小麥轉(zhuǎn)錄因子TaMYB5-like轉(zhuǎn)錄自激活能力及其參與生理型花粉敗育過程表達模式研究

王 芮,唐 鵬,單思聰,牛 娜,閔東紅,馬守才,王軍衛(wèi),孫聯(lián)合,張改生,宋瑜龍

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心/國家小麥改良中心楊凌分中心/小麥育種教育部工程研究中心/陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點實驗室,陜西楊凌 712100; 2.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南駐馬店 463000)

小麥在世界各地廣泛種植,是人類不可或缺的食物來源。研究發(fā)現(xiàn),雜交小麥在苗期就表現(xiàn)出了顯著的雜種優(yōu)勢,如較高的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率;凈光合速率與單株產(chǎn)量、單株生物量呈顯著正相關(guān);穗粒重、穗粒數(shù)、穗長、總小穗數(shù)、有效小穗數(shù)均呈現(xiàn)不同程度的超親優(yōu)勢[1-4]。然而,優(yōu)異小麥雄性不育系的創(chuàng)制一直是限制小麥雜種優(yōu)勢利用的瓶頸。目前,小麥雄性不育系主要有基因型控制的遺傳型雄性不育系、光溫敏雄性不育系以及化學(xué)雜交劑誘導(dǎo)的生理型雄性不育系。研究發(fā)現(xiàn),化學(xué)雜交劑SQ-1誘導(dǎo)花粉敗育率高于95%, 飽和授粉結(jié)實率在85%以上[5],殺雄效果優(yōu)良,但生產(chǎn)成本較高,難以在雜交小麥大面積應(yīng)用。本課題組通過轉(zhuǎn)錄組測序在SQ-1誘導(dǎo)的小麥生理型雄性不育系PHYMS-1376和等量清水處理的對照可育系CK-1376五個時期花藥中篩到一個共同表達差異基因,命名為TaRVE6,并通過酵母雙雜交技術(shù)獲得其互作蛋白,經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫比對將其命名為TaMYB5-like,其編碼基因為TaMYB5-like(ID:Traes CS31302G2P0600),屬于MYB家族。

MYB家族是真核生物中最常見一類基因家族,其參與植物生長發(fā)育的各個階段,涉及內(nèi)源激素、環(huán)境響應(yīng)及其他生物或非生物脅迫通路[6-7]。MYB類家族成員還參與調(diào)節(jié)植物花粉發(fā)育過程,如MYB80基因可以調(diào)控花藥絨氈層細胞提前降解,導(dǎo)致小孢子發(fā)育受阻,花粉粒敗育[8-9];MYB24與茉莉酸途徑的抑制因子JAZ(jasmonate ZIM-domain)蛋白(JAZs)互作可以調(diào)控茉莉酸(JA)的含量,MYB24表達量升高則會誘導(dǎo)植物花粉敗育[10-11];MYB5可能對脂代謝、糖代謝等過程產(chǎn)生影響,造成水稻花藥發(fā)育異常并導(dǎo)致花粉敗育[12];GbMYB5可能參與花的生長分化過程[13]。上述研究表明,MYB家族成員對花粉發(fā)育有重要作用。

基于此,本研究擬以PHYMS-1376和CK-1376小麥四分體、單核早期、單核晚期、二核期和三核期花藥為試材,克隆TaMYB5-like基因,并對其進行序列結(jié)構(gòu)、生物信息、表達模式、亞細胞定位及轉(zhuǎn)錄自激活效應(yīng)研究,以了解TaMYB5-like的互作蛋白及其調(diào)控關(guān)系,為明確SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育分子機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與處理

試驗材料為西農(nóng)1376和本氏煙草(Nicotianabenthamiana),均由西北農(nóng)林科技大學(xué)作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點實驗室提供。2020年10月,小麥西農(nóng)1376種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)農(nóng)作一站,待翌年3月植株發(fā)育至旗葉伸長到倒二葉的1/2(Feeks=8.5)時期,將其分為兩組,一組用濃度為5 kg·hm-2的化學(xué)雜交劑SQ-1均勻噴施,記為PHYMS-1376;另一組用等量清水噴施作為對照,記為CK-1376。待對照植株花粉粒發(fā)育至四分體、單核早期、單核晚期、二核期和三核期時,分別取PHYMS-1376和CK-1376麥穗置于冰上帶回實驗室鏡檢,確認花藥發(fā)育時期無誤后,收集花藥,置入EP管,液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取

