紅曲霉合成莫納克林K的研究進(jìn)展

張 嬋, 程 穎, 秦昱暉, 王海蛟, 王聰聰, 趙宇飛,王 蓓, 王成濤

(1.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院,北京 100048;2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048)

紅曲霉(Monascus)又稱紅曲菌[1],是一種典型的絲狀真菌,是我國重要的藥食兩用微生物資源之一,其發(fā)酵產(chǎn)品紅曲在我國及東南亞地區(qū)有上千年的應(yīng)用歷史,是我國傳統(tǒng)的特色出口產(chǎn)品之一。紅曲霉產(chǎn)生多種有益活性物質(zhì),廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、食品防腐、食品添加劑和中藥等領(lǐng)域[2]。

對于紅曲霉的相關(guān)研究也一直受到廣泛關(guān)注,特別是近30年來,關(guān)于紅曲霉的基礎(chǔ)研究發(fā)展迅速,并取得了豐碩的科研成果。以天然可食用的紅曲色素和降血脂的活性物質(zhì)莫納克林K(monacolin K,MK;又稱洛伐他汀)應(yīng)用最為廣泛[3]。MK是紅曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的具有降低膽固醇活性的次級代謝產(chǎn)物,在20世紀(jì)70年代末,由日本的 Endo[4]發(fā)現(xiàn),MK是與膽固醇合成相關(guān)的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGCR)的競爭性抑制劑,可抑制膽固醇合成過程中的關(guān)鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxymethylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶的活性,從而有效降低人體中膽固醇的合成量[5]。1987年9月1日,美國默克(Merck)公司研制的膽固醇合成抑制劑Mevacor(主要成分為MK)得到美國食品和藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)[6],此后利用紅曲霉加工合成MK受到研究者的關(guān)注。

據(jù)《中國心血管健康與疾病報(bào)告2020》,中國心血管疾病患者數(shù)量高達(dá)3.3億,高膽固醇血癥發(fā)生率正以驚人的速度增長,如何有效提高紅曲霉發(fā)酵MK的產(chǎn)量已成為紅曲發(fā)酵產(chǎn)業(yè)發(fā)展中必須解決的重要問題。

本研究從MK的生物合成途徑、功能、紅曲產(chǎn)品的開發(fā)及高產(chǎn)MK的方法等方面展開論述,希望可為紅曲霉廣泛應(yīng)用,開發(fā)綠色、安全的活性物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 紅曲霉產(chǎn)MK的合成途徑研究進(jìn)展

MK(分子式C24H36O5,相對分子質(zhì)量404,熔點(diǎn)157～159 ℃)在常態(tài)下為透明白色針狀晶體,易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、苯等有機(jī)溶劑,不易溶于水、正己烷、石油醚。紅曲霉中MK以內(nèi)酯式(閉環(huán)結(jié)構(gòu))和酸式(開環(huán)結(jié)構(gòu))2種形式存在,見圖1。酸式MK的結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)膽固醇合成途徑中HMG-CoA還原酶結(jié)構(gòu)相似,是HMG-CoA還原酶的競爭性抑制劑,可抑制膽固醇的合成。內(nèi)酯式MK需要被人體肝臟分泌的羥基酸酯酶轉(zhuǎn)化為酸式結(jié)構(gòu),才能夠發(fā)揮降膽固醇的作用[7]。酸式MK結(jié)構(gòu)對HMG-CoA還原酶抑制效果比內(nèi)酯式MK結(jié)構(gòu)的抑制效果更好。

圖1 Monacolin K的結(jié)構(gòu)式

1979年,日本學(xué)者Endo[4]從紅色紅曲霉菌株中分離出一種降血脂成分稱為MK;1980年,美國研究人員Alberts等[5]發(fā)現(xiàn),土曲霉(Aspergillusterreus)也能產(chǎn)生MK。對于MK的生物合成途徑、相關(guān)酶及基因的研究,最早認(rèn)識來源土曲霉[8],現(xiàn)階段在紅曲霉中MK的生物合成途徑相較于土曲霉中的研究較少[9-10]。土曲霉中MK的合成基因簇共包含18個(gè)基因[11],而叢毛紅曲霉(Monascuspilosus)中MK的合成基因簇包含9個(gè)基因,這些基因與土曲霉MK基因簇中的對應(yīng)基因高度同源[12]。

