腸嗜鉻細(xì)胞驅(qū)動內(nèi)臟疼痛和焦慮機(jī)制

胃腸道表面覆蓋一層薄上皮細(xì)胞，其中包含少量的多功能的腸內(nèi)分泌細(xì)胞，它們通過釋放激素和神經(jīng)遞質(zhì)來調(diào)節(jié)諸如營養(yǎng)物質(zhì)吸收、消化、蠕動、攝食行為和感知覺等功能。腸嗜鉻 (enterochromaffin,EC) 細(xì)胞是一類獨特的腸內(nèi)分泌細(xì)胞亞型，可以檢測引起或加劇疼痛的環(huán)境和內(nèi)源性刺激，包括飲食刺激物、微生物代謝產(chǎn)物、炎癥介質(zhì)、機(jī)械擴(kuò)張以及應(yīng)激相關(guān)的激素和神經(jīng)遞質(zhì)等。EC 細(xì)胞一旦被激活，就會釋放5-羥色胺(5-HT)并作用于鄰近表達(dá)5-HT3受體的感覺神經(jīng)末梢上，將傷害性刺激信號傳遞到脊髓。腸道受到不同類型的脊髓傳入神經(jīng)的支配，包括對拉伸不敏感的黏膜神經(jīng)和支配肌肉、血管或腸系膜并在一定閾值范圍內(nèi)對擴(kuò)張有反應(yīng)的神經(jīng)。目前，EC 細(xì)胞及其鄰近的黏膜傳入神經(jīng)在多大程度上參與急性或慢性內(nèi)臟疼痛及其性別差異仍不清楚。該研究通過沉默或激活小鼠的EC 細(xì)胞對這些問題進(jìn)行探究，并評估其對結(jié)腸感覺神經(jīng)活動、內(nèi)臟敏感性及行為的影響。

源于細(xì)菌的短鏈脂肪酸可以激活腸內(nèi)分泌細(xì)胞，其中異戊酸 (isovalerate, ISV) 在內(nèi)臟高敏人群中的水平升高，提示其可能參與痛覺過敏。研究表明，在體外神經(jīng)-腸道標(biāo)本模型中異戊酸通過G 蛋白偶聯(lián)受體Olfr558 來激活EC 細(xì)胞，以5-HT 依賴的方式引起初級傳入神經(jīng)纖維的機(jī)械痛覺敏化。鑒于EC 細(xì)胞和感覺神經(jīng)都具有機(jī)械敏感性，為了驗證異戊酸是否使神經(jīng)纖維對其他非機(jī)械刺激變得敏感，該研究首先使用光遺傳學(xué)方法激活Nav1.8+感覺神經(jīng)元（其在支配結(jié)腸的脊髓傳入神經(jīng)中占95%以上）。在Nav1.8-ChR2 雄性小鼠的離體神經(jīng)-腸組織標(biāo)本上施加異戊酸，能夠增強(qiáng)黏膜傳入神經(jīng)對光刺激的敏感性。然而，雌性小鼠神經(jīng)纖維的基線反應(yīng)較雄性小鼠明顯更高（即使在最低光刺激強(qiáng)度下也是如此），且不能被異戊酸處理進(jìn)一步增強(qiáng)。因此，異戊酸介導(dǎo)的致敏作用并非特異性針對EC細(xì)胞或感覺神經(jīng)元的機(jī)械刺激，而是增強(qiáng)此環(huán)路的興奮性（以性別二態(tài)性的方式）。

Nav1.8-GCaMP6s 小鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)活體鈣成像顯示，雌性小鼠腰骶段DRG 神經(jīng)元的基線活性較雄性小鼠更強(qiáng)，表明支配內(nèi)臟靶器官（包括結(jié)腸）的神經(jīng)元活性更強(qiáng)。雄性小鼠結(jié)腸內(nèi)注射異戊酸能夠激活6.5%的神經(jīng)元，而雌性小鼠對異戊酸敏感的神經(jīng)元要少得多(2.2%)。在雄性小鼠中，5-HT3受體選擇性拮抗劑阿洛司瓊 (alosetron) 可以抑制異戊酸誘導(dǎo)的反應(yīng)，這一現(xiàn)象與異戊酸激活EC 細(xì)胞釋放5-HT 并隨后激活附近感覺神經(jīng)末梢上的5-HT3受體這一機(jī)制相吻合。然而，阿洛司瓊并沒有改變雌性小鼠對異戊酸敏感的神經(jīng)元的比例。為了確定異戊酸能否增強(qiáng)疼痛相關(guān)行為，檢測了小鼠結(jié)腸內(nèi)注射異戊酸后結(jié)直腸擴(kuò)張 (colorectal distension, CRD) 的反射運動。結(jié)果表明，在一定擴(kuò)張壓力范圍內(nèi)異戊酸增強(qiáng)了雄性小鼠內(nèi)臟運動反射 (visceromotor response, VMR)，而這一行為效應(yīng)在雌性小鼠中嚴(yán)重削弱。

