根系分泌物對(duì)生物強(qiáng)化修復(fù)PAHs污染土壤的影響

李瑜婷,鮑文秀,張 聞,王加寧,黃玉杰,宋繁永

根系分泌物對(duì)生物強(qiáng)化修復(fù)PAHs污染土壤的影響

李瑜婷,鮑文秀,張 聞*,王加寧,黃玉杰,宋繁永

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院),山東省科學(xué)院生態(tài)研究所,山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250103)

通過土壤微宇宙實(shí)驗(yàn),探究了生物強(qiáng)化對(duì)多環(huán)芳烴(PAHs)污染土壤的修復(fù)效果及根系分泌物對(duì)生物強(qiáng)化修復(fù)的影響.結(jié)果表明,向土壤中接種PAHs降解菌群(布魯氏菌(sp.)、蒼白桿菌(sp.)、鞘脂單胞菌(sp.)、克雷伯氏菌(sp.)和不動(dòng)桿菌(sp.))21d后, PAHs殘留量較對(duì)照下降了15.8%;在此基礎(chǔ)上添加黑麥草實(shí)際或模擬根系分泌物均顯著增強(qiáng)了生物強(qiáng)化修復(fù)效果, PAHs殘留量較對(duì)照分別下降了26.3%和24.6%. 3種生物強(qiáng)化措施均改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),其中添加根系分泌物后的處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變更大,芳烴降解基因豐度增加得更多,顯示根系分泌物通過促進(jìn)PAHs降解菌的生長(zhǎng)影響細(xì)菌群落從而提升生物強(qiáng)化修復(fù)效果.兩類根系分泌物對(duì)細(xì)菌群落影響的差別未引發(fā)其對(duì)生物強(qiáng)化促進(jìn)效果的差異.該研究可為優(yōu)化有機(jī)污染土壤生物強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)提供參考.

多環(huán)芳烴；土壤修復(fù)；黑麥草；根系分泌物；生物強(qiáng)化

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類具有致癌性、致畸性、致突變性以及環(huán)境持久性等特點(diǎn)的有機(jī)污染物[1-2],穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和疏水特性使其易于積累于土壤環(huán)境中,影響土壤的生態(tài)功能和農(nóng)作物的生產(chǎn)質(zhì)量,并可能進(jìn)入食物鏈對(duì)人類健康造成風(fēng)險(xiǎn)[3].在PAHs污染土壤諸多修復(fù)技術(shù)中,生物修復(fù)因環(huán)境友好、成本較低等優(yōu)點(diǎn)受到了廣泛關(guān)注[4].植物-微生物聯(lián)合修復(fù)是結(jié)合了植物根際修復(fù)和專性降解菌生物強(qiáng)化優(yōu)勢(shì)的一種生物修復(fù)方法,主要利用植物根系分泌物對(duì)降解微生物的降解強(qiáng)化作用,加速土壤PAHs的污染修復(fù)進(jìn)程[5-6].根際土壤中植物的根系分泌物可通過提供豐富的營(yíng)養(yǎng)或共代謝底物,提高土壤微生物的數(shù)量和活性,促進(jìn)PAHs的微生物降解[7-8].土壤中的微生物群落是影響PAHs生物修復(fù)效果的關(guān)鍵因素,群落優(yōu)勢(shì)物種組成、多樣性及結(jié)構(gòu)的變化會(huì)引發(fā)土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落功能和代謝的變化,進(jìn)而影響PAHs的去除[9-11].

不同植物的根系分泌物組分具有特異性,且植物受生長(zhǎng)周期、溫度、土壤性質(zhì)等因素影響,根系分泌物組分及分泌量會(huì)發(fā)生變化,作用范圍隨著離根系距離的增加而遞減,使得根際效應(yīng)具有復(fù)雜性,不易直接評(píng)估根系分泌物的作用.為厘清根系分泌物在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)中的作用機(jī)制,有學(xué)者通過種植植物獲取確定組分和濃度的根系分泌物后,與外源專性降解菌同時(shí)直接投加至土壤,研究其對(duì) PAHs 污染土壤微生物的影響,對(duì)PAHs去除效率的提高提出了多種作用機(jī)制,認(rèn)為細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變[12]及外源菌降解活性的增強(qiáng)[5]可促進(jìn)PAHs的降解.目前相關(guān)研究較為有限,投加的降解菌多為單一PAHs降解菌株,但實(shí)際污染場(chǎng)地生物強(qiáng)化修復(fù)一般使用具有協(xié)同作用的降解菌群.外源菌群進(jìn)入污染土壤后會(huì)與土著菌群競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng).課題組前期研究了根系分泌物對(duì)于芘污染土壤中土著細(xì)菌群落的影響,發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)菌群落的豐富度和多樣性影響不大,但對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響較為顯著,促進(jìn)了土著PAHs降解菌的生長(zhǎng)及部分功能基因豐度的增加.當(dāng)外源菌群與土著菌群競(jìng)爭(zhēng)共存時(shí),根系分泌物對(duì)整體土壤微生物群落產(chǎn)生怎樣的影響,鮮有報(bào)道,有必要明確.