2005年,周禮紅[13]根據(jù)GenBank中公布的相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物(引物序列未公布),克隆得到紫色紅曲霉M34的monK1基因,敲除monK1后,MK合成途徑被中斷,即未產(chǎn)生MK。2008年,Chen等[14]利用土曲霉中l(wèi)ovB基因的保守序列為探針克隆一段DNA序列,長度共為45 kbp,經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn),該片段為一個(gè)包含與土曲霉MK合成基因高度同源的基因片段mokA-mokI的MK合成基因簇,推測mokA和mokB用于合成肽鏈骨架;還包括P450單氧酶基因(mokC),氧化還原酶基因(mokD),脫氫酶基因(mokE),轉(zhuǎn)酯酶基因(mokF),HMG-CoA還原酶基因(mokG),轉(zhuǎn)錄因子基因(mokH)及外排泵基因(mokI),見表1。Chen等[14]還利用基因打靶載體敲除叢毛紅曲霉BCRC38072中的mokA基因,以潮霉素抗性基因標(biāo)記,得到了44株轉(zhuǎn)化體,再經(jīng)DNA雜交技術(shù)篩選得到一株mokA基因敲除株BCRC38135,后經(jīng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證實(shí)其失去了生產(chǎn)MK的能力,研究證實(shí)了mokA參與MK合成中的作用。隨后,Sakai等[15]敲除叢毛紅曲霉中的mokB基因,通過HPLC分析叢毛紅曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物,結(jié)果顯示未檢測到MK,但檢測到MK的前體物莫納克林J(monacolin J,MJ)的存在,這說明mokB參與洛伐他汀二酮側(cè)鏈的合成。Chen等[16]又利用叢毛紅曲霉內(nèi)源的3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子的mokH超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化叢毛紅曲霉BCRC38072,篩選得到3個(gè)p基因多拷貝菌株。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),mokH基因多拷貝菌株合成MK的能力提高了2倍左右。而且,通過PT-PCR分析發(fā)現(xiàn),mokH基因多拷貝菌株中MK合成相關(guān)基因的表達(dá)均高于野生菌株,證實(shí)了mokH作為轉(zhuǎn)錄因子對MK合成的正調(diào)控作用。

表1 紅曲霉中的MK合成基因簇

大量研究表明,絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物的合成不僅受到生物合成途徑特異性調(diào)控因子的調(diào)節(jié),還可能受到全局性調(diào)控因子的調(diào)節(jié)。研究者們發(fā)現(xiàn)laeA編碼的調(diào)控因子對于曲霉屬的MK合成也具有調(diào)控作用。Bok等[17]研究了構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)的laeA基因?qū)υ谄洚愒幢磉_(dá)的MK合成基因的調(diào)控作用。研究表明,敲除laeA基因的菌株,lovC和lovE表達(dá)量明顯降低,MK的產(chǎn)量也隨之下降;而過量表達(dá)laeA基因的菌株lovC和lovE表達(dá)量顯著提高,MK的產(chǎn)量提高了4倍。紅曲霉中也存在類似的調(diào)控因子MplaeA。Zhang等[18]研究了紅曲霉中MplaeA的兩種mRNA(d-MplaeA和L-MplaeA)的選擇性拼接方式,發(fā)現(xiàn)MplaeA對紅曲霉MK的合成能力具有明顯的調(diào)控作用。

目前,關(guān)于紅曲霉合成MK的途徑只是推測與土曲霉MK合成途徑相似。MK是由紅曲霉聚酮體合成酶(polyketide synthase,PKS)調(diào)控合成的次級代謝產(chǎn)物[9,19],在合成過程中先形成中間體,依次轉(zhuǎn)化為莫納克林L(monacolin L,ML)、MJ,最后形成MK,基本過程如圖2。1)洛伐他汀九酮合成酶(lovastatin nonaketide synthase,LNKS)催化1分子丙二酰輔酶A依次與9分子乙酰輔酶A進(jìn)行縮合反應(yīng),最終生成MK的主體結(jié)構(gòu)—九酮體化合物(nonaketide)二氫莫納克林L(dihydromonacolin L),進(jìn)一步經(jīng)過氧化、脫水等步驟生成monacolin L,再經(jīng)單加氧酶催化發(fā)生羥基化反應(yīng)生成monacolin J;2)洛伐他汀二酮合成酶(lovastatin diketide synthase,LDKS)催化1分子丙二酰輔酶A與2分子乙酰輔酶A縮合,生成甲基丁酰輔酶A;3)在轉(zhuǎn)酯酶(transesterase)的作用下,甲基丁酰輔酶A通過酯鍵連接到monacolin J上,完成MK的合成[9-10,19-20]。