分別取保存在-80 ℃冰箱的PHYMS-1376和CK-1376小麥四分體、單核早期、單核晚期、二核期和三核期花藥0.1 g轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中研磨,期間不斷加入液氮,直至成粉末狀;將其分別轉(zhuǎn)移至2.0 mL EP管中,用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(R401-01,諾唯贊生物科技股份有限公司,中國南京)參照使用說明提取PHYMS-1376和CK-1376各發(fā)育時期花藥總RNA,并進行純化。

1.2.2 cDNA的獲取及TaMYB5-like基因克隆

分別以上述純化后的RNA為底物,用HiScript?IIReverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(R201-01,諾唯贊生物科技股份有限公司,中國南京)參照說明書合成PHYMS-1376和CK-1376不同發(fā)育時期花藥cDNA。

在NCBI數(shù)據(jù)庫下載TaMYB5-like完整的CDS序列,使用Oligo 7軟件設(shè)計特異性引物(表1)。PCR反應(yīng)體系50 μL:2×Phanta Max Master Mix 25 μL,TaMYB5-like-F/R引物(10 μM)各2.5 μL,CK-1376小麥三核期花藥cDNA(100 ng·μL-1)5 μL,ddH2O 15 μL。擴增程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,40個循環(huán);72 ℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,用San Prep 柱式DNA膠回收試劑盒(B518131,上海生工)參照說明書回收目的片段,將其連接至pEASY-Blunt Cloning Vector(NO:101,北京全式金生物),轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞;將菌液均勻涂布在含有50 μg·mL-1Amp抗生素的固體培養(yǎng)基上,挑陽性單克隆轉(zhuǎn)至含有Amp抗生素的菌液中擴大培養(yǎng),送至上海生工測序,獲得TaMYB5-like基因的編碼序列。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3TaMYB5-like基因生物信息學(xué)分析

基于TaMYB5-like基因序列信息,參照李魯華[14]的方法,用SMART(https://smart.embl.de/)在線軟件分析TaMYB5-like蛋白結(jié)構(gòu)域;用在線軟件Psort1(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)預(yù)測TaMYB5-like基因亞細胞定位;分別用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和SWISS-MOLD(https://swissmodel.expasy.org/interactive)在線軟件預(yù)測TaMYB5-like蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。用Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析軟件對TaMYB5-like蛋白的理化性質(zhì)進行分析,并分別使用TMHMM-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)和SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預(yù)測TaMYB5-like蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽;利用PLANTCAER(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線軟件預(yù)測TaMYB5-like基因啟動子區(qū)順式作用元件。利用MEGA軟件分析不同物種TaMYB5-like基因進化關(guān)系;利用Jalveiw軟件對TaMYB5-like基因進行多序列比對,明確其保守結(jié)構(gòu)。

1.2.4TaMYB5-like基因亞細胞定位

以含有TaMYB5-like-pEASY-Blunt Cloning Vector菌液為模板,利用含有pCAMBIA 1302-2×Myc-EGFP同源臂的擴增引物TaMYB5-like-F1/R1(表1),擴增TaMYB5-like基因編碼序列。擴增體系為50 μL,其中2×Phanta Max Master Mix 25 μL,TaMYB5-like-F1/R1(10 μmol-1)各2.5 μL,含有TaMYB5-like-pEASY-Blunt Cloning Vector的大腸桿菌菌液3 μL,ddH2O 17 μL;擴增程序為:95 ℃ 1 min; 95 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min,40個循環(huán); 72 ℃延伸5 min?；厥諗U增片段,并將其與BstbⅠ線性化的pCAMBIA 1302-2×Myc-EGFP載體連接,隨后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,涂布在含有Kan的固體培養(yǎng)基上,挑單克隆、搖菌、送樣、測序同1.2.2。提取TaMYB5-like-pCAMBIA 1302-2×Myc-EGFP重組載體,并利用凍融法將其轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌 GV3101感受態(tài)細胞,涂至含有100 mg·mL-1Kan和100 mg·mL-1Rif兩種抗生素的固體培養(yǎng)基上,28℃倒置培養(yǎng)36 h,挑陽性克隆進行菌液PCR檢測,將目標菌擴大培養(yǎng)至OD600=0.6,5 000 r·min-1離心后棄上清;用轉(zhuǎn)化液重懸菌體,之后采用注射法將菌液注入4～6葉期健壯的本氏煙草葉片中,暗處理12 h后置于光照培養(yǎng)箱中,正常培養(yǎng)48 h;取注射孔附近的葉片表皮置于載玻片上,在激光共聚焦熒光顯微鏡(TCS SP8 SR,德國萊卡)下觀察,并拍照。陰性對照為pCAMBIA 1302-2×Myc-EGFP空載轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌侵染煙草。