為探究異戊酸的致敏作用是否由EC 細(xì)胞特異性介導(dǎo)，該研究利用了破傷風(fēng)毒素 (tetanus toxin from Clostridium tetani, TeNT) 抑制興奮性細(xì)胞的突觸囊泡融合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的能力。通過交叉遺傳學(xué)手段獲得了Pet1Flp;Tac1Cre系小鼠 (ECPFTox)，以實現(xiàn)在EC 細(xì)胞中特異性表達(dá)TeNT。為了驗證表達(dá)TeNT 的功能，使用異硫氰酸烯丙酯 (allyl-isothiocyanate, AITC) 激活EC 細(xì)胞表達(dá)的TRPA1 通道并刺激5-HT 釋放。與Tac1Cre對照組相比，AITC 引起ECPFTox組小鼠腸道類器官的5-HT 釋放大幅減少（約為30%）。ECPFTox小鼠血清的5-HT 水平也有降低，提示EC 細(xì)胞是外周5-HT 的主要來源之一。

在Tac1Cre對照組小鼠的離體腸道-神經(jīng)標(biāo)本中，異戊酸增強(qiáng)了黏膜感覺神經(jīng)對機(jī)械刺激的反應(yīng)，尤其是在雄性小鼠中。然而，在ECPFTox雄性或雌性小鼠的離體腸道神經(jīng)標(biāo)本均未觀察到這種敏化作用，從而證明異戊酸的致敏作用是通過EC細(xì)胞介導(dǎo)的。雌性ECPFTox小鼠基線VWR 反應(yīng)與對照組相比降低。與體外實驗結(jié)果一致，在ECPFTox小鼠中，結(jié)腸內(nèi)施加異戊酸對擴(kuò)張壓力引起的雄性小鼠VMR 的敏化作用消失了。結(jié)果證實EC 細(xì)胞在內(nèi)臟傷害性感受中發(fā)揮主要作用。此外，沉默EC 細(xì)胞對雌性小鼠有更大的影響，而雄性小鼠則表現(xiàn)出更強(qiáng)的異戊酸的致敏作用。結(jié)果提示，與雄性小鼠相比，EC 細(xì)胞-傷害性感受器環(huán)路在雌性中處于緊張性操控狀態(tài)從而具有較窄的動力學(xué)范圍。

該研究采用化學(xué)遺傳學(xué)方法探究EC 細(xì)胞的激活是否足以引起內(nèi)臟高敏。在EC 細(xì)胞上表達(dá)激活性DREADD 受體 (hM3Dq)，使其能夠被去氯氮平 (deschloroclozapine, DCZ) 或氯氮平N-氧化物(clozapine-N-oxide, CNO) 選擇性激活。將DREADD激動劑應(yīng)用于源自EChM3Dq小鼠的腸道類器官可導(dǎo)致EC 細(xì)胞的激活和5-HT 的釋放。此外，在DCZ處理15 分鐘后，EChM3Dq雌性小鼠（而不是雄性）的血清中5-HT 含量增加，并在30 分鐘后逐漸下降。DREADD 激動劑可以使EChM3Dq小鼠的神經(jīng)纖維對黏膜機(jī)械刺激的敏感性增強(qiáng)，而對Tac1Cre對照組小鼠無顯著影響，且這種致敏作用在雄性小鼠中更明顯。為了檢測內(nèi)臟過敏反應(yīng)，在結(jié)直腸擴(kuò)張實驗前15 分鐘給EChM3Dq小鼠注射DREADD 激動劑，結(jié)果表明雄性小鼠在一定范圍結(jié)腸壓力下VMR 顯著增加，而雌性小鼠的VMR 沒有顯著變化。給予阿洛司瓊阻斷了DCZ 介導(dǎo)的雄性小鼠VMR 的增強(qiáng)，這與在體實驗結(jié)果一致。總的來說，這些性別差異與如下觀念相一致，即EC 細(xì)胞-黏膜傳入神經(jīng)環(huán)路對雌性的結(jié)腸敏感性有更高的緊張性貢獻(xiàn)而對于增強(qiáng)反應(yīng)的窗口更窄。為了驗證持續(xù)的EC 細(xì)胞激活能否產(chǎn)生類似于在IBS 中觀察到的持續(xù)敏化，持續(xù)3 周每日給小鼠注射DCZ，并在停止給予DCZ 后72 小時評估結(jié)腸擴(kuò)張引起的VMR 反應(yīng)。結(jié)果顯示，相較于Tac1Cre對照組小鼠，EChM3Dq小鼠在藥物洗脫后仍然保持高敏感性，表明EC 細(xì)胞的激活足以驅(qū)動急性和持續(xù)性內(nèi)臟疼痛。