圖2 紅曲霉中MK合成途徑

2 紅曲霉產(chǎn)MK的生物活性及其應(yīng)用領(lǐng)域研究進(jìn)展

MK具有降脂功能,可通過抑制HMG-CoA還原酶活性,減少內(nèi)源性脂質(zhì)合成和外源性脂質(zhì)吸收,并促進(jìn)脂質(zhì)運(yùn)輸和排泄。除此之外,有研究發(fā)現(xiàn)MK還具有抗疲勞、抗菌、抗癌和保護(hù)神經(jīng)等生物活性[21-22]。多數(shù)研究結(jié)果顯示MK對肝癌、宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤均具有明顯的抑制作用,并與常見化療藥物具有顯著的協(xié)同作用。此外,MK具有抗病原細(xì)菌和真菌的生物活性。有研究表明,MK能夠通過抑制病原真菌麥角甾醇合成基因ERG11和ERG3的轉(zhuǎn)錄水平來抑制其生長,從而起到抗病原真菌的效果[23]。

Shi等[24]探究了MK對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的潛在抗腫瘤作用及其可能的分子機(jī)制。結(jié)果顯示,應(yīng)用10 μmol/L的MK抑制了U251細(xì)胞的增殖,抑制率高達(dá)53.4%。此外,MK誘導(dǎo)了活性氧的產(chǎn)生,并激活了線粒體介導(dǎo)的途徑,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)還原-氧化平衡的破壞。同時(shí),MK激活了MAPKs和NF-κB途徑,上調(diào)了P38活性,下調(diào)了JNK/ERK/P65/IκBα表達(dá),最終導(dǎo)致U251細(xì)胞凋亡。得出結(jié)論為MK可以通過觸發(fā)ROS介導(dǎo)的氧化損傷和調(diào)節(jié)MAPKs和NF-κB途徑誘導(dǎo)U251細(xì)胞的凋亡。

Zhang等[25]利用WGCNA(weighted gene co-expression network analysis)和CMap(connectivity map)軟件識別和驗(yàn)證可能對胃癌(gastric cancer,GC)患者產(chǎn)生積極影響的治療化合物:組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制劑——丙戊酸(valproic acid,VPA)和洛伐他汀。體外實(shí)驗(yàn)顯示VPA和洛伐他汀對胃癌細(xì)胞的生長具有劑量依賴性的抑制作用。胃癌細(xì)胞系中HDAC2過表達(dá),VPA和洛伐他汀均通過抑制HDAC2表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡,顯示洛伐他汀可能顯示出治療胃癌的潛力。

Zhang等[26]研究紅曲米對酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的影響作用,將C57/B6雄性小鼠每天灌胃4 g/kg體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇,連續(xù)8周誘導(dǎo)慢性ALD。實(shí)驗(yàn)組每天給予紅曲米150 mg·kg-1·d-1,結(jié)果顯示,補(bǔ)充紅曲米可顯著減輕酒精補(bǔ)充小鼠的高脂血癥、循環(huán)炎癥因子升高、肝臟結(jié)構(gòu)損傷和氧化應(yīng)激。此外,紅曲米顯著抑制酒精誘導(dǎo)的肝臟NF-κB活化和細(xì)胞凋亡。最終得到紅曲米主要通過減輕肝臟氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來預(yù)防ALD。Zou等[27]研究紅曲米對非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的保護(hù)機(jī)制。采用小鼠高脂飲食喂養(yǎng)模型和脂多糖及棕櫚酸刺激的HepG2細(xì)胞模型,通過檢測相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),探索NF-κB/NLRP3炎性體和mTORC1-SREBPs信號通路可能的分子機(jī)制。結(jié)果表明紅曲米在體內(nèi)和體外改善脂質(zhì)積累和肝臟炎癥,紅曲米通過調(diào)節(jié)mTORC1-SREBPs及其與甘油三酯和膽固醇合成相關(guān)的靶基因改善脂質(zhì)積累;還通過抑制NF-κB/NLRP3炎性體信號傳導(dǎo)來抑制肝臟炎癥。結(jié)論為調(diào)節(jié)NF-κB/NLRP3炎性體和脂質(zhì)合成可能有助于紅曲米對高脂型誘導(dǎo)的NAFLD的改善作用。

