗961(耐鹽)和中國春(鹽敏感),均由西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省植物遺傳工程育種重點實驗室創(chuàng)制或保存,具體染色體組成見表1。

表1 材料及染色體組成Table 1 Material and chromosome composition

1.2 試驗設(shè)計

選籽粒均勻、飽滿的種子,用自來水沖洗干凈表面,再用70%的酒精消毒15～30 s,10%的次氯酸鈉溶液浸泡處理7～10 min,用蒸餾水沖洗3～5次。設(shè)置150、250 mmol·L-1NaCl模擬不同程度的鹽脅迫環(huán)境,水處理為對照(CK),芽期和苗期進行不同處理。

芽期:在發(fā)芽皿中鋪墊一層濾紙,取消毒后的種子50粒,種臍朝下,按設(shè)置加15 mL不同濃度NaCl 溶液,于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā),光照12 h,黑暗12 h,濕度75%～80%,7 d后調(diào)查發(fā)芽率等指標(biāo)。三次重復(fù)。

苗期:取消毒后的種子50粒置于培養(yǎng)皿內(nèi),在室溫下萌動至露白;選取長勢一致的種子10粒培養(yǎng)于固定在泡沫板的水培籃上,采用1/2濃度的日本園試通用配方營養(yǎng)液[17]培養(yǎng)幼苗,每3 d換一次培養(yǎng)液;幼苗長至一葉一心后,用正常濃度營養(yǎng)液培養(yǎng)至兩葉一心;按設(shè)置進行NaCl處理,高濃度(250 mmol·L-1)的NaCl間隔6 h分兩次加入至終濃度,以免造成燒苗;繼續(xù)培養(yǎng)14 d后測量各項指標(biāo)。每個處理三次重復(fù);溫室條件為:光照14 h、22 ℃,黑暗10 h、18 ℃,通氣12 h。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生長指標(biāo)測定

芽期:以芽長超過種子長度1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計不同處理種子發(fā)芽率、芽長、芽相對含水量及主根長。

苗期:脅迫處理14 d后,用常規(guī)方法測定幼苗地上部分鮮重,用根系掃描儀測定根總長、根表面積。按照農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/ PZT001-2002統(tǒng)計材料生長情況,并按6級標(biāo)準(zhǔn)進行分級:0級,葉片生長正常,無受害癥狀;1級,生長基本正常,僅葉尖少量青枯;2級,約30%的葉片青枯或者失綠;3級,約50%的葉片青枯或者失綠;4級,幼苗幾乎停止生長,約80%葉片青枯或者失綠;5級,幼苗完全停止生長,葉片全部死亡。計算鹽害指數(shù)并評定耐鹽等級。鹽害指數(shù)(%)=∑(0×n0+1×n1+2×n2+3×n3+4×n4+5×n5)/(5×N)×100,其中n0～n5指 0～5級的植株數(shù)目,N指植株總數(shù)目。耐鹽等級評定標(biāo)準(zhǔn)為:Ⅰ級-高耐,耐鹽指數(shù)0～20.0%;Ⅱ級-耐鹽,耐鹽指數(shù)20.1%～40.0%;Ⅲ級-中耐,耐鹽指數(shù)40.1%～60.0%;Ⅳ級-敏感,耐鹽指數(shù)60.1%～80.0%;Ⅴ級-高感,耐鹽指數(shù)80.1%～100%[18]。

1.3.2 苗期理化指標(biāo)測定

采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量[19];使用電導(dǎo)率儀測定溶液電導(dǎo)率,計算相對電導(dǎo)率[20];采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量[21];采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量[22];采用氮藍四唑(NBT)法測定 SOD 活性[20];采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2021和SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Ns附加系芽期耐鹽性分析

