雜色曲霉菌的分離鑒定及鵝源乳桿菌對其抑制作用研究

■ 陶燕子 王秋菊 王紀元 孟令瀅 李暢洋

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，黑龍江大慶 163319）

霉菌通過寄生或者腐生的方式在食品和飼料中生存，霉菌可產(chǎn)生毒素，其中，黃曲霉毒素對人體和動物健康的危害最大，除了常見的黃曲霉毒素有危害外，還有雜色曲霉毒素、煙曲霉毒素、玉米赤霉烯酮都是危害畜禽健康的物質(zhì)[1]。有研究表明，雜色曲霉毒素中由二呋喃環(huán)和氧雜蒽酮組成的基本結(jié)構(gòu)與黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)相似，雜色曲霉毒素的毒性不亞于黃曲霉毒素[2]。雜色曲霉毒素普遍存在于谷物類飼料中，在高溫、高濕情況下容易滋生霉菌，若霉菌在禽畜飼料中大量產(chǎn)生，對禽畜生產(chǎn)性能影響較大。禽畜食用霉變飼料或者吸入發(fā)霉墊料中的霉菌孢子，時間一長會導(dǎo)致禽畜患曲霉病。羅伊氏乳桿菌是一種異源發(fā)酵乳桿菌，具有調(diào)節(jié)腸道微生物群，消除炎癥的作用[3]。發(fā)酵乳桿菌作為乳酸菌也能促進畜禽生長，改善腸道內(nèi)環(huán)境[4]?，F(xiàn)市面上有許多乳酸菌制劑已經(jīng)成功代替抗生素被使用，菌制劑的應(yīng)用減少了抗生素殘留和動物耐藥問題。

如今益生菌防治霉菌受到重視，如何有效地防治霉菌的產(chǎn)生對人類健康和禽畜健康有著極其重要的意義。本試驗從發(fā)霉玉米中分離出雜色曲霉菌，并使用實驗室保存的發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌，檢測乳桿菌對雜色曲霉的抑菌性能，同時對分離的雜色曲霉的抗藥性進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）和羅伊氏乳桿菌（L.reuteri）由實驗室在鵝源中分離鑒定保存。雜色曲霉從發(fā)霉玉米中分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）、察氏培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、藥敏試驗瓊脂培養(yǎng)基均購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，乳酸酚棉藍染色液購于北京索萊寶科技有限公司，DL 2000 Marker購于TaKaRaq公司。

1.1.3 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272）購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PCR 基因擴增儀（GE9612T-S）購自杭州柏恒科技有限公司；電泳儀（DYY-6C）購自北京市六一儀器廠，光學(xué)顯微鏡購自寧波舜宇儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取發(fā)霉玉米10 g，用100 mL 無菌水攪勻作為原液，然后吸取1 mL 原液放置于離心管中，依次進行10、102、103、104、105、106、107、108倍的稀釋。分別取各濃度的稀釋液200 μL 涂布于高壓滅菌后的察氏培養(yǎng)基平板上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d。挑取單一菌落進行劃線培養(yǎng)，重復(fù)此步驟3～4 次，直到平皿上出現(xiàn)單一菌落為止[5-6]。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

肉眼觀察：通過肉眼觀察菌株的外部形態(tài)，觀察正面以及背面。

顯微鏡下觀察：在無菌操作臺中，于載玻片中央滴加1～2 滴乳酸酚棉藍染色，用一次性接種環(huán)，取一小塊菌落，將其放在50%的無水乙醇中浸潤，再用純水輕輕沖洗，隨后將沖洗后的菌絲放于染色液中，將菌絲分散開，加蓋潔凈的蓋玻片，輕輕按壓不要有氣泡，在光學(xué)顯微鏡低倍、高倍或油鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)。

1.2.3 煮沸法提取霉菌DNA

在1 mL離心管中加200 μL的生理鹽水，取純化好的單個菌落接到其中，使液體渾濁即可，12 000 r/min離心3 min，棄去上清液，加1 mL 的生理鹽水混勻，12 000 r/min 離心3 min 棄去上清，清洗過程重復(fù)2～3 次。在清洗后的管中加100 μ L 的生理鹽水離心5 min。放入鍋中煮沸20 min或以上，離心12 000 r/min，15 min。取上清液加到新的離心管中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 曲霉分離菌株的PCR鑒定

菌株采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔通用的引物。上游引物序列ITS5：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，下游引物序列ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

PCR 反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模板DNA1 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性90 s，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，陽性樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，待結(jié)果返回進行分析。