2.1 醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

1987年,洛伐他汀在美國上市,成為首個(gè)上市的調(diào)脂藥,是他汀類調(diào)脂的代表藥。紅曲米是紅曲霉固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)物。血脂康是一種以紅曲米為主要成分的中成藥,被列入中國心血管疾病一級預(yù)防指南[28]。Xu等[29]為評價(jià)含有紅曲的中成藥治療高脂血癥的療效,涉及1項(xiàng)4 824名受試者的47項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)。評估了3種不同的中國紅曲米補(bǔ)充劑(最常見的是血脂康600 mg,每日2次),結(jié)果顯示紅曲米與安慰劑相比顯著降低了低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇和甘油三酯。Kandelouei等[30]評估他汀類藥物對心血管疾病患者的C反應(yīng)蛋白和高敏C反應(yīng)蛋白,發(fā)現(xiàn)他汀類藥物降低血清中的高敏C反應(yīng)蛋白水平。Minamizuka等[31]研究低日劑量的紅曲米對輕度血脂異常患者的動脈硬化的影響。18名沒有已知心血管疾病、僅通過飲食療法控制的低密度脂蛋白膽固醇[(3.96±0.19) mmol/L]的患者被隨機(jī)分配接受含有2 mg MK的低劑量紅曲米(200 mg/d)或單獨(dú)飲食療法8周。結(jié)果顯示紅曲米組的患者表現(xiàn)出低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、載體蛋白B和血壓的明顯降低,而沒有任何公認(rèn)的不良反應(yīng)。這表明低日常劑量的紅曲米可以降低血脂異?；颊叩男难茱L(fēng)險(xiǎn)。

保健食品是一種具有調(diào)節(jié)身體機(jī)能,糾正身體的亞健康狀態(tài),使身體保持健康活力且對人體不產(chǎn)生危害性的功能性食品。覃愛紅等[32]將紅曲與芹菜膳食纖維、白藜蘆醇、核桃仁等物質(zhì)按一定比例加入,獲得食用安全,無副作用,可促進(jìn)人體正常排泄,并具有降膽固醇、降血脂和降血壓作用的保健食品。何曉磊等[33]將石榴作為原料進(jìn)行紅曲霉發(fā)酵獲得了果醋,該果醋營養(yǎng)豐富,具有一定的降糖、降脂、抗氧化功能。

2.2 飼料中的應(yīng)用

隨著人們對健康飲食和心血管疾病的重視,低膽固醇的畜禽產(chǎn)品備受關(guān)注。紅曲霉代謝產(chǎn)生的MK已被作為降低膽固醇的添加劑用于家禽生產(chǎn)中。崔培等[34]在喂養(yǎng)紅白錦鯉幼魚時(shí)添加紅曲米,結(jié)果表明飼料中添加紅曲米能顯著提高試驗(yàn)魚的增重率、特定生長率及飼料效率(P<0.05),且顯著降低試驗(yàn)魚血糖含量及血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活性(P<0.05),研究表明,在飼料中添加紅曲米能有效提高紅白錦鯉幼魚的生長性能,降低其血糖含量。陳冬[35]對紫色紅曲霉固態(tài)發(fā)酵玉米粉和豆粕的條件進(jìn)行探索,想要生產(chǎn)適合于蛋雞的紅曲功能性飼料,最終結(jié)果表明基礎(chǔ)日糧中添加紅曲霉發(fā)酵飼料可提高蛋雞產(chǎn)蛋率,降低料蛋比,有助于提升蛋雞的生產(chǎn)性能,可降低蛋雞血清甘油三酯和血清膽固醇含量。表明紅曲霉發(fā)酵飼料在蛋雞養(yǎng)殖中有較好的應(yīng)用潛力。