假設(shè)外源菌群進(jìn)入污染土壤后與土著菌群共存,共同發(fā)揮PAHs降解作用;添加根系分泌物可能會(huì)影響整體土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)而影響其降解作用的發(fā)揮.基于此,本文選用課題組前期篩選獲得的PAHs高效降解菌群,對(duì)PAHs污染土壤進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù),同時(shí)投加黑麥草實(shí)際根系分泌物,研究根系分泌物對(duì)生物強(qiáng)化效果及土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能的影響;配制相同濃度、配方明確的模擬根系分泌物與實(shí)際根系分泌物進(jìn)行對(duì)比研究,探討兩類根系分泌物作用的異同,考察模擬根系分泌物在土壤修復(fù)工程中輔助應(yīng)用的可行性.研究結(jié)果可為明確根系分泌物在植物-微生物聯(lián)合修復(fù)PAHs污染土壤的作用機(jī)制、優(yōu)化PAHs污染土壤生物修復(fù)技術(shù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 PAHs和植物

根據(jù)PAHs污染土壤相關(guān)研究[13-15],土壤中PAHs以三、四及五環(huán)芳烴居多,本文選取三環(huán)芳烴菲(PHE)、四環(huán)芳烴芘(PYR)和五環(huán)芳烴苯并[a]芘(BAP)為代表性PAHs進(jìn)行研究,純度分別大于98.0%、98.0%和96.0%.供試植物為常用于PAHs污染土壤修復(fù)的多年生黑麥草(L.).

1.2 土壤

實(shí)驗(yàn)土壤采自山東省濟(jì)南市(36.71N, 117.07E),土地類型為棕壤,其基本理化性質(zhì)如下: pH = 8.25,有機(jī)質(zhì)含量為52.1g/kg,全氮、全磷及全鉀含量分別為2.28, 0.96和13.0g/kg,陽(yáng)離子交換量為22.6cmol/kg.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道土壤中PAHs污染水平、種類及占比[16-17],設(shè)置土壤中總PAHs初始污染水平為40mg/kg, 其中PHE:PYR:BAP質(zhì)量比為2:2:1.稱取適量土壤,加入PAHs-丙酮儲(chǔ)備液,攪拌均勻,置于通風(fēng)櫥中揮發(fā)丙酮,之后用于實(shí)驗(yàn).

1.3 根系分泌物

選取黑麥草根系分泌物和模擬根系分泌物進(jìn)行對(duì)比研究.黑麥草根系分泌物通過水培法獲取,具體操作參照先前研究[18-19]并稍作修改.將黑麥草種子置于3% H2O2溶液中消毒20min,使用無菌水沖洗3次,并在無菌水中浸泡過夜.稱取40g浸泡過的種子,平鋪于育種盤,加入1L超純水,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光暗比,16h:8h;溫度,25℃:20℃).種子萌發(fā)3d后,將超純水置換為1L的半量霍格蘭氏(Hoagland’s)營(yíng)養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)15d,每5d更換一次營(yíng)養(yǎng)液.之后取出整板黑麥草,使用超純水沖洗根部,將原育種盤更換為玻璃盤以避免根系分泌物的吸附損失,加入1L超純水,在培養(yǎng)箱中避光收集根系分泌物24h.玻璃盤中溶液過0.45μm水系濾膜即獲得黑麥草根系分泌物.通過冷凍干燥機(jī)進(jìn)行低溫干燥,獲得根系分泌物固體,置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?

模擬根系分泌物依據(jù)文獻(xiàn)配制[20-21],包含實(shí)際植物根系分泌物中常見的含碳化合物,具體組分為:葡萄糖、果糖和蔗糖,各50mmol/L;琥珀酸和蘋果酸,各25mmol/L;絲氨酸、精氨酸和半胱氨酸,各12.5mmol/L.

1.4 PAHs降解菌群

課題組前期保藏了5株P(guān)AHs高效降解菌株,分別為布魯氏菌(sp.)、蒼白桿菌(sp.)、鞘脂單胞菌(sp.)、克雷伯氏菌(sp.)和不動(dòng)桿菌(sp.),均屬于變形桿菌門(Proteobacteria).其配伍菌群在7d內(nèi)的PAHs降解率可達(dá)24.3%,其中對(duì)PHE、PYR和BAP的降解率分別為23.3%, 26.4%和19.6% (50mg/L的PAHs-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基, PHE:PYR:BAP = 10:10:1)[22].本研究以此菌群對(duì)PAHs污染土壤進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù).

各單菌菌株分別在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(LB干粉20.0g,瓊脂20.0g,1L去離子水,121℃高壓滅菌20min)上劃線活化,于生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)72h.分別挑取單菌落至擴(kuò)大培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯18.0g, 1L去離子水, 121℃高壓滅菌20min)中,于搖床中30℃、150r/min培養(yǎng)24h.菌液在4℃、8000r/min下離心5min,棄去上清液,加入PBS溶液重懸(NaCl 8.0081g, KCl 0.2734g, Na2HPO41.1502g, KH2PO40.2394g,無菌水定容至 1L, pH =7. 0, 121℃高壓滅菌20min),制得菌懸液備用.使用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)得每mL菌懸液的活菌數(shù)為1.55×1010個(gè)菌落形成單位(CFU).