1.2.5 測序及序列分析

將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫上的菌序列進行blast比對分析，找出與其相似性最高的菌株。用MEGA-64軟件對其序列進行分析，構(gòu)建進化樹，比較其同源性。將序列分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合進行綜合鑒定。

1.3 雜色曲霉孢子懸濁液的制備

將純化后的雜色曲霉接種在PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，待菌株孢子成熟，在培養(yǎng)基中加入適量無菌水，用接種環(huán)輕輕將孢子刮取下來，用8 層無菌紗布過濾菌絲，將過濾后的孢子液收集在離心管中，3 000 r/min 離心5 min，加入無菌磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌，重復(fù)3 次，完成后用細胞計數(shù)板在顯微鏡下進行計數(shù)，用無菌的PBST 將雜色曲霉孢子液濃度調(diào)整到1×108CFU/mL備用[7-8]。

1.4 雜色曲霉生長抑制試驗

將活化好的發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌濃度調(diào)整在1×108CFU/mL，將兩種菌按1：1 混合，制成發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的混合菌液[9]，即混合乳桿菌組。將滅菌牛津杯分別放置于涂有雜色曲霉菌的PDA 培養(yǎng)基上，并讓底部與培養(yǎng)基表面貼合。每個牛津杯內(nèi)加入200 μL 的發(fā)酵乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、混合乳桿菌，每組菌做3 個重復(fù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h 后測量抑菌圈，以抑菌圈直徑（DIZ）大小判斷抑菌活性。判定標準：DIZ≥15mm，指示致病菌對益生菌高度敏感；10 mm≤DIZ＜15 mm，指示致病菌對益生菌中度敏感；6 mm≤DIZ＜10 mm，指示致病菌對益生菌低度敏感；DIZ＜6 mm，指示致病菌對益生菌不敏感[10]。

1.5 雜色曲霉菌藥敏試驗

藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法（Kirby-Bauer disc diffusion method，K-B 法），選擇S1099 成套藥敏片四環(huán)素、新霉素、紅霉素等作為試驗藥物。將濃度為1×108CFU/mL的雜色曲霉孢子液取100 μL涂布在瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌鑷子將藥敏片貼到培養(yǎng)基表面，輕輕壓實，每種藥敏片做3個重復(fù)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。參考美國臨床和實驗室標準協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的判定方法，根據(jù)抑菌圈的直徑（Φ）大小判定其藥物敏感性，對應(yīng)標準分別為：Φ≥20 mm為敏感（S），15 mm≤Φ＜20 mm為中度耐藥（I），Φ＜15 mm為耐藥（R）[11]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析（oneway ANOVA），用“平均值±標準誤差（SEM）”表示，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

肉眼觀察菌落呈淡綠色，外圈呈白色，中圈呈深綠色，內(nèi)圈呈淡綠色，直徑2～3 cm，絨狀，如圖1A。經(jīng)乳酸酚棉藍染色在40 倍顯微鏡下可看到孢子呈放射狀，如圖1B。

圖1 分離菌株4號菌形態(tài)

2.2 霉菌rDNA-ITS序列分析結(jié)果

選擇真菌通用引物ITS/ITS4對分離菌株4號霉菌的rDNA-ITS 進行特異性擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2 所示，4 號菌的rDNAITS序列PCR產(chǎn)物片段在500～700 bp，產(chǎn)物條帶單一，濃度高，與ITS序列條帶相符。

圖2 4號霉菌的PCR產(chǎn)物電泳圖

據(jù)圖3所示，分離菌株4號菌與MH869201.1雜色曲霉菌（Aspergillus versicolor）處于同一分支并且遺傳距離最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)與ITS 結(jié)果進行分析，分離菌株4號菌為雜色曲霉菌。

圖3 分離菌株4號菌基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 雜色曲霉生長抑制結(jié)果

由表1和圖4可知，在相同條件下培養(yǎng)24 h后，雜色曲霉菌對羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、混合乳桿菌高度敏感。羅伊氏乳桿菌和混合乳桿菌組對雜色曲霉生長菌落抑菌圈直徑均大于發(fā)酵乳桿菌，且差異顯著（P＜0.05）；羅伊氏乳桿菌和混合乳桿菌組對雜色曲霉菌落生長抑菌圈直徑差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同類型的益生菌對雜色曲霉菌抑菌圈直徑（n=3）

