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    葡萄糖酸鈣注射液中細菌內(nèi)毒素的定量檢測

    2023-08-28 02:22:44朱文娟李錦妹陳文靜林鳳屏李紅靜黃永德
    食品與藥品 2023年4期
    關(guān)鍵詞:葡萄糖酸鈣內(nèi)毒素試劑

    朱文娟,李錦妹,翁 嘉,陳文靜,林鳳屏,李紅靜,黃永德

    (惠州市食品藥品檢驗所,廣東 惠州 516003)

    葡萄糖酸鈣注射液臨床主要用于治療人畜鈣缺乏癥及過敏性疾病,也可用于鎂、氟離子引起的中樞抑制的中毒解救[1-2]。微量動態(tài)顯色法(microkinetic chromogenic method)是一種新型內(nèi)毒素定量檢測方法,具有靈敏度高、檢測范圍寬和鱟試劑用量少等優(yōu)點,近年來受到越來越多的關(guān)注[3]。該方法使用酶標儀,通過檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出的對硝基苯胺(呈色團)的數(shù)量,依據(jù)呈色團的吸光度和內(nèi)毒素濃度間對應(yīng)關(guān)系,計算樣品中的內(nèi)毒素含量[4-5]。微量動態(tài)顯色法不需要凝固蛋白原形成凝膠,直接通過儀器讀取結(jié)果,實現(xiàn)精準定量;實驗操作、數(shù)據(jù)記錄實現(xiàn)了從手工到自動化,保障了實驗過程的完整性和結(jié)果數(shù)據(jù)的可溯源性;96孔反應(yīng)板可同時檢測多個濃度樣品,省時省力;此外,微量動態(tài)顯色法靈敏度比凝膠法高,適用于內(nèi)毒素限值低的樣品的檢測,能較好地消除實驗中的干擾[6]。

    本研究采用微量動態(tài)顯色法對葡萄糖酸鈣注射液進行內(nèi)毒素定量檢測,同時與傳統(tǒng)的凝膠法進行比較,建立該品的細菌內(nèi)毒素定量檢測方法,實現(xiàn)在線實時記錄生產(chǎn)各環(huán)節(jié)樣品內(nèi)毒素含量的動態(tài)變化,有助于及時發(fā)現(xiàn)和分析潛在的污染來源,實現(xiàn)無菌藥品安全生產(chǎn)的全過程控制,更好地保障臨床安全用藥。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    Multiskan ET內(nèi)毒素檢測儀(美國賽默飛);BioProbe生物探針5.2系統(tǒng)(湛江安度斯);MS3漩渦混勻器(美國IKA);TAL-96G試管恒溫儀(湛江安度斯)。

    1.2 試藥

    葡萄糖酸鈣注射液6批(規(guī)格為10 ml:1 g×5支,其中焦作市民康藥業(yè)有限公司3批,批號:21060403,21060502,22061903;常州蘭陵制藥有限公司3批,批號:12104090,12104210,12104130);細菌內(nèi)毒素工作標準品(CSE,中國食品藥品檢定研究院,批號:150601-201987,規(guī)格:80 EU/ml;湛江安度斯生物有限公司,批號:2201260,濃度范圍為0.02~2.0 EU/ml);動態(tài)顯色法鱟試劑(批號:2202230,規(guī)格:0.35 ml,定量范圍:10~0.01 EU/ml,湛江安度斯生物有限公司);凝膠法鱟試劑(TAL,批號:2204190,規(guī)格:0.65 ml/支,靈敏度:0.25 EU/ml,湛江安度斯生物有限公司);細菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水,批號:2002260,湛江安度斯生物有限公司)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 細菌內(nèi)毒素的限值

    2020年版《中國藥典》第二部品種項下規(guī)定:每1 mg葡萄糖酸鈣中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.17 EU[7]。

    2.2 微量鱟試劑動態(tài)顯色法標準曲線可靠性試驗及凝膠法鱟試劑靈敏度復核

    按使用說明,取3支湛江安度斯細菌內(nèi)毒素工作標準品,濃度分別為0.02,0.2,2.0 EU/ml,用BET水復溶,并在漩渦混勻器上充分混勻30 s,同時用BET水作為陰性對照管。吸取上述系列濃度細菌內(nèi)毒素標準溶液各25 μl至96孔反應(yīng)板中;取動態(tài)顯色法鱟試劑,加BET水0.35 ml,充分復溶后吸取25 μl,分別加入標準溶液進行反應(yīng),每個濃度平行3管。預設(shè)吸收度(A)值為0.1,反應(yīng)時間T為3600 s,溫度37 ℃,檢測波長405 nm,以T的對數(shù)為橫坐標,濃度(C)的對數(shù)為縱坐標,得出標準曲線和相關(guān)系數(shù)(r)值?;貧w方程為lgT=2.8974-0.29133lgC,相關(guān)系數(shù)│r│=1.0000>0.980,變異系數(shù)(CV)值均<10 %,陰性對照反應(yīng)時間>3600 s,標準曲線可靠性試驗各數(shù)據(jù)符合要求,結(jié)果見表1。

    表1 標準曲線的可靠性試驗結(jié)果(n=3)