1.5 土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別稱取15g土壤于多個(gè)棕色玻璃瓶中,進(jìn)行如下處理: (1)自然衰減處理,命名為CK,作為對(duì)照組; (2)生物強(qiáng)化處理,接種PAHs降解菌群,命名為MC; (3)生物強(qiáng)化+實(shí)際根系分泌物處理,接種PAHs降解菌群并添加黑麥草根系分泌物,命名為MRE; (4)生物強(qiáng)化+模擬根系分泌物處理,接種PAHs降解菌群并添加模擬根系分泌物,命名為MARE.以上處理中所涉及的PAHs降解菌懸液投加體積均為2mL,根系分泌物及模擬根系分泌物濃度均為120mg C/kg.各處理組均設(shè)置3平行.調(diào)整每個(gè)瓶中土壤含水率為最大田間持水量的60%,封瓶膜封口后置于光照培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)21d,每7d采用稱重法補(bǔ)水.分別在0、14d和21d取土樣,測(cè)定PAHs的殘留量;對(duì)第21d土樣,同時(shí)提取土壤DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序.

1.6 土壤中PAHs的測(cè)定

稱取2g土壤于棕色玻璃瓶中,加入 10mL二氯甲烷,渦旋3min后,超聲萃取10min(功率500w), 3000r/min離心10min,獲得上層有機(jī)相.重復(fù)萃取3次,合并有機(jī)相,加入無水Na2SO4脫水,旋蒸至近干,用甲醇定容至4mL.通過0.45μm尼龍濾膜后,使用1260HPLC(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)測(cè)定PAHs濃度.色譜柱為安捷倫 Infinity Lab Poro shell 120EC-C18(4.6mm×100mm,2.7μm),柱溫 25℃.流動(dòng)相為甲醇和水(9:1),流速1.0mL/min,進(jìn)樣量為50μL,檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)為8.0min.采用DAD 檢測(cè)器,PHE、PYR和BAP的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為251nm、240nm和296nm.

1.7 土壤DNA的提取及16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序

采用CTAB法[23]從土壤樣本中提取基因組DNA,對(duì)16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增引物為341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3').PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后,對(duì)目的條帶進(jìn)行回收和文庫(kù)構(gòu)建.通過Novogene(中國(guó)北京)的Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序.針對(duì)測(cè)序得到的雙端reads,進(jìn)行拼接、過濾和降噪,可對(duì)得到的有效數(shù)據(jù)ASVs (Amplicon Sequence Variants,即擴(kuò)增子序列變異)進(jìn)行后續(xù)分析.使用QIIME2軟件中的classify-sklearn模塊比對(duì)得到每個(gè)ASV的物種信息,計(jì)算goods_ coverage、observed_features、chao1、pielou_e和shannon等Alpha多樣性指數(shù)、加權(quán)和非加權(quán) unifrac距離和Bray-Curtis距離.通過基于加權(quán)unifrac距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)和無度量多維標(biāo)定法(NMDS)探究各組間Beta多樣性的差異.采用基于線性判別分析(LDA)效應(yīng)量的分析方法(LEfSe),尋找組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的細(xì)菌物種.使用PICRUSt2軟件對(duì)樣本中的微生物群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析.基于京都基因和基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)和BioCyc子數(shù)據(jù)(MetaCyc)進(jìn)行細(xì)菌功能注釋,生成了包含KEGG 直系同源物(KO)和MetaCyc Pathways(PWY)的絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度的預(yù)測(cè)表.采用基于Bray-Curtis距離的主成分分析(PCA)探究不同樣本中功能基因家族預(yù)測(cè)組成的差異.

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以土壤中PHE、PYR、BAP以及三者之和(總PAHs)的殘留含量作為生物強(qiáng)化修復(fù)的評(píng)價(jià)指標(biāo),各處理組中PAHs殘留量以三平行的平均值來表示.各組之間的數(shù)據(jù)差異采用ANOVA分析進(jìn)行比較(SPSS 21.0軟件).事先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差相等時(shí)采用LSD法,方差不相等時(shí)采用Tamhanes’ T2法.使用Origin 2022b軟件繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 PAHs污染土壤的生物強(qiáng)化修復(fù)效果

各處理組土壤中PAHs的殘留量見圖1.修復(fù)21d后, CK、MC、MRE和MARE組中總PAHs殘留量分別為5.7, 4.8, 4.2和4.3mg/kg. 3種生物強(qiáng)化處理后PAHs殘留量較對(duì)照組下降了15.8%, 26.3%和24.6% (圖1(A)).在所研究的時(shí)間點(diǎn)14d和21d時(shí),生物強(qiáng)化處理MC表現(xiàn)出了顯著優(yōu)于對(duì)照組的修復(fù)效果,總PAHs殘留量顯著低于CK組1.3～2.4mg/kg (<0.05).添加了根系分泌物的生物強(qiáng)化處理(MRE和MARE組)較未添加根系分泌物的處理(MC組)修復(fù)效果更優(yōu),根系分泌物的添加使得土壤中PAHs含量進(jìn)一步顯著減少,較MC分別減少了1.3～ 2.0mg/kg (14d)和0.5～0.6mg/kg (21d).添加了黑麥草實(shí)際根系分泌物的生物強(qiáng)化處理組與模擬根系分泌物強(qiáng)化處理組相比較,二者的PAHs殘留量無顯著差異.對(duì)于單一PAHs (PHE、PYR和BAP)而言, 4個(gè)處理組的污染物殘留量順序與總PAHs一致,為MRE≈MARE < MC < CK.