在150和250 mmol·L-1NaCl脅迫處理后,各材料的萌發(fā)受到了不同程度的抑制,發(fā)芽率、芽長、芽相對含水量及根長均下降(圖1,圖2)。7182及其Ns附加系的綜合耐鹽性優(yōu)于中國春(CS),不同Ns附加系間耐鹽能力不同。鹽脅迫下,4Ns、5Ns及7Ns附加系的發(fā)芽率顯著高于其他附加系材料;與對照相比,7Ns附加系在150和250 mmol·L-1NaCl脅迫下的發(fā)芽率分別下降了22.11%和32.63%,僅次于德抗961(DK961,分別下降15.90%、19.49%);各材料的芽長、根長及芽相對含水量的變化趨同發(fā)芽率結(jié)果。這說明4Ns、5Ns及7Ns附加系在芽期鹽脅迫條件下,比受體小麥7182及其它附加系有更好的發(fā)芽能力和生長潛力。

圖1 NaCl處理下各材料芽期形態(tài)特征Fig.1 Phenotypes of tested materials at germination stage under different NaCl treatments

相同處理圖柱上不同小寫字母表示材料間差異顯著(P<0.05)。下圖同。Different letters above columns of same treatment indicate significant difference among materials(P<0.05). The same in figures 2-5.圖2 不同處理下供試材料的發(fā)芽狀況Fig.2 Germination performances of the tested materials under different treatments

2.2 不同Ns附加系苗期耐鹽性分析

2.2.1 生長指標(biāo)分析

（3）港區(qū)功能定位有所側(cè)重。對于能產(chǎn)生產(chǎn)業(yè)帶動效益的岸線資源應(yīng)布置技術(shù)、勞動、資金密集型臨港產(chǎn)業(yè)可建在人口較密集的港區(qū)；有污染，產(chǎn)業(yè)低級，不易帶動就業(yè)等產(chǎn)業(yè)鏈延伸不長的臨港項目建在離居民較遠的港區(qū)；集中合理布置集裝箱碼頭作業(yè)區(qū)，為“適箱貨種轉(zhuǎn)向集裝箱運輸、陸運集裝箱向水運分流”做準(zhǔn)備；加快旅游碼頭和游艇基地的建設(shè)，打造旅游休閑中心，為深入實施“旅游國際化”和“旅游全域化”做準(zhǔn)備。

鹽脅迫下,地上部和根系的生長情況能很好地反映小麥的苗期耐鹽能力。對照組中,相較于親本7182,4Ns附加系葉片鮮重更高,4Ns、6Ns附加系根系較長、表面積更大(圖3),可見Ns染色體附加改變了受體小麥7182苗期的生長性狀。

圖3 不同處理下供試材料的苗期生長狀況Fig.3 Seedling growth of the tested materials under different treatments

圖4 不同處理下供試材料的脯氨酸、可溶性蛋白含量Fig.4 Contents of proline and soluble protein in the tested materials under different treatments

隨著NaCl濃度的增加,各材料苗期地上、地下部生長受到了不同程度的抑制,且葉片鮮重的變化較根系總長、表面積更為明顯。

150 mmol·L-1NaCl處理下,與對照相比,7Ns附加系葉片鮮重、根表面積降幅均最小,分別為12.05%和2.08%;2Ns附加系根長降幅僅2.13%,其次是5Ns附加系,降幅2.22%。

250 mmol·L-1NaCl處理下,與對照相比,各附加系葉片鮮重降幅為20.72%～40.41%,根長和根表面降幅為7.33%～25.34%、6.92%～20.26%;4Ns、5Ns和7Ns附加系各項生長指標(biāo)優(yōu)于親本7182,7Ns附加系的綜合表現(xiàn)最好,較母本7182葉片鮮重高34.89%,總根長高16.76%,根表面積高35.14%。說明4Ns、5Ns和7Ns附加系苗期抗鹽性較好。