1.2.5TaMYB5-like基因酵母雙雜交自激活性研究

設(shè)計帶有pGBKT7載體同源臂,且含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的特異性擴增引物TaMYB5-like-F3/R3(表1),擴增TaMYB5-like基因編碼框,隨后將其與EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切線性化pGBKT7(BD)載體連接。提取BD-TaMYB5-like重組質(zhì)粒利用乙酸鋰方法將其轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母感受態(tài)細胞,隨后將其涂布在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上,30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。挑取SD/-Trp固體培養(yǎng)基上陽性菌株轉(zhuǎn)接至SD/-Trp液體培養(yǎng)基,并分別用ddH2O稀釋菌液至100、10-1和10-2倍;分別取不同濃度的稀釋菌液2 μL接種至SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上,30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3 d,觀察酵母生長狀況,并以轉(zhuǎn)pGBKT7(BD)空載轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌為陰性對照,如果在SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基中均能生長,說明TaMYB5-like蛋白具有自激活效應(yīng),如果在SD/-Trp上可以生長,而不能在SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上生長,則表明TaMYB5-like蛋白沒有自激活能力。

將TaMYB5-like蛋白質(zhì)序列輸入Smart在線數(shù)據(jù)庫,預(yù)測其結(jié)構(gòu)域。將TaMYB5-like截斷成N端+SNAT結(jié)構(gòu)域和C端以及N端和SNAT結(jié)構(gòu)域+C端,分別將其與pGBKT7連接,構(gòu)建相應(yīng)的重組載體BD-TaMYB5-like-SANT-C和BD-TaMYB5-like-N-SANT;參照上述乙酸鋰方法將上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母感受態(tài)細胞,接種至SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上觀察生長狀況,明確兩個截斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的自激活特征,為下一步篩選TaMYB5-like互作蛋白提供一定的理論和技術(shù)支撐。

1.2.6 TaMYB5-like蛋白及TaMYB5-like-N-SANT結(jié)構(gòu)蛋白自激活能力研究

為了進一步研究TaMYB5-like蛋白及TaMYB5-like-N-SANT結(jié)構(gòu)蛋白自激活能力,分別向不同SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基中加入5個不同濃度梯度的金擔(dān)子素A (AbA)和3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)(AbA 10 mmol·mL-1+3-AT 200 mg·mL-1;AbA 20 mmol·mL-1+3-AT 400 mg·mL-1;AbA 30 mmol·mL-1+3-AT 600 mg·mL-1;AbA 40 mmol·mL-1+3-AT 800 mg·mL-1;AbA 50 mmol·mL-1+3-AT 1 000 mg·mL-1),同時將轉(zhuǎn)化有BD-TaMYB5-like和BD-TaMYB5-like-N-SANT重組載體的Y2HGold酵母感受態(tài)細胞分別接入上述固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并觀察其生長狀態(tài),直至菌斑長勢與轉(zhuǎn)有pGBKT7空載的Y2HGold酵母菌相同。根據(jù)AbA和3-AT濃度判斷轉(zhuǎn)化有BD-TaMYB5-like和BD-TaMYB5-like-N-SANT重組載體的酵母Y2HGold感受態(tài)細胞的自激活能力。

1.2.7TaMYB5-like基因表達模式分析

設(shè)計特異性引物TaMYB5-like-F6/TaMYB5-like-R6(表1),以PHYMS-1376和CK-1376小麥四分體時期、單核早期、單核晚期、二核期和三核期花藥cDNA為模板,參照StarLighter SYBR Green qPCR Mix(FS-Q1002,北京啟衡星)試劑盒配置PCR反應(yīng)體系,置于Quant Studio 3實時熒光定量PCR儀(ABI,美國)上進行反應(yīng)。程序為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán),溶解曲線分析采用系統(tǒng)默認值。運用2-△△CT法計算TaMYB5-like相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 12.0 分析,采用LSD法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaMYB5-like序列分析