修復(fù)14d時(shí), 3種生物強(qiáng)化處理使得土壤中的PAHs殘留量比對(duì)照組減少了2.4～4.4mg/kg,隨著修復(fù)的進(jìn)行,生物強(qiáng)化處理較CK的優(yōu)勢(shì)減弱, 21d時(shí)PAHs殘留量與對(duì)照組的差值降至0.9～1.6mg/kg.這表明,生物強(qiáng)化在修復(fù)初期的效果最顯著,隨著自然衰減的進(jìn)行,土壤中污染物量的降低,生物強(qiáng)化處理與對(duì)照組之間的差異逐漸減小.

圖1 土壤中PAH的殘留含量

柱高為三個(gè)平行樣中殘留含量的平均值,誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差.不同小寫字母表示在該時(shí)間節(jié)點(diǎn)時(shí)不同處理組間差異的顯著性(<0.05)

2.2 PAHs污染土壤的細(xì)菌群落

2.2.1 土壤細(xì)菌群落組成 比較了各處理組土壤細(xì)菌群落組成.各樣本ASVs數(shù)量韋恩圖見圖2(A).根據(jù)物種注釋結(jié)果,選取門和目水平上相對(duì)豐度前30的物種得到物種相對(duì)豐度柱形圖(圖2(B)和(C)).對(duì)比了門水平上各組間優(yōu)勢(shì)物種組成. CK組主要優(yōu)勢(shì)門為放線菌門(Actinobacteriota, 33.3%)、變形菌門(Proteobacteria, 29.0%)、厚壁菌門(Firmicutes, 7.6%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota, 7.5%)、擬桿菌門(Bacteroidota, 7.1%)和酸桿菌門(Acidobacteriota, 5.0%). 3種生物強(qiáng)化處理均向土壤中接種了PAHs降解菌群,菌群中5株單菌均屬于變形菌門(Proteobacteria).圖2顯示該菌門在土壤中占據(jù)了絕對(duì)的豐度優(yōu)勢(shì),在 MC、MRE和MARE組中相對(duì)豐度分別較CK高出11.5%, 10.3%和8.0%,說明接種PAHs降解菌群21d后,降解菌未被土著菌競(jìng)爭(zhēng)淘汰.接種外源降解菌引發(fā)了其他菌門相對(duì)豐度的改變,粘球菌門(Myxococcota)的相對(duì)豐度由2.3%增至2.4%～2.9%;疣微菌門(Verrucomicrobiota)的相對(duì)豐度由1.5%增至1.8%～3.3%;其余門相對(duì)豐度則有所減少,其中放線菌門(Actinobacteriota)減少得最多,相對(duì)豐度在MC、MRE和MARE組中分別減少了12.9%, 9.9%和7.7%.

目水平上各組間優(yōu)勢(shì)物種組成結(jié)果如圖2(C)所示.CK組中前30優(yōu)勢(shì)菌目的相對(duì)豐度在0.1%～ 9.7%范圍內(nèi),其中微球菌目(Micrococcales)的相對(duì)豐度最大,為9.7%,其次為芽單胞菌目(Gemmatimonadales, 6.7%)、伯克氏菌目(Burkholderiales,5.6%)、根瘤菌目(Rhizobiales,5.5%)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales, 5.4%)和小單孢菌(Micromonosporales,5.3%).生物強(qiáng)化處理未改變優(yōu)勢(shì)菌目的種類,但引發(fā)了部分菌目相對(duì)豐度的變化.PAHs外源降解菌群中5株菌屬于4個(gè)目,分別為根瘤菌目(Rhizobiales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、腸桿菌目(Enterobacterales)和假單胞菌目(Pseudomonadales).向土壤中投加PAHs降解菌群后,原本為前10優(yōu)勢(shì)菌目的根瘤菌目(Rhizobiales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)相對(duì)豐度進(jìn)一步增加,分別增至7.1%～13.1% 和5.5%～6.6%.腸桿菌目(Enterobacterales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)在CK組中相對(duì)豐度排第28和第30,為0.1%和0.7%.腸桿菌目(Enterobacterales)豐度在3種生物強(qiáng)化處理后由0.1%增至0.4%～1.1%;假單胞菌目(Pseudomonadales)只在MC和MRE處理組中相對(duì)豐度增加,為0.8%和1.3%,而在MARE組中豐度降低至0.5%.伯克氏菌目(Burkholderiales)、芽孢桿菌目(Bacillales)和黃單胞菌目(Xanthomonadales)為土壤中相對(duì)豐度排名前10的優(yōu)勢(shì)土著菌目,本研究所接種的外源降解菌群中并未含有這些菌目,但生物強(qiáng)化處理后以上土著菌目的相對(duì)豐度仍有不同程度地增加,分別增加了0.1%～1.3%、1.3%～11.5%和2.2%～11.5%.