圖4 三個處理組對雜色曲霉的抑菌試驗

2.4 雜色曲霉菌藥敏試驗

每種藥物進行3個重復(fù)，根據(jù)CLSI藥敏試驗判定標準，結(jié)果如表2 所示，分離的雜色曲霉菌株對頭孢曲松、米諾環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、頭孢拉定和氨芐西林耐藥，對其他14種藥物敏感（表2）。

表2 雜色曲霉菌藥敏試驗結(jié)果（n=3)

3 討論

3.1 雜色曲霉的分離鑒定

雜色曲霉屬于一類氧雜蒽酮類化合物，在飼糧的儲存期間易產(chǎn)生，不僅會引起工業(yè)器材出現(xiàn)霉腐現(xiàn)象，還會引起動物肝臟損傷和癌變發(fā)生[12]。據(jù)14C 示蹤技術(shù)文獻報道，雜色曲霉毒素在某種情況下會轉(zhuǎn)變?yōu)辄S曲霉毒素B1[13-14]。它的結(jié)構(gòu)跟黃曲霉毒素相似，它的毒性和致癌性也是不容小覷的[15]。有資料顯示，在1954年，首次從雜色曲霉培養(yǎng)物中分離出一種微黃色針狀晶體有毒化合物，這種物質(zhì)由二呋喃環(huán)和氧雜蒽酮組成。有學(xué)者認為，雜色曲霉毒素導(dǎo)致癌癥的原因是二呋喃環(huán)末端的雙鍵與DNA分子的尿嘧啶形成加合物，使DNA結(jié)構(gòu)改變，復(fù)制錯誤，損害DNA[16-17]。

本研究中對發(fā)霉玉米儲存中產(chǎn)生的霉菌進行分離純化，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)基下的真菌形態(tài)特征、顯微鏡下觀察、PCR 擴增和rDNA-ITS 序列檢測方法分離出雜色曲霉菌[18-20]。分離的4 號菌的rDNA-ITS 序列PCR產(chǎn)物片段在500～700 bp，與ITS序列條帶相符，經(jīng)比對最后判斷為雜色曲霉菌。

3.2 益生菌對雜色曲霉菌抑制作用

發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌都是屬于益生菌，現(xiàn)在許多益生菌都具有抑制有害菌生長的作用。徐丹等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌對霉菌有較好的抑制作用，全菌液的抑制效果優(yōu)于上清液或沉淀液。劉春娟等[22]研究表明，羅伊氏乳桿菌是具有抑制青霉菌能力的優(yōu)勢菌株。發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌對雜色曲霉的抑制作用，發(fā)酵乳桿菌會產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)[23]，羅伊氏乳桿菌則是靠其代謝產(chǎn)物羅伊氏菌素發(fā)揮作用，羅伊氏菌素可以抑制多種有害菌如沙門氏菌等[24]。本試驗結(jié)果表明，通過發(fā)酵乳桿菌和羅伊氏乳桿菌以及混合乳桿菌對雜色曲霉菌進行抑菌試驗檢測，發(fā)現(xiàn)3 組的培養(yǎng)基上都有抑菌圈，其中羅伊氏乳桿菌與混合乳桿菌組抑制效果較好，有明顯的抑菌圈。發(fā)酵乳桿菌對雜色曲霉菌的抑菌圈雖然比較小，但結(jié)果也可以說明發(fā)酵乳桿菌具有抑制霉菌的作用，可以作為抑制飼料霉菌添加劑使用。

3.3 雜色曲霉藥敏試驗

關(guān)于雜色曲霉藥敏試驗，本試驗使用了常用20種抗生素藥物進行藥敏試驗，結(jié)果表明，該分離的雜色曲霉菌株對頭孢曲松、米諾環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、頭孢拉定和氨芐西林耐藥，對其他14 種藥物敏感，表明雜色曲霉對14 種抗生素表現(xiàn)出非典型耐藥性。其中，環(huán)丙沙星對雜色曲霉的抑菌圈最大，紅曲霉、頭孢呋辛、四環(huán)素的抑菌圈較小，可以看出絕大多數(shù)抗生素藥物是可以抑制雜色曲霉的生長，可以為探究抗霉藥物的使用提供一定的參考。

4 結(jié)論

本研究分離了一株雜色曲霉菌，并采用牛津杯法評估了兩株乳桿菌及混合乳桿菌對雜色曲霉菌的抑制作用，結(jié)果顯示，3個處理組對雜色曲霉均具有抑制作用，并且高度敏感，其中，混合乳桿菌組抑菌效果較好，這可以為抑制飼料發(fā)霉提供數(shù)據(jù)參考。