    凝膠法鱟試劑按2020年版《中國藥典》第四部通則1143要求進行靈敏度復核[8],靈敏度為λ,符合規(guī)定。

    2.3 兩種檢測法最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的確定

    根據(jù)MVD=cL/λ,c為樣品溶液濃度(100 mg/ml),L為葡萄糖酸鈣注射液細菌內(nèi)毒素限值(0.17 EU/mg);微量動態(tài)顯色法中λ為0.02 EU/ml,凝膠法中λ為0.25 EU/ml,計算出MVD在動態(tài)顯色法中為850,在凝膠法中為68。

    2.4 預干擾試驗

    分別選取2個廠家各1批樣品,用BET水依次稀釋至25,50,100,200倍(濃度分別為4,2,1,0.5 mg/ml),作為供試品溶液。按使用說明,吸取不同稀釋倍數(shù)的供試品溶液各700 μl,加入濃度為0.2 EU/ml的CSE干粉中,渦漩混勻30 s使其充分復溶,作為供試品陽性對照溶液。取上述制備的各溶液和標準曲線可靠性試驗中的0.02,0.2,2.0 EU/ml系列濃度CSE溶液各25 μl,加入96孔反應(yīng)板,每個濃度平行2份;取BET水作為陰性對照。最后每孔加入25 μl 動態(tài)顯色法鱟試劑,用內(nèi)毒素檢測儀測定。不同的稀釋倍數(shù),樣品回收率均在50 %~200 %范圍內(nèi),見表2。在稀釋25倍時,不同樣品的回收率分別為64.46 %和56.13 %,由于56.13 %較低且接近最低限值,故選擇50倍稀釋的樣品進行正式干擾試驗。

    表2 預干擾試驗結(jié)果(n=2)

    2.5 正式干擾試驗

    為確證葡萄糖酸鈣注射液50倍稀釋的有效性,進行2個不同廠家各3個批號樣品的正式干擾試驗。樣品稀釋50倍后,按預干擾試驗的方法進行測定,計算樣品內(nèi)毒素加標回收率和本底內(nèi)毒素含量。實驗的回收率范圍在63.49 %~69.55 %,符合藥典要求,結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,樣品在50倍稀釋下不存在抑制或增強的干擾作用;各試驗組平行管的CV值均<1.5 %;供試品的平均反應(yīng)時間均>3600 s,實測值均<0.00391 EU/ml。標準曲線的最小濃度為0.02 EU/ml,稀釋倍數(shù)為50,因此6批葡萄糖酸鈣注射原液內(nèi)毒素結(jié)果均<1.000 EU/ml,結(jié)果最后換算為<0.01 EU/mg,符合藥典規(guī)定的<0.17 EU/mg。在本試驗條件下,葡萄糖酸鈣注射液的最大無干擾稀釋倍數(shù)為50倍。如果采用的鱟試劑靈敏度不同,需按本試驗方法重新確認稀釋倍數(shù)。

    表3 正式干擾試驗結(jié)果(n=2)

    2.6 凝膠法檢測

    用BET水將樣品依次稀釋至34,68倍,作為2倍供試品溶液和供試品溶液。用BET水將CSE標準品(80 EU/ml)稀釋至1.0,0.5 EU/ml,作為4λ,2λ陽性對照溶液。取等量2倍供試品溶液和4λ陽性對照溶液充分混勻,作為供試品陽性對照溶液(2λ)。吸取0.05 ml鱟試劑溶液至各小試管,分別加入0.05 ml供試品溶液、供試品陽性對照溶液(2λ)、陽性對照溶液(2λ)、陰性對照溶液,每種平行兩管,輕搖混勻,放入試管恒溫儀中,37 ℃孵育60 min后取出,觀察凝膠成像結(jié)果。結(jié)果均符合規(guī)定,詳見表4。

    表4 凝膠法檢測結(jié)果

    3 討論

    葡萄糖酸鈣注射液細菌內(nèi)毒素檢測結(jié)果,微量動態(tài)顯色法與凝膠法一致,均符合《中國藥典》2020年版品種項下規(guī)定[7]。相較凝膠法,微量動態(tài)顯色法有以下優(yōu)勢:一是鱟試劑的使用量僅為凝膠法的1/4,可大大減少對國家二級保護動物鱟資源的需求;二是微量動態(tài)顯色法的檢測限寬,有利于一次性對各種潛在干擾濃度進行篩選,大幅減少鱟試劑的用量,實現(xiàn)大范圍快速篩查;三是可實現(xiàn)實時定量檢測,靈敏度高[9],檢測結(jié)果可以精確的數(shù)值表示,生產(chǎn)質(zhì)控人員可了解產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量的變化趨勢,有利于注射液生產(chǎn)全過程中的關(guān)鍵風險控制點的安全監(jiān)控[10-13];四是檢測過程和數(shù)據(jù)處理皆由儀器自動化控制,可實時觀察和監(jiān)控動態(tài)反應(yīng),避免主觀判斷影響結(jié)果,實現(xiàn)數(shù)據(jù)的可溯源。除此之外,基于顯色基質(zhì)顏色的變化速率來定量檢測內(nèi)毒素的微量動態(tài)顯色法,不受凝膠形成和濁度測定的的干擾因素影響[14-15],同時具備動態(tài)濁度法和終點法的優(yōu)點。

    葡萄糖酸鈣注射液的臨床用途和適用人群廣泛,內(nèi)毒素限值較低,更應(yīng)嚴控質(zhì)量,降低風險。本實驗建立的微量動態(tài)顯色法,實現(xiàn)了過程的可控和結(jié)果的精確定量,操作簡便,可用于大批量檢測,能更好地保障臨床用藥和藥品的安全生產(chǎn)。

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