圖2 土壤細(xì)菌群落中ASVs數(shù)目及優(yōu)勢(shì)菌門、目的相對(duì)豐度

圖(B)和(C)中的“Others”表示圖中所示物種之外其他所有門或目的相對(duì)豐度之和

2.2.2 土壤細(xì)菌群落多樣性 比較了各組Alpha多樣性分析指數(shù),結(jié)果見表1.測(cè)序深度指數(shù)(goods_ coverage)均接近于1,表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理,序列信息可反映樣本群落的真實(shí)信息.只接種外源降解菌群即MC處理未顯著影響可觀察到的物種數(shù)目(observed_features)及物種豐富度(chao1),添加根系分泌物同時(shí)接種外源菌群即MRE和MARE處理使得這2個(gè)指數(shù)降低, observed_features指數(shù)降低至1308～1486, chao1指數(shù)降低至1310～1488. 3種生物強(qiáng)化處理使得土壤細(xì)菌群落均勻度(pielou_e)和群落多樣性(shannon)與CK相比均不同程度地降低,分別降至0.833～0.880和8.622～9.271.其中MARE處理降低得更顯著.

對(duì)比了各處理組Beta多樣性組間差異,使用基于加權(quán)Unifrac 距離的PCoA和NMDS分析方法,結(jié)果見圖3.圖3(A)中PC1和PC2軸對(duì)差異的貢獻(xiàn)率分別為32.76%和22.71%, 3種生物強(qiáng)化處理MC、MRE和MARE組的樣本點(diǎn)均在CK組樣本點(diǎn)的左下方,與CK組不重合,說明生物強(qiáng)化顯著改變了土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu).MC組與MRE和MARE組的樣本點(diǎn)分散開來,表明添加根系分泌物影響了接種外源菌群后的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu). NMDS分析結(jié)果佐證了以上結(jié)論(圖3(B), stress=0.1).

2.2.3 差異物種 為探究各處理組間土壤細(xì)菌群落中豐度差異顯著的物種類別,使用LEfse分析兩兩比較CK與各處理組中物種的相對(duì)豐度(LDA閾值=4),結(jié)果見圖4(A)～(C). MC、MRE和MARE組中分別顯著富集了5、5和8個(gè)物種. MC與CK組相比較, MC土壤中富集了α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria),微孢子科(Microscillaceae),根瘤菌科(Rhizobiaceae),噬纖維菌目(Cytophagales)和根瘤菌目(Rhizobiales),而只有微球菌目(Mircrococcales)在CK組中被顯著富集.經(jīng)過MRE處理后, Diplorickettsiaceae 科(Diplorickettsiaceae), Diplorickettsiales目(Diplorickettsiales),黃單胞菌科(Xanthomonadaceae),黃單胞菌目(Xanthomonadales)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)豐度顯著增加;而微球菌科(Micrococcaceae),微球菌目(Micrococcales)和放線菌綱(Actinobacteria)則在CK組中相對(duì)豐度顯著增加. MARE處理組中富集的土壤細(xì)菌物種個(gè)數(shù)最多,分別為芽孢桿菌科(Bacillaceae),芽孢桿菌目(Bacillales),芽孢桿菌綱(Bacilli), 根瘤菌科(Rhizobiaceae),根瘤菌目(Rhizobiales),黃單胞菌科(Xanthomonadaceae),黃單胞菌目(Xanthomonadales)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria);富集在CK組中的主要物種為芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae),芽單胞菌目(Gemmatimonadales)和芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes).在上述差異物種中,MC和MARE組的共同差異物種為根瘤菌科(Rhizobiaceae)和根瘤菌目(Rhizobiales); MRE和MARE組的共同差異物種為黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)、黃單胞菌目(Xanthomonadales)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria); MC和MRE組中未出現(xiàn)豐度顯著增加的共同物種.

表1 土壤細(xì)菌群落的Alpha多樣性指數(shù)

注:不同小寫字母表示針對(duì)同一Alpha多樣性指數(shù)各處理組間差異的顯著性.

圖3 基于加權(quán)unifrac距離的土壤細(xì)菌群落Beta多樣性

為進(jìn)一步探究不同生物強(qiáng)化措施產(chǎn)生的差異物種,比較了MC、MRE和MARE組土壤細(xì)菌的相對(duì)豐度(LDA閾值=3),得到的差異物種系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4(D). MC組中富集了薄層菌科(Hymenobacteraceae)、乳桿菌目(Lactobacillales)和根瘤菌科(Rhizobiaceae)的細(xì)菌; MRE組中AKYG1722科、Diplorickettsiaceae科和Diplorickettsiales目的相對(duì)豐度增加最為顯著; MARE組中的差異物種為芽孢桿菌綱(Bacilli)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)和西索恩氏菌目(Chthoniobacterales).