初級傳入神經(jīng)纖維終止于腸道的不同分層，包括黏膜、肌肉和血管腔室以及腸系膜。一般認(rèn)為，內(nèi)臟疼痛是由對擴(kuò)張敏感的低閾值和高閾值神經(jīng)纖維所驅(qū)動，而非對擴(kuò)張不敏感的黏膜傳入神經(jīng)。鑒于EC 細(xì)胞介導(dǎo)內(nèi)臟疼痛的必要性，為確定除了黏膜傳入神經(jīng)外，是否還有其他神經(jīng)受EC 細(xì)胞激活的影響，該研究使用了一種改良的離體神經(jīng)-腸道標(biāo)本模型，在這個模型中對完整的結(jié)腸環(huán)進(jìn)行加壓，可以激活對擴(kuò)張敏感的傳入神經(jīng)（包括低閾值、高閾值和廣動力域神經(jīng)纖維），這些傳入神經(jīng)負(fù)責(zé)檢測其感受區(qū)域內(nèi)的環(huán)向張力。支配黏膜層的傳入神經(jīng)不會在這種范式下產(chǎn)生反應(yīng)，從而能夠?qū)⑺鼈兣c其他傳入神經(jīng)區(qū)分開來。記錄實驗是在選擇性表達(dá)TeNT 或DREADD 受體的小鼠EC 細(xì)胞中進(jìn)行的。在對照組小鼠中，異戊酸不能增強(qiáng)支配非黏膜層的擴(kuò)張敏感傳入神經(jīng)的活性。ECPFTox雌性或雄性小鼠的離體神經(jīng)-腸道組織對結(jié)直腸擴(kuò)張的VMR 降低，在給予異戊酸之前或之后表現(xiàn)出正常的擴(kuò)張敏感神經(jīng)激活。對于EChM3Dq雌性和雄性小鼠的離體神經(jīng)-腸道組織，CNO 處理對擴(kuò)張敏感的神經(jīng)纖維沒有顯著影響。結(jié)果表明，內(nèi)臟疼痛的調(diào)節(jié)是由對擴(kuò)張不敏感的黏膜傳入神經(jīng)驅(qū)動的，這些纖維對局部組織變敏感，并直接與黏膜層中的EC 細(xì)胞相互作用。

功能性胃腸疾病通常與焦慮的增加有關(guān)。焦慮是影響腸-腦信號的雙向傳遞的復(fù)雜疼痛或感覺信息處理障礙的重要表征之一。因此，接下來通過高架十字迷宮進(jìn)一步探究慢性激活或者抑制EC 細(xì)胞是否會影響焦慮樣行為。結(jié)果顯示，經(jīng)過DCZ 處理的EChM3Dq小鼠在開放臂中停留時間較短，表明小鼠的焦慮樣行為增加。給予5-HT3受體拮抗劑阿洛司瓊逆轉(zhuǎn)DCZ 導(dǎo)致的焦慮樣行為增加。結(jié)果表明5-HT 能EC 細(xì)胞-黏膜傳入神經(jīng)信號在調(diào)節(jié)腸-腦通訊紊亂的傷害性感覺成分和情感成分發(fā)揮重要作用。此外，ECPFTox小鼠在開放臂中停留時間也較短，表明長期抑制EC 細(xì)胞活性，擾亂胃腸道功能，同樣具有致焦慮作用。

綜上所述，該研究闡明了腸內(nèi)分泌細(xì)胞與黏膜傳入神經(jīng)之間的相互作用，以及這種相互作用如何影響內(nèi)臟疼痛和焦慮。結(jié)果表明，EC 細(xì)胞和黏膜傳入神經(jīng)是與IBS、炎性胃腸道疾病或其他炎癥相關(guān)的內(nèi)臟疼痛和焦慮的關(guān)鍵誘發(fā)因素，凸顯了腸-腦軸在神經(jīng)胃腸病學(xué)中的重要性。此外，功能性胃腸疾病在女性中的發(fā)病率更高，該研究表明EC 細(xì)胞-黏膜傳入神經(jīng)在雌性小鼠的緊張性輸入更強(qiáng)。異戊酸或者急性化學(xué)遺傳學(xué)激活EC 細(xì)胞不能進(jìn)一步增加雌性小鼠的內(nèi)臟敏感性。因此，EC 細(xì)胞-黏膜傳入神經(jīng)增強(qiáng)的活性可能使得雌性內(nèi)臟疼痛的發(fā)病率更高。在EC 細(xì)胞鑒定性別特異性的分子和功能，可能會提供內(nèi)臟疼痛性別差異機(jī)制的新見解。此外，鑒于功能性胃腸疾病與增加的焦慮有關(guān)，選擇性5-HT再攝取抑制劑的治療可能通過其外周和中樞靶點對病人有雙重益處。