2.3 其他領(lǐng)域中的應(yīng)用

傅靜等[36]為了實(shí)現(xiàn)定向發(fā)酵洛伐他汀普洱茶,開發(fā)功能普洱茶產(chǎn)品,試驗(yàn)利用已篩選出的紅曲霉株M13制成固體發(fā)酵劑,外源接種該菌種進(jìn)行普洱茶發(fā)酵,結(jié)果表明,制備的普洱茶中洛伐他汀含量達(dá)到0.299 mg/g,得到富含洛伐他汀的普洱茶產(chǎn)品,得出了定向生產(chǎn)洛伐他汀普洱茶的加工工藝,對有益微生物在普洱茶發(fā)酵中的推廣應(yīng)用具有一定意義。

3 紅曲霉高產(chǎn)MK的生物技術(shù)方法研究進(jìn)展

Blanc等[37]在研究紅曲霉發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)有真菌毒素桔霉素的產(chǎn)生,攝入桔霉素可對腎臟、肝臟、心臟和生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用?；诖?紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)品的安全性,使紅曲霉工業(yè)化發(fā)展受到一定程度的限制。此外,紅曲霉產(chǎn)生的MK是安全、高效、低毒的降血脂物質(zhì),且在國內(nèi)外的市場需求量都很大。但天然紅曲霉產(chǎn)生的MK產(chǎn)量較低,不穩(wěn)定,限制了其應(yīng)用,如何提高紅曲霉的MK產(chǎn)量,并降低桔霉素的產(chǎn)量,是解決功能紅曲問題的重要途徑。

MK的產(chǎn)量和品質(zhì)由紅曲霉的菌種以及紅曲霉發(fā)酵工藝決定。紅曲霉生長有其特定的規(guī)律,根據(jù)紅曲霉菌種的生長規(guī)律選擇適宜的紅曲霉菌種和發(fā)酵條件,來確定其培養(yǎng)溫度、碳氮比和培養(yǎng)時(shí)間等,來實(shí)現(xiàn)MK高產(chǎn)[38]。高產(chǎn)MK的傳統(tǒng)方法有優(yōu)化培養(yǎng)基、控制環(huán)境因子、誘變育種或通過基因工程技術(shù)改造菌種。

3.1 誘變育種

桔霉素對紅曲類產(chǎn)品的污染嚴(yán)重影響了該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。篩選高產(chǎn)紅曲色素及MK且不產(chǎn)或低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉顯得尤為重要。常用的菌種改良手段是常規(guī)的誘變,其中包括紫外誘變和常壓室溫等離子誘變方式。Huang等[39]采用紫外照射和甲磺酸乙酯對紅曲霉進(jìn)行誘變研究。發(fā)現(xiàn)紫外光照射2 h后的紅曲霉(U-2)MK的產(chǎn)量,比紫外光照射10 h后的紅曲霉和經(jīng)甲磺酸乙酯處理的紅曲霉MK產(chǎn)量高得多。在最初的潛伏期,U-2菌株的MK產(chǎn)量異常低。孵育7 d后,細(xì)胞生長達(dá)到最大值1.1 g/L。在培養(yǎng)過程中,紅曲霉U-2的MK產(chǎn)量最高可達(dá)8 437.6 mg/kg。Dikshit等[40]用紫外照射或甲磺酸乙酯處理紅曲霉孢子,得到不產(chǎn)生紅曲色素和桔霉素的菌株,但其MK產(chǎn)量顯著高于原菌株。Kanpiengjai等[41]利用X-射線誘變紅曲霉,并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明在初始含水量為72.5%、發(fā)酵時(shí)間為38 d的條件下,MK產(chǎn)率可達(dá)6 428 mg/kg。

3.2 構(gòu)建工程菌株

隨著分子生物學(xué)理論知識的不斷完善和技術(shù)水平的持續(xù)提高,應(yīng)用于微生物領(lǐng)域的基因工程技術(shù)也已經(jīng)越來越成熟。基因工程是從20世紀(jì)70年代開始發(fā)展起來的新型生物技術(shù),在基因水平,用分子生物學(xué)的技術(shù)手段對基因進(jìn)行操縱、改變、重建、缺失、過表達(dá)等操作,從而使生物體的遺傳性狀按要求發(fā)生定向的變異。因其具有不受種屬限制、可根據(jù)需要有目的地進(jìn)行人為改造等優(yōu)點(diǎn),迅速成為工業(yè)微生物育種的重要手段。