圖4 組間線性判別的效應(yīng)量分析(LEfse)

圖(A)～(C)中LDA閾值=4; 圖(D)中LDA閾值=3

2.2.4 細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè) 基于16S rDNA基因序列使用PICRUSt2預(yù)測(cè)土壤樣本的細(xì)菌群落功能,并歸類至KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù). PICRUSt2與以往常用的PICRUSt相比,精度大幅提升,其數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種分類學(xué)種水平增加近5倍,基因組增加至10倍以上,功能預(yù)測(cè)信息更加全面[24].樣品在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中Level 1層級(jí)的功能注釋結(jié)果顯示,所有樣本中歸屬于新陳代謝功能的基因種類最多,其次為環(huán)境信息處理和細(xì)胞過程等相關(guān)功能.所有處理組的共有功能基因有6733個(gè),特有功能基因數(shù)目順序?yàn)? CK > MRE > MC > MARE(圖5(A)).各處理組中細(xì)菌功能PCA分析如圖5(B)所示, PC1和PC2軸的貢獻(xiàn)率分別為26.49%和24.79%. 3種生物強(qiáng)化處理組樣本點(diǎn)在CK組樣本點(diǎn)的下方,且距離較遠(yuǎn),說明生物強(qiáng)化處理影響了土壤細(xì)菌群落的功能.MC組和MARE組之間的距離較其與MRE組之間的距離稍遠(yuǎn),說明在接種外源菌群的情況下,添加模擬根系分泌物較實(shí)際根系分泌物對(duì)細(xì)菌群落功能改變的程度更大.

除KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)外,本文還采用MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)注釋了16S rDNA基因序列預(yù)測(cè)群落功能. MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)是由大量源于科學(xué)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)闡明的代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù),與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)相比,其包含的初級(jí)和次級(jí)代謝途徑更為全面,可用來預(yù)測(cè)基因組中的代謝途徑[25].選取相對(duì)豐度排名前35的代謝通路涉及的基因及它們?cè)诿拷M樣品中的豐度信息繪制熱圖,并從功能差異層面進(jìn)行聚類,結(jié)果如圖5(C)所示.與CK相比, MC組中相對(duì)豐度較大的途徑主要為L(zhǎng)-異亮氨酸生物合成I的超途徑(PWY- 3001, superpathway of L-isoleucine biosynthesis I)和5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成I(PWY-6121, 5-aminoimidazole ribonucleotide biosynthesis I); MRE組中脂肪酸補(bǔ)救合成(PWY-7094, fatty acid salvage)、脂肪酸&β;-氧化 I(FAO-PWY, fatty acid β-oxidation I)、腺苷核苷酸生物合成的超途徑I(PWY-7229,superpathway of adenosine nucleotides de novo biosynthesis I)、原核生物的TCA循環(huán)I(TCA,TCA cycle I (prokaryotic))、細(xì)胞色素c的有氧呼吸I(PWY-3781, aerobic respiration I (cytochrome c))和腺苷核苷酸從頭生物合成的超途徑II(PWY-6126, superpathway of adenosine nucleotides de novo biosynthesis II)等功能較為豐富; MARE組中TCA 循環(huán) IV(P105-PWY, TCA cycle IV (2-oxoglutarate decarboxylase))和TCA循環(huán)VIII(REDCITCYC, TCA cycle VIII (helicobacter))功能的豐度較大.即MC處理強(qiáng)化了氨基酸、核苷和核苷酸生物合成等相關(guān)過程; MRE處理使脂肪酸和脂質(zhì)生物合成及降解、核苷和核苷酸生物合成和TCA循環(huán)等相關(guān)功能增強(qiáng); MARE處理促進(jìn)了TCA循環(huán)相關(guān)功能.

圖5 土壤細(xì)菌群落功能

此外,本文進(jìn)一步關(guān)注了MetaCyc數(shù)據(jù)庫(kù)中涉及芳烴降解(Aromatic Compound Degradation, ACD) 相關(guān)途徑的功能基因絕對(duì)豐度.所有樣本共檢出8個(gè)涉及ACD的相關(guān)途徑,其功能基因絕對(duì)豐度之和呈MRE > MARE > MC > CK趨勢(shì)(圖5(D)).其中,對(duì)半胱氨酸降解(PWY-5273, p-cumate degradation)和對(duì)異丙基甲苯降解(PWY-5266, p-cymene degradation)只在MRE組中檢出; MARE處理使得4-羥基苯乙酸酯(3-HYDROXYPHENYLACETATE-DEGRADATION-PWY, 4-hydroxyphenylacetate degradation )和丁香酸酯降解(PWY-6339, syringate degradation)這2個(gè)途徑相關(guān)功能基因絕對(duì)豐度顯著增加.

3 討論

本研究21d培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 3種生物強(qiáng)化處理均顯著促進(jìn)了土壤中PAHs的去除.在接種外源菌群的基礎(chǔ)上添加黑麥草根系分泌物或模擬根系分泌物后(即MRE和MARE處理),與單純接種外源菌群的MC處理相比較,土壤中PAHs殘留量更低.微生物降解是生物修復(fù)PAHs污染土壤的主要機(jī)制[26],向PAHs污染土壤中接種外源菌群進(jìn)行生物強(qiáng)化已被諸多研究證實(shí)是有效的土壤生物修復(fù)措施[27-28].生物強(qiáng)化效果的優(yōu)劣主要取決于接種的外源降解菌群能否成功定殖于污染土壤中,且與土著菌群的競(jìng)爭(zhēng)是否占據(jù)優(yōu)勢(shì).本實(shí)驗(yàn)對(duì)于接種了外源菌群3周后的土壤樣本進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序后發(fā)現(xiàn),外源降解菌群在細(xì)菌群落中仍占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位,在修復(fù)期內(nèi)可充分發(fā)揮降解作用加快PAHs的去除進(jìn)程.外源菌群的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)在添加實(shí)際及模擬根系分泌物后依然存在,且兩種根系分泌物均進(jìn)一步加強(qiáng)了土壤中PAHs的生物強(qiáng)化效果. Guo等人也報(bào)道了類似的結(jié)果,向土壤中添加分枝桿菌-大豆/玉米根系滲出物能夠加速PAHs的去除,主要原因?yàn)樵鰪?qiáng)了土壤細(xì)菌群落的Beta多樣性[12].袁靜等人向土壤中添加了根系分泌物重要組分亞油酸鈉,發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)了PAHs的降解,認(rèn)為這種促進(jìn)作用與微生物多樣性無關(guān),與富集的特定微生物群落相關(guān)[29].Corgie等曾報(bào)道黑麥草根系分泌物可通過增加降解菌的活性來促進(jìn)土壤環(huán)境中菲的降解[30].為探索生物強(qiáng)化對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響及根系分泌物對(duì)生物強(qiáng)化的促進(jìn)機(jī)理,本研究比較了各處理組細(xì)菌群落組成、多樣性和群落功能.