以小麥CK-1376三核期花藥cDNA為模板,擴增到800 bp左右的條帶(圖1a),測序結(jié)果顯示,該產(chǎn)物為819 bp,與TraesCS3B02G290600.1編碼區(qū)序列一致,即為TaMYB5-like基因。對TaMYB5-like序列進行分析發(fā)現(xiàn),TaMYB5-like基因含有2個外顯子和1個內(nèi)含子,編碼272個氨基酸,5′-UTR區(qū)長度為108 bp,3′-UTR區(qū)長度為206 bp(圖1b)。

2.2 小麥TaMYB5-like的結(jié)構(gòu)分析

TaMYB5-like蛋白分子量為29.36 KDa,PI=6.18,在28～129 bp內(nèi)含有一個由3個串聯(lián)重復(fù)(螺旋-旋轉(zhuǎn)-螺旋方式排列)序列構(gòu)成的SANT結(jié)構(gòu)域。亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn),TaMYB5-like被定位在細胞核。TaMYB5-like蛋白二級結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)有56.22%α螺旋(alpha helix),11.30%的延伸鏈(extended strand),5.72%的β轉(zhuǎn)角(beta turn),26.75%的無規(guī)卷曲(random coil);脂肪族氨基酸指數(shù)為68.27,其中α螺旋含有大量芳香殘基。TaMYB5-like蛋白的三級結(jié)構(gòu)與R2R3-MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子的三維結(jié)構(gòu)模型高度相似,生物單位寡核苷酸狀態(tài)以單體形式存在(圖2a和圖2b)。TaMYB5-like蛋白平均親水性(GRAVY)值為 -0.603,氨基酸折疊彈性較大,不穩(wěn)定指數(shù)(II)為55.28,負電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)為36,正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)為33(圖2c)。TaMYB5-like蛋白既沒有跨膜結(jié)構(gòu),也沒有信號肽。對TaMYB5-like啟動子區(qū)進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)該啟動子區(qū)順式作用元件大都與光響應(yīng)和赤霉素、脫落酸響應(yīng)有關(guān)(表2)。利用MEGA對TaMYB5-like基因作進化樹分析,發(fā)現(xiàn)TaMYB5-like基因與二粒小麥(Triticumdicccoides)和硬粒小麥(Triticumturgidum)親緣關(guān)系最近(圖3)。TaMYB5-like基因的同源序列較多,在A、B、D同源染色體上相對保守,其中在擬南芥、水稻等模式植物中也均能擴增出SANT結(jié)構(gòu)域,且高度保守(圖4),表明不同物種TaMYB5-like進化較為保守。

a:TaMYB5-like蛋白的二級結(jié)構(gòu),藍色代表α-螺旋,綠色代表β-轉(zhuǎn)角,紅色代表延伸鏈,紫色代表無規(guī)則卷曲;b:TaMYB5-like蛋白的三維結(jié)構(gòu);c:TaMYB5-like蛋白的親/疏水性分析。a:Secondary structure of TaMYB5-like protein; blue, green, red, and purple lines representα-helix, β-turn, extended chain, and randomcoil, respectively; b:Tertiary structure of TaMYB5-like protein; c:Hydrophilic and hydrophobic of TaMYB5-like protein.圖2 TaMYB5-like的蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)及親/疏水性分析Fig.2 Analysis of secondary, tertiary structures and hydrophobicity of TaMYB5-like protein

圖3 TaMYB5-like蛋白的進化樹分析Fig.3 Phylogeny analysis of TaMYB5-like protein

圖4 TaMYB5-like蛋白的同源序列比對Fig.4 Homologous sequence alignment of TaMYB5-like protein

表2 TaMYB5-like基因上游啟動子區(qū)順式作用元件Table 2 Cis-element in the upstream regulation region ofTaMYB5-like

表3 PHYMS-1376和CK-1376花藥中TaMYB5-like的相對表達量Table 3 Relative expression ofTaMYB5-like in anther from CK-1376 and PHYMS-1376