Zhang等[42]對MK合成基因簇中mokC、mokD、mokE、mokI四段基因進(jìn)行過表達(dá),獲得了4株高產(chǎn)MK的菌株,產(chǎn)量較原始菌株分別提高了234.3%、220.8%、89.5%和10%。Lin等[43]在紅曲霉菌株CG-6中過表達(dá)mokE,使其MK產(chǎn)量顯著提高。林琳等[44]成功構(gòu)建了mokE基因過表達(dá)菌株,結(jié)果顯示,mokE基因的過表達(dá)不僅提高了MK的產(chǎn)量,還對紅曲霉菌絲體及孢子形態(tài)產(chǎn)生了一定影響。王嬌等[45]研究紅曲霉中orf5基因過表達(dá)對MK含量的影響,結(jié)果表明,過表達(dá)菌株的MK含量比對照明顯提高,高達(dá)36.89%。紅曲霉過表達(dá)orf5有利于增加MK的積累,為深入研究紅曲霉orf5基因的功能提供參考。Zhang等[46]研究了全局調(diào)節(jié)因子LaeA對紫色紅曲霉MK合成的影響,將LaeA過表達(dá)得到L3菌株,結(jié)果顯示MK產(chǎn)量比原始菌株提高了48.6%。

對于構(gòu)建高產(chǎn)MK的紅曲霉菌株,大多集中在對mokA-mokI基因的操作,相對紅曲色素的研究是較少的。所以需要加快對紅曲霉MK生物合成相關(guān)基因和酶的全面研究,更有利于深入理解紅曲霉MK的生物合成途徑,為應(yīng)用基因工程技術(shù)定向選育高產(chǎn)MK的紅曲霉菌株提供了基礎(chǔ)理論和技術(shù)手段。

3.3 優(yōu)化培養(yǎng)基

對于紅曲霉培養(yǎng)基條件的優(yōu)化,一般集中在碳氮源種類、添加量及比例、無機(jī)鹽的種類及添加量,還有一些外源添加物質(zhì)等。碳氮源是菌種發(fā)酵非常重要的成分,碳源為微生物提供能量及細(xì)胞碳鏈,氮源是構(gòu)成細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的主要成分,對微生物生長起重要作用。MK產(chǎn)率通常與穩(wěn)定階段氮源限制有關(guān),當(dāng)紅曲霉生長受到氮源限制產(chǎn)生抑制作用,可以利用多余的碳源產(chǎn)生次級代謝物,從而提高次級代謝物產(chǎn)量。

Liu等[47]研究紅曲霉固態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)MK的影響因素,通過7個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)、Plackette-Burman和Box-Benhnken設(shè)計(jì)試驗(yàn),探討MK生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。結(jié)果表明,初始水分(50%～55%)和麩皮含量(4.5%～5.5%)是紅曲霉固態(tài)發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵因素。Zhang等[48]使用不同谷物進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)小米作為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí),MK產(chǎn)量最高,其產(chǎn)量達(dá)到了7.12 mg/g,此外還對其他發(fā)酵條件以及外加碳源、氮源等進(jìn)行了優(yōu)化,使小米培養(yǎng)基在最佳條件下MK產(chǎn)量達(dá)到了19.81 mg/g,極大地提高了MK的產(chǎn)量。Suraiya等[49]研究發(fā)現(xiàn),用褐海藻Saccharinajaponica作為發(fā)酵基質(zhì),在最佳條件下MK產(chǎn)量可以達(dá)到13.98 mg/g,而且經(jīng)檢測發(fā)酵產(chǎn)生的MK具有較高的熱穩(wěn)定性、超氧化物歧化酶活性以及膽固醇抑制活性。Lin等[50]考察二價(jià)金屬陽離子Mn2+、Zn2+和Mg2+的濃度對紅曲霉的細(xì)胞生長和MK產(chǎn)量的影響,當(dāng)Mn2+、Zn2+、Mg2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.33%、0.16%、1.00%時(shí)MK增產(chǎn),質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到9.57 mg/g。