2.2.2 耐鹽等級分析

由表3可知,150和250 mmol·L-1NaCl處理下,試驗材料鹽害指數(shù)為14.74%～53.82%、19.36～89.43%。CS、6Ns附加系的受害程度最嚴(yán)重,150 mmol·L-1NaCl下,葉片開始萎蔫、黃化,250 mmol·L-1NaCl下,葉片基本枯死。1Ns、2Ns、3Ns附加系和親本7182的表現(xiàn)略好于CS。4Ns、5Ns、7Ns附加系及DK961在兩個鹽濃度下的鹽害指數(shù)顯著低于其它材料,其中7Ns附加系耐鹽能力最接近DK961,150 mmol·L-1NaCl下鹽害指數(shù)為18.73%,表現(xiàn)為Ⅰ級高耐,250 mmol·L-1NaCl下鹽害指數(shù)為22.41%,表現(xiàn)為Ⅱ級耐鹽。

表3 不同處理下供試材料的SOD、POD活性Table 3 SOD and POD activity of the tested materials under different treatments

綜上,4Ns、5Ns和7Ns附加系在苗期具有相對較高的耐鹽能力,說明4Ns、5Ns和7Ns染色體中可能含有耐鹽相關(guān)的基因;通過Ns染色體附加的方式可以提高受體小麥7182的耐鹽能力。

2.3 不同Ns附加系耐鹽性生理機制分析

2.3.1 不同Ns附加系滲透調(diào)節(jié)能力分析

隨著NaCl濃度的增加,小麥葉片中的脯氨酸含量逐漸升高,可溶性蛋白含量逐漸降低,各材料間的變化程度存在差異。150和250 mmol·L-1NaCl處理下,各材料中脯氨酸含量較對照增幅為48.05%～94.17%、104.69%～158.44%,2Ns附加系脯氨酸含量最低;可溶性蛋白的降幅分別為12.78%～23.57%、26.32%～41.15%,6Ns附加系可溶性蛋白含量最低。

150 mmol·L-1NaCl處理下,5Ns附加系脯氨酸含量、可溶性蛋白含量最高,顯著高于CS,7Ns附加系次之。250 mmol·L-1NaCl處理下,4Ns附加系脯氨酸含量增幅最大,脯氨酸含量僅次于DK961;7Ns附加系可溶性蛋白含量降幅最小,僅為26.32%,含量僅次于DK961和5Ns附加系。

由此可知,2Ns、6Ns附加系在鹽脅迫環(huán)境下的滲透調(diào)節(jié)能力較弱,而4Ns、5Ns、7Ns附加系較強。

2.3.2 不同Ns附加系抗氧化能力分析

150和250 mmol·L-1NaCl處理后,各材料的SOD、POD活性與其對照相比均顯著提高,且后者變化更為明顯(表3)。鹽敏感對照CS與耐鹽對照DK961的SOD、POD活性差異顯著,7182介于兩者之間,各附加系材料的表現(xiàn)各不相同。其中,5Ns、7Ns附加系SOD活性增幅顯著大于7182及CS,分別為57.61%～83.14%、41.89%～60.16%,活性與DK961無顯著差異,而1Ns、3Ns附加系的增幅顯著小于7182,分別為13.20%～22.40%、11.93%～27.46%;2Ns、5Ns、7Ns附加系POD活性增幅顯著大于7182及CS,其中2Ns、7Ns附加系的活性高于DK961,而6Ns附加系的增幅顯著小于7182,表明2Ns、5Ns、7Ns附加系鹽脅迫環(huán)境下細胞抗氧化能力較強,而1Ns、3Ns、6Ns附加系能力較弱。

2.3.3 不同Ns附加系細胞膜穩(wěn)態(tài)維持能力分析

鹽脅迫處理后各材料的丙二醛含量、相對電導(dǎo)率出現(xiàn)不同程度的升高,且后者變化更為明顯(圖5),說明鹽脅迫使小麥膜脂過氧化程度加劇,細胞膜透性增大、細胞內(nèi)含物外滲增加。

圖5 不同處理下供試材料的MDA、相對電導(dǎo)率Fig.5 MDA content and relative conductivity of the tested materials under different treatments