2.3 小麥TaMYB5-like亞細胞定位分析

轉(zhuǎn)化有TaMYB5-like-pCAMBIA 1302-2×Myc-EGFP重組載體的煙草葉片細胞中綠色熒光信號主要集中在細胞核內(nèi),轉(zhuǎn)化有空載pCAMBIA 1302-2×Myc-EGFP的陰性對照煙草葉片細胞核和細胞膜中綠色熒光信號都較強(圖5),表明TaMYB5-like屬于核表達基因,其編碼蛋白定位于細胞核內(nèi)。這與Plant-mPLoc在線軟件預(yù)測結(jié)果一致。

圖5 TaMYB5-like的蛋白的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of TaMYB5-like protein.

2.4 TaMYB5-like自激活性分析

將pGBKT7(BD)空載和BD-TaMYB5-like分別轉(zhuǎn)入至酵母感受態(tài)細胞,并將其分別接種至SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)有陰性對照BD空載的酵母菌株只能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長,不能在SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上生長(圖6);而轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like重組載體的酵母菌株既能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長,同時也能在SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上生長,表明TaMYB5-like蛋白有一定的自激活效應(yīng)。為了進一步了解TaMYB5-like自激活結(jié)構(gòu)區(qū),將TaMYB5-like蛋白的氨基酸序列按照功能域位置進行截斷,其中N端+SANT結(jié)構(gòu)域長度為393 bp,SANT結(jié)構(gòu)域+C端序列長度為747 bp(圖7a),分別將N端+SANT結(jié)構(gòu)域和SANT結(jié)構(gòu)域+C端連接到pGBKT7載體,并分別轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細胞后,觀察BD-TaMYB5-like-N-SANT重組質(zhì)粒的酵母菌株和 BD-TaMYB5-like-SANT-C重組質(zhì)粒的酵母菌株在SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His酵母培養(yǎng)基上的生長情況,結(jié)果顯示,在SD/-Trp培養(yǎng)基上分別轉(zhuǎn)有陰性對照BD、BD-TaMYB5-like-N-SANT以及 BD-TaMYB5-like-SANT-C質(zhì)粒的酵母菌株均能生長,且長勢相類似,而在SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上,僅轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like-N-SANT重組載體的酵母菌株能生長,而轉(zhuǎn)有陰性對照BD和BD-TaMYB5-like-SANT-C重組載體的酵母菌株不能正常生長,表明TaMYB5-like蛋白的自激活區(qū)段位于N端,且后續(xù)互作蛋白篩選工作可以使用SANT+C端結(jié)構(gòu)域區(qū)段(圖7b)。

圖6 TaMYB5-like蛋白的自激活驗證Fig.6 Self-activation validation of TaMYB5-like protein

圖7 TaMYB5-like蛋白的截斷處理Fig.7 Truncation the amino acid sequence of TaMYB5-like protein

2.5 TaMYB5-like蛋白及TaMYB5-like-N-SANT結(jié)構(gòu)蛋白自激活能力分析

使用3-AT和AbA分別對TaMYB5-like蛋白全長及BD-TaMYB5-like-N-SANT的自激活活性進行抑制,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)有空載BD的酵母菌株在SD/-Trp/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上不能生長;而轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like重組載體的酵母菌株分別在含有AbA 10 mmol·mL-1+3-AT 200 mg·mL-1、AbA 20 mmol·mL-1+3-AT 400 mg·mL-1、AbA 30 mmol·mL-1+3-AT 600 mg·mL-1、AbA 40 mmol·mL-1+3-AT 800 mg·mL-1抑制劑的SD/-Trp/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上均能生長,但隨二者濃度增加長勢逐漸減弱;AbA 50 mmol·mL-1,3-AT 1 000 mg·mL-1時,含BD-TaMYB5-like重組載體和空載BD的酵母菌株均不能生長。轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like-N-SANT重組載體的酵母菌株在AbA 30 mmol·mL-1,+3-AT 600 mg·mL-1的SD/-Trp/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上生長暗淡,與轉(zhuǎn)有BD空載的酵母菌株生長勢一致。隨著抑制劑濃度的增加,轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like-N-SANT重組載體的酵母菌株不能在SD/-Trp/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上生長。綜上所述,AbA 50 mmol·mL-1+3-AT 1 000 mg·mL-1條件下,轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like重組載體的酵母菌株在SD/-Trp/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上無自激活性;AbA 30 mmol·mL-1+3-AT 600 mg·mL-1條件下,轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like-N-SANT重組載體的酵母菌株在SD/-Trp/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上無自激活性,表明適合濃度的AbA和3-AT可以抑制不同類型融合蛋白的自激活性,且隨著蛋白質(zhì)氨基酸序列的截斷,自激活活性呈降低趨勢(圖8a和圖8b)。