3種生物強(qiáng)化處理影響了PAHs污染土壤中的細(xì)菌群落組成,產(chǎn)生了豐度發(fā)生顯著變化的差異物種,降低了細(xì)菌群落的豐富度、均勻度及多樣性,顯著改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu).3種生物強(qiáng)化處理均增加了變形菌門(Proteobacteria)、粘球菌門(Myxococcota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)和根瘤菌目(Rhizobiales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、芽孢桿菌目(Bacillales)、黃單胞菌目(Xanthomonadales)的相對(duì)豐度.以上菌門和菌目在CK組中相對(duì)豐度均處于前10位,曾在文獻(xiàn)中被報(bào)道具有PAHs降解功能[31-36].在以上優(yōu)勢(shì)物種中,生物強(qiáng)化修復(fù)所投加的外源PAHs降解菌群所屬門為變形菌門(Proteobacteria),所屬目是根瘤菌目(Rhizobiales)和鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales),其余門和目是經(jīng)生物強(qiáng)化處理后土著菌群中被刺激生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌.添加實(shí)際及模擬根系分泌物后,外源菌群所屬菌門的相對(duì)豐度增幅比只接種外源菌群的生物強(qiáng)化處理MC小,說明根系分泌物對(duì)土著菌群的生長(zhǎng)刺激作用較外源菌群更強(qiáng).LEfSe分析結(jié)果顯示3種生物強(qiáng)化處理產(chǎn)生了一些被顯著富集的物種,且各組間存在共同差異物種,部分共同差異物種屬于上述優(yōu)勢(shì)菌門和菌目.認(rèn)為本研究的3種生物強(qiáng)化處理通過向土壤中投加外源降解菌群以及刺激土著降解菌群的生長(zhǎng)繁殖,進(jìn)而促進(jìn)土壤中PAHs的生物降解. Lu等探討了葡萄糖、有機(jī)酸和絲氨酸等主要根系分泌物組分在芘污染土壤修復(fù)中的作用,發(fā)現(xiàn)根系分泌物可通過促進(jìn)脫氫酶活性、改變土壤微生物群落和增加土著PAHs降解菌分枝桿菌的豐度來顯著促進(jìn)芘的生物降解[37].

本文通過PICRUSt2進(jìn)一步分析了土壤細(xì)菌群落功能的變化. 3種生物強(qiáng)化處理均改變了土壤細(xì)菌群落的功能結(jié)構(gòu),分別富集了部分代謝通路,并增加了芳烴降解途徑功能基因的絕對(duì)豐度.芳烴降解基因豐度增加表明可利用PAHs的細(xì)菌增多,這與PAHs降解效果的增強(qiáng)相對(duì)應(yīng).關(guān)于PAHs污染土壤自然衰減的相關(guān)研究表明,向土壤中添加根系分泌物能夠促進(jìn)土著PAHs降解菌和降解基因的增加. Liao等研究發(fā)現(xiàn)模擬根系分泌物的添加可顯著提高土壤中PAHs降解基因(、和基因)的豐度,進(jìn)而促進(jìn)土壤中萘、菲和芘的降解[38].有研究報(bào)道稱PAHs去除程度與PAHs降解基因之間存在著正相關(guān)關(guān)系[39].本研究結(jié)果顯示,接種外源降解菌群同時(shí)添加根系分泌物也產(chǎn)生了同樣的降解促進(jìn)效果,外源菌與土著菌的競(jìng)爭(zhēng)未改變根系分泌物對(duì)PAHs降解菌的生長(zhǎng)刺激作用.添加了根系分泌物的生物強(qiáng)化處理對(duì)于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變程度較只接種外源降解菌群的MC處理更大,且芳烴降解基因的增加幅度較MC處理更大,修復(fù)效果較MC處理更優(yōu).這表明添加根系分泌物通過促進(jìn)PAHs降解菌的生長(zhǎng)提升了生物強(qiáng)化修復(fù)的效果.