150和250 mmol·L-1NaCl處理下,鹽敏感對照CS的丙二醛含量最高,相對電導(dǎo)率增幅最大,7182及其附加系的表現(xiàn)優(yōu)于CS,耐鹽對照DK961的兩項指標(biāo)均為最小。與7182相比,附加系材料中7Ns附加系丙二醛含量最低,增幅為22.25%～28.61%;4Ns附加系稍次之,增幅為16.35%～24.25%;2Ns附加系丙二醛含量最高,增幅較大,為12.43%～79.19%;5Ns、7Ns附加系相對電導(dǎo)率最低且增幅較小,1Ns、6Ns附加系相對電導(dǎo)率最高,增幅較大。由此可知,4Ns、7Ns附加系抑制丙二醛含量升高的能力更強,5Ns、7Ns附加系細胞膜保護能力更強。

3 討論

3.1 近緣種屬在小麥耐鹽育種中的應(yīng)用

小麥-外源染色體附加系、代換系和易位系等含有不同長度外源染色體片段的衍生后代不僅可以作為外源基因?qū)胄←湹幕A(chǔ)材料,同時也可用于研究不同外源片段基因的功能[23]。通過對小麥遠緣雜交衍生后代進行耐鹽性鑒定,可初步篩選出優(yōu)異的耐鹽種質(zhì),為小麥的耐鹽性研究和育種提供材料。近年來,對硬粒小麥、近緣物種三級基因庫中優(yōu)異耐鹽種質(zhì)的篩選以及耐鹽基因的導(dǎo)入等相關(guān)研究已經(jīng)廣泛開展[24],山融3號[25]、小偃60[26]等遠緣雜交育成的耐鹽小麥品種也先后問世。

小麥的耐鹽性是鹽脅迫下各組織間多性狀協(xié)調(diào)后的綜合表現(xiàn),單一的指標(biāo)不能夠得出準(zhǔn)確的耐鹽性評定結(jié)果,因此在小麥耐鹽種質(zhì)篩選的過程中,應(yīng)綜合考慮鹽脅迫下的各種生長指標(biāo)[27]。李小康等[28]通過對141份人工合成六倍體小麥進行15項生理生化指標(biāo)的測定,鑒定出了17份耐鹽種質(zhì),并通過對各個指標(biāo)的耐鹽系數(shù)進行主成分分析,發(fā)現(xiàn)芽期的發(fā)芽率、芽長、根長、苗含水量及苗期地上部鮮重等生理指標(biāo)與小麥耐鹽性呈正相關(guān)。本研究中,鹽脅迫下,4Ns、5Ns、7Ns附加系的上述生理指標(biāo)均高于親本7182,表現(xiàn)出了良好的耐鹽性,這與依據(jù)鹽脅迫下苗期實際生長狀況評定出的耐鹽等級結(jié)果一致,說明以上指標(biāo)可作為篩選耐鹽種質(zhì)的依據(jù)。

相較于生理指標(biāo),鹽脅迫下植株的生長狀況更能直觀地反映小麥的耐鹽能力,是耐鹽小麥培育中育種家們的選種依據(jù)[29]。王萌萌等[30]對882份小麥品種進行了耐鹽性鑒定,篩選出了43份芽期、苗期均達到中耐水平的耐鹽種質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫下,4Ns、5Ns、7Ns附加系鹽害指數(shù)較低,幼苗生長受影響較小,表現(xiàn)出了比親本7182更高的耐鹽能力,其中7Ns附加系在150和250 mmol·L-1NaCl處理下僅有少量葉尖發(fā)生青枯,幼苗生長基本正常,整體表現(xiàn)接近生產(chǎn)常用耐鹽品種DK961,說明華山新麥草在小麥耐鹽改良中具有極大的應(yīng)用潛力,并且這些附加系材料可作為新種質(zhì)應(yīng)用于小麥耐鹽育種研究。