a:不同濃度AbA和3-AT抑制攜帶BD-TaMYB5-like重組載體的酵母菌株生長狀況;b:不同濃度ABA和3-AT抑制攜帶BD-TaMYB5-like-N-SANT重組載體的酵母菌株生長狀況。a:Growth of yeast strains with the BD-TaMYB5-like recombinant vector were inhibited by AbA和3-AT of different concentrations; b:Growth of yeast strains with the BD-TaMYB5-like-N-SANT recombinant vector were inhibited by AbA and 3-AT of different concentrations.圖8 TaMYB-like蛋白的全長與N+SANT結(jié)構(gòu)域抑制Fig.8 Full length of TaMYB-like protein and the N+SANT domain inhibited by AbA and 3-AT with different concentrations

2.6 小麥TaMYB5-like表達模式分析

以小麥PHYMS-1376和CK-1376四分體、單核早期、單核晚期、二核期和三核期花藥cDNA為模板,利用qRT-PCR技術(shù)對TaMYB5-like基因表達模式進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TaMYB5-like基因在PHYMS-1376和CK-1376五個發(fā)育時期花藥中表達趨勢一致;與CK-1376相比,PHYMS-1376在四分體和單核早期的TaMYB5-like基因表達差異不顯著,在單核晚期、二核期和三核期的TaMYB5-like表達量顯著增加;CK-1376和PHYMS-1376在三核期的TaMYB5-like表達量均最高。

3 討論

優(yōu)良的小麥雄性不育系是推動雜交小麥產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的重要基礎(chǔ),因此小麥雄性不育機理研究備受業(yè)界關(guān)注。本課題組具有自主知識產(chǎn)權(quán)的小麥化學(xué)雜交劑SQ-1目前已在進行雜交小麥的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用,但因其生產(chǎn)成本較高,難以大面積推廣。因此,需系統(tǒng)解析小麥化學(xué)雜交劑SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育機理,并據(jù)此創(chuàng)制安全廉價高效的新型小麥化學(xué)雜交劑?；诖?對課題組前期篩選獲得的TaMYB5-like進一步研究發(fā)現(xiàn),TaMYB5-like基因DNA片段全長為5 207 bp,cDNA長1 133 bp,其中CDS序列長為819 bp,編碼蛋白具有SANT保守結(jié)構(gòu)域,發(fā)揮著DNA結(jié)合和催化作用,并參與基因的表達。將TaMYB5-like蛋白序列在模式植物擬南芥數(shù)據(jù)庫和水稻數(shù)據(jù)庫中進行Blastp比對,發(fā)現(xiàn)其與模式植物擬南芥和水稻中的MYB5基因同源性最高,推測TaMYB5-like與MYB5基因在某些過程中有相似的生物學(xué)功能,如聶 珂[15]在蓮霧果實木質(zhì)素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn),SsMYB5作為轉(zhuǎn)錄抑制子,可延緩木質(zhì)素的合成。本研究通過并比對發(fā)現(xiàn),TaMYB5-like屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子,可能在植物發(fā)育過程中對育性的正常調(diào)節(jié)具有阻礙作用。