近幾年研究發(fā)現(xiàn),一些外源添加物如中藥薏米、玉米油等的添加,能較大幅度地提高食藥用菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,或是產(chǎn)生新的代謝物,采用外源添加物對代謝產(chǎn)物的生物合成進(jìn)行調(diào)控成為食藥用菌發(fā)酵調(diào)控的新策略和新手段。Zhang等[51]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加谷氨酸使得MK產(chǎn)量增加了3.5倍,上調(diào)相關(guān)基因mokB-mokI的表達(dá),增加了MK產(chǎn)量。通過掃描電鏡觀察紅曲霉菌絲形態(tài)發(fā)現(xiàn),谷氨酸顯著增加了紅曲霉菌絲的含量,改變了紅曲霉菌絲的通透性,增加了細(xì)胞中MK的分泌,從而提高了MK的產(chǎn)量。Huang等[52]發(fā)現(xiàn)亞油酸可能為群體感應(yīng)信號分子,56 μmol/L和512 μmol/L亞油酸可以上調(diào)mokH和mokA基因轉(zhuǎn)錄水平。特別是512 μmol/L亞油酸的添加,使紅曲霉的MK產(chǎn)量增加1.35倍。Zhang等[53]添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%精氨酸可提高M(jìn)K的產(chǎn)量,MK產(chǎn)量從94.6 mg/L 增加到228.4 mg/L,并且RT-qPCR結(jié)果顯示,mokA-mokI基因的表達(dá)均上調(diào)。

3.4 控制環(huán)境因子

影響紅曲霉發(fā)酵條件有培養(yǎng)基初始pH、接種量大小、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時(shí)間等。培養(yǎng)環(huán)境對于紅曲霉的生長和次級代謝物的產(chǎn)生至關(guān)重要,通常紅曲霉在18～45 ℃可生長,其最適培養(yǎng)溫度為30～38 ℃[54]。優(yōu)化這些參數(shù),可以改變紅曲霉的MK產(chǎn)量,從而達(dá)到MK高產(chǎn)的目的。

Pengnoi等[55]對紅曲霉固態(tài)發(fā)酵溫度進(jìn)行研究,表明在30 ℃下培養(yǎng)5 d,然后在25 ℃下培養(yǎng)到30 d,有助于產(chǎn)生更多的MK,分別是30 ℃和25 ℃恒溫培養(yǎng)的2.8倍和1.4倍。pH值對紅曲霉中酶的催化作用和細(xì)胞膜各種組分的運(yùn)輸有顯著影響,Mohan-Kumari等[56]發(fā)現(xiàn),在低酸(pH=5)發(fā)酵條件下MK產(chǎn)率顯著高于其他pH值,且對紅曲霉的生物量有顯著影響。研究者對紅曲霉與大米、小米、小麥、大麥等不同谷物進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵。結(jié)果表明,以小米為發(fā)酵基質(zhì)的MK產(chǎn)量最高(7.25 mg/g),而小麥(2.45 mg/g)和大麥(2.69 mg/g)吸水性差,菌絲不易生長,所以MK產(chǎn)量較低[48,57]。

Wen等[58]對紅曲霉發(fā)酵條件進(jìn)行總結(jié),發(fā)現(xiàn)變溫培養(yǎng)有利于提高M(jìn)K產(chǎn)量。由于紅曲霉細(xì)胞的生長發(fā)育與MK合成相關(guān)酶的最適溫度不同,生長發(fā)育和MK合成受變溫培養(yǎng)的分段調(diào)節(jié)。紅曲霉在30 ℃下孵育3～5 d,然后調(diào)整到大約25 ℃,會顯著提高M(jìn)K產(chǎn)量。對于培養(yǎng)基的初始pH值,控制在4～6為好。最佳條件為紅曲種子液的接種量不超過固態(tài)培養(yǎng)基的20%,發(fā)酵時(shí)間保持在15 d左右。

4 展 望

紅曲霉是食藥兩用的安全菌株,具有悠久的使用歷史,其代謝產(chǎn)物MK因其降血脂功能,被應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。近年來,心血管疾病的發(fā)病率和死亡率在全球均已躍居首位,主要是因?yàn)檠褐蟹e聚了過多的膽固醇。而MK作為降低膽固醇的有效成分,其研究與開發(fā)具有較大意義。因此,世界各國相繼以紅曲發(fā)酵產(chǎn)物開發(fā)各種治療藥物和保健食品。但是由于野生菌株MK產(chǎn)量不高及桔霉素超標(biāo)等問題限制其應(yīng)用。因此應(yīng)加大對紅曲霉及MK的研究,明確莫納克林類物質(zhì)合成代謝途徑和調(diào)節(jié)機(jī)制,以便進(jìn)一步控制和利用。這樣也有利于新型紅曲保健食品和降低膽固醇治療藥物的開發(fā),具有廣闊的市場和發(fā)展前景。