黑麥草實(shí)際根系分泌物與模擬根系分泌物對(duì)生物強(qiáng)化的顯著促進(jìn)效果相似. MRE和MARE處理后,土壤中PAHs殘留量無顯著差異.模擬根系分泌物是根據(jù)文獻(xiàn)所報(bào)道的多種實(shí)際根系分泌物主體組分(糖類、氨基酸類和小分子酸類)配制得到,在生物強(qiáng)化修復(fù)PAHs污染土壤時(shí)起到了和黑麥草根系分泌物同樣的促進(jìn)效果.然而,實(shí)際根系分泌物組成更為復(fù)雜,除上述主體成分外,還含有酶類、甾醇類、酚酸類、脂肪酸、生長(zhǎng)因子等組分[40],因而兩類根系分泌物對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響存在一些差別. MARE處理對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變較MRE處理更大. MRE處理組和MARE組產(chǎn)生的差異物種不同, MRE組的差異物種為AKYG1722科、Diplorickettsiaceae科和Diplorickettsiales目; MARE組的差異物種為芽孢桿菌綱(Bacilli)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)和西索恩氏菌目(Chthoniobacterales).兩類根系分泌物對(duì)土壤細(xì)菌功能影響也存在差別,MRE組和MARE組各自特有功能基因個(gè)數(shù)分別為272和49. MRE處理使得芳烴降解新增了對(duì)半胱氨酸和對(duì)異丙基甲苯降解這2個(gè)途徑, MARE處理組樣本未預(yù)測(cè)出這2個(gè)代謝途徑,但在共用途徑4-羥基苯乙酸酯和丁香酸酯降解中相關(guān)功能基因絕對(duì)豐度較MRE處理更大.兩類根系分泌物處理組間土壤細(xì)菌群落的差別未引發(fā)二者對(duì)PAHs生物強(qiáng)化促進(jìn)效果的差異.

4 結(jié)論

4.1 向PAHs污染土壤中接種由布魯氏菌(sp.)、蒼白桿菌(sp.)、鞘脂單胞菌(sp.)、克雷伯氏菌(sp.)和不動(dòng)桿菌(sp.)構(gòu)建的外源高效PAHs降解菌群進(jìn)行生物強(qiáng)化可加快PAHs的去除, PAHs殘留量低于自然衰減對(duì)照組15.8%.在以上基礎(chǔ)上添加黑麥草根系分泌物或模擬根系分泌物會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)PAHs的生物強(qiáng)化效果, PAHs殘留量較對(duì)照分別下降了26.3%和24.6%,兩種根系分泌物之間差異不顯著.

4.2 與自然衰減相比較, 3種生物強(qiáng)化措施均促進(jìn)了土壤中PAHs降解菌的生長(zhǎng),改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),影響了細(xì)菌群落的功能,使芳烴降解途徑相關(guān)功能基因增加,與PAHs降解效果的增強(qiáng)相對(duì)應(yīng).

4.3 添加黑麥草實(shí)際或模擬根系分泌物并接種外源降解菌群后,土壤細(xì)菌群落的變化較只接種降解菌群的生物強(qiáng)化處理程度更大,芳烴降解相關(guān)功能基因增加得更多.兩類根系分泌物分別使土壤細(xì)菌群落中產(chǎn)生了各自的差異物種及特有的功能基因,但該差別未引發(fā)其對(duì)生物強(qiáng)化促進(jìn)效果的差異.

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Effects of root exudates on bioaugmentation of PAHs-contaminated soil.

LI Yu-ting, BAO Wen-xiu, ZHANG Wen*,WANG Jia-ning, HUANG Yu-jie, SONG Fan-yong

(Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250103, China)., 2023,43(8)：4183～4193

A soil microcosm experiment was conducted to investigate the effect of bioaugmentation on polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)-contaminated soil and the influence of root exudates on bioaugmentation. The content of PAHs residue was decreased by 15.8% with PAHs-degrading bacteria (,,,andsp.) compared to CK in 21d. The addition of ryegrass or artificial root exudates significantly enhanced the bioaugmentation effect and the contents were decreased by 26.3% and 24.6% compared to CK, respectively. These 3bioaugmentation treatments altered the soil bacterial community structures. Compared with the inoculation of PAHs-degrading bacteria alone, the addition of root exudates changed the community structure more significantly and increased the abundance of aromatic compounds degradation-related genes more markedly, indicating that the root exudates affected the bacterial community by promoting the growth of PAHs-degrading bacteria and thus enhanced the bioremediation effect. The different effects of the two types of root exudates on soil bacterial community did not lead to a difference in their contribution to the promotion for bioaugmentation. This study can provide a reference for optimizing bioaugmentation remediation techniques for organic-contaminated soils.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)；soil remediation；ryegrass；root exudates；bioaugmentation

X53

A

1000-6923(2023)08-4183-11

李瑜婷(1998-),女,山東泰安人,碩士研究生,研究方向?yàn)橛袡C(jī)污染土壤修復(fù)及微塑料的環(huán)境效應(yīng).發(fā)表論文1篇.2233605485@qq.com.

李瑜婷,鮑文秀,張 聞,等.根系分泌物對(duì)生物強(qiáng)化修復(fù)PAHs污染土壤的影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2023,43(8):4183-4193.

Li Y T, Bao W X, Zhang W, et al. Effects of root exudates on bioaugmentation of PAHs-contaminated soil [J]. China Environmental Sicence, 2023,43(8):4183-4193.

2023-04-25

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2019YFC1804103);山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2022MD116)

* 責(zé)任作者, 副研究員, zw-sunshine@163.com