酵母雙雜交是研究活細胞內(nèi)蛋白與蛋白互作的一項技術(shù),該技術(shù)在生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[16]。為降低假陽性,通常在酵母雙雜交試驗開展之前對所研究蛋白質(zhì)需進行自激活性研究。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like重組載體的酵母菌株和轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like-N-SANT重組載體的酵母菌株均具有自激活效應(yīng),而轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like-SANT-C重組載體的酵母菌株不具有自激活效應(yīng),說明TaMYB5-like轉(zhuǎn)錄激活域在N端,這與王懷琴[17]對丹參轉(zhuǎn)錄因子SmMYC2的研究結(jié)果一致。而李立群[18]和吳國麗[19]發(fā)現(xiàn),激活域在蛋白的C端這差異可能由于所研究蛋白和功能不同。常見的自激活抑制劑是3-AT和AbA,不同基因所需濃度不同,如謝瑞瑩[20]研究中,僅用10 mmol·L-13-AT就能夠抑制HIS3報告基因表達,并且成功篩選到6個與NtMYB4a具有互作關(guān)系的蛋白;武 媛[21]使用20 mmol·L-1的3-AT抑制SlMPK1自激活活性,并且成功篩選到155種候選蛋白與SlMPK1相互作用;在劉 靜[22]的研究中,需要45 mmol·L-1的 3-AT才可以抑制蛋白BsMYB62的自激活張竹君[23]發(fā)現(xiàn)200 ng·L-1的AbA濃度對RhRD22無自激活效應(yīng),丁愛琴[24]使用400 ng·mL-1的AbA成功從cDNA文庫中篩選到16個與RhNAC31相互作用的候選蛋白。本研究對BD-TaMYB5-like和BD-TaMYB5-like-N-SANT重組載體自激活效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn),AbA 50 mmol·mL-1+3-AT 1 000 mg·mL-1條件下,轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like重組載體的酵母菌株在SD/-Trp/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上無自激活性;AbA 30 mmol·mL-1+3-AT 600 mg·mL-1條件下,轉(zhuǎn)有BD-TaMYB5-like-N-SANT重組載體的酵母菌株在SD/-Trp/-Ade/-His固體培養(yǎng)基上無自激活性。上述結(jié)果表明,適合濃度的AbA和3-AT可以抑制不同類型融合蛋白的自激活性,說明截斷處理與抑制劑處理對互作蛋白的篩選并無太大影響,這為繼續(xù)進行互作蛋白的篩選提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn),截斷之后的蛋白比全長的自激活活性低,這一結(jié)果目前還未見報道。

迄今已有多個MYB類家族成員基因在參與雄性不育的調(diào)節(jié)過程中被證實,比如R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子TDF1-1是調(diào)控大豆花藥發(fā)育的核心轉(zhuǎn)錄因子[25];甘藍OguCMS雄性不育相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子BoMYB1是花藥發(fā)育的關(guān)鍵基因之一,并且在花藥中高度表達。MYB轉(zhuǎn)錄因子CSA是水稻雄性生殖發(fā)育過程中糖分配的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其表達受抑制會導(dǎo)致水稻的雄性不育;MYB5與CSA有相似功能,對脂代謝、糖代謝等過程產(chǎn)生影響,造成水稻花藥發(fā)育異常并導(dǎo)致花粉最終的敗育[12,27]。小麥與水稻都是單倍體,且遺傳距離相近,推測TaMYB5與OsMYB5的生物學(xué)功能相似,可能參與生理型雄性不育花粉敗育過程。對TaMYB5-like進行表達模式分析,發(fā)現(xiàn)與CK-1376相比,PHYMS-1376四分體和單核早期花藥中TaMYB5-like基因表達差異不顯著,單核晚期、二核期和三核期時TaMYB5-like表達量顯著增加;二者在三核期花藥內(nèi)TaMYB5-like表達量均最高,推測TaMYB-like基因可能在單核晚期異常高表達導(dǎo)致了雄花敗育現(xiàn)象。這與黨一敏[28]和刁艷茹[29]對巴西橡膠樹的不育相關(guān)基因HbGEX1和HbACO1研究結(jié)果相似。推測TaMYB-like可能參與了SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育過程。

綜上所述,TaMYB5-like具有 MYB基因家族特征,屬于R2R3型MYB家族,定位于細胞核內(nèi),TaMYB5-like蛋白具有轉(zhuǎn)錄自激活活性,自激活區(qū)域定位在N端;用600 mg·mL-1的3-AT+30 mmol·mL-1的AbA可將其自激活性抑制。上述結(jié)果的獲得,為后續(xù)篩選TaMYB5-like蛋白互作蛋白,解析TaMYB5-like功能,闡釋SQ-1誘導(dǎo)小麥花粉敗育分子機制奠定了一定基礎(chǔ)。