通過衍生后代可對野生近緣屬種耐鹽基因的染色體位置進行初步判斷,在創(chuàng)制相關(guān)染色體代換系、易位系等衍生材料的基礎(chǔ)上縮小定位區(qū)間,為耐鹽基因的精細定位及克隆提供參考依據(jù),提高外源基因在小麥耐鹽育種中的利用效率。Darko等[31-32]通過對系列小麥-大麥附加系進行耐鹽性鑒定,發(fā)現(xiàn)7H附加系表現(xiàn)出了同大麥親本Manas的高耐鹽性,進一步對小麥-大麥7H附加系和7HS、7HL端體附加系耐鹽鑒定后,將耐鹽基因初步定位在了大麥7HL染色體區(qū)域;Türk?si等[9]利用7B缺體小麥和小麥-大麥7H附加系創(chuàng)制了7BS/7HL小麥-大麥羅伯遜易位系,其高耐鹽性證實了7HL染色體含有耐鹽相關(guān)基因,并且易位系材料的遺傳穩(wěn)定性較高可直接應(yīng)用于小麥耐鹽育種。本研究通過對小麥-華山新麥草全套附加系進行耐鹽性鑒定,推斷4Ns、5Ns、7Ns染色體上可能含有耐鹽相關(guān)基因。要實現(xiàn)相關(guān)基因的精細定位及衍生后代在耐鹽育種中的利用,需要進行相關(guān)染色體代換系、易位系、漸滲系等衍生材料的創(chuàng)制。

3.2 鹽脅迫下小麥Ns附加系的耐鹽生理機制

鹽脅迫下植物體內(nèi)發(fā)生了復(fù)雜的生理生化反應(yīng),這也決定了高等植物對鹽逆境的適應(yīng)是一個綜合的生物調(diào)節(jié)過程,需要各種生理生化過程的協(xié)同作用,而非某種單一的過程就能夠使植物成功地抵御鹽逆境[33]。

鹽脅迫導(dǎo)致的滲透脅迫會使種子吸水萌發(fā)困難、生長發(fā)育受限[34]。本研究觀察到,隨著NaCl濃度的增加,各材料的發(fā)芽率顯著下降,地上、地下部的生長受到明顯抑制,并且葉片中作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的可溶性蛋白也發(fā)生顯著下降。前人研究表明,為緩解滲透脅迫,植物體內(nèi)合成大量的滲透調(diào)節(jié)物,其中,游離脯氨酸疏水端可和蛋白質(zhì)結(jié)合,親水端可與水分子結(jié)合,蛋白質(zhì)可借助脯氨酸束縛更多的水,從而防止?jié)B透脅迫條件下蛋白質(zhì)的脫水變性[35]。本研究中,4Ns、5Ns和7Ns附加系在鹽脅迫下脯氨酸含量較高,推測這些染色體上可能含有脯氨酸代謝調(diào)控相關(guān)基因。

鹽脅迫下細胞代謝過程中會生成大量的活性氧(ROS),其具有很強的氧化能力,會造成細胞膜脂的過氧化,并產(chǎn)生丙二醛(MDA)等使膜受損。為緩解氧化脅迫,SOD、POD等活性氧清除酶活性增高[36]。在本試驗中觀察到了同樣的現(xiàn)象,各材料的過氧化產(chǎn)物MDA有不同程度增多,導(dǎo)致膜的通透性發(fā)生變化,細胞內(nèi)含物發(fā)生外泄,伴隨著相對電導(dǎo)率升高。值得注意的是,耐鹽材料4Ns附加系中SOD、POD酶活性總值及增幅均小于7182,但MDA含量僅大于7Ns附加系,膜脂受過氧化作用較小,細胞膜穩(wěn)態(tài)維持較好,即4Ns附加系中活性氧的清除可能不依賴SOD、POD。有研究表明,脯氨酸不僅是關(guān)鍵的滲透調(diào)節(jié)物,還可作為活性氧清除劑抑制細胞內(nèi)過氧化作用的發(fā)生[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn),4Ns附加系在高濃度鹽脅迫下脯氨酸含量顯著高于7182,其耐鹽性可能依賴于脯氨酸活性氧清除途徑。