塞來昔布自微乳的制備及體外溶出研究

楊雪華，毛楷凡，劉正平,，李大偉,*，張岱州,*

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 新型緩控釋制劑與藥物靶向遞送系統(tǒng)山東省工程研究中心，山東 濟(jì)南250101；2. 國(guó)家藥監(jiān)局藥物制劑技術(shù)研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101； 3. 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

塞來昔布（celecoxib，CXB）是新一代非甾體抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAID），可通過選擇性抑制環(huán)氧化酶2來抑制前列腺素的生成，繼而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用[1]。與其他NSAID相比，CXB同樣用于治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和急性疼痛，但不同的是，CXB治療效果更好，且上消化道潰瘍及其他并發(fā)癥的發(fā)生率最低[2]。然而根據(jù)生物制藥分類系統(tǒng)，CXB屬于II類藥物（高滲透性和低溶解性），其有限的水溶性極大地影響了其口服生物利用度。因此，亟需通過各種增溶技術(shù)來增加CXB的水溶性。近年，研究人員將CXB制備成固體分散體、納米混懸液及脂質(zhì)體等來改善其水溶性，但這些手段增溶有限，且都存在制備工藝復(fù)雜、難以放大生產(chǎn)的缺點(diǎn)[3]。

自微乳藥物遞送系統(tǒng)（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）是由油相、乳化劑、助乳化劑混合而成的液態(tài)或類固態(tài)制劑[4]。SMEDDS口服后能在胃腸道的蠕動(dòng)下與胃液、腸液融合，自發(fā)分散形成粒徑小于100 nm的O/W型乳液，可極大地提高藥物的溶解度和口服生物利用度[5]。且SMEDDS具有生物相容性好、穩(wěn)定性高及容易放大生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)[6]。因此，本研究擬將CXB制備成SMEDDS，以期實(shí)現(xiàn)增加CXB溶解度、改善胃腸道吸收、提高口服生物利用度的目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 8454型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）；LOGAN 860DL型智能溶出儀（美國(guó)LOGAN公司）；MS204TS/02型電子天平（美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司）；C-MAG HS4型磁力攪拌器（德國(guó)IKA公司）；Nano-ZS90型馬爾文激光粒度分布與電勢(shì)分析儀（英國(guó)Malvern公司）；Talos F200s型透射電子顯微鏡（FEI公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲設(shè)備有限公司）。

1.2 材料

塞來昔布原料藥（自制，批號(hào)：210304）；中鏈甘油三酯（MCT，批號(hào)：177185，法國(guó)嘉法獅公司）；聚氧乙烯35蓖麻油（ELP35，批號(hào)：7778402UO，北京鳳禮精求醫(yī)藥有限公司）；丙三醇（批號(hào)：B2108262，西隴科學(xué)股份有限公司）；甲醇（批號(hào)：20211118），無水乙酸鈉（批號(hào)：20180307），磷酸二氫鈉（批號(hào)：20161011），十二烷基硫酸鈉（SDS，批號(hào)：20170904），鹽酸（批號(hào)：20190320，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；醋酸（批號(hào)：20170712，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（批號(hào)：20210504，天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 CXB-SMEDDS的制備

分別以中鏈甘油三酯（MCT）、聚氧乙烯35蓖麻油（ELP35）、丙三醇作為油相、乳化劑及助乳化劑。參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]確定了CXB-SMEDDS的制備工藝，即先稱取一定量的MCT、ELP35及丙三醇，磁力攪拌10 min后得到空白SMEDDS,稱取一定量的CXB加入空白SMEDDS中，磁力攪拌10 min，得到CXB-SMEDDS。

2.2 處方篩選

先通過偽三元相圖的繪制確定能發(fā)生乳化的處方比例范圍，再通過單純形網(wǎng)格法進(jìn)行處方優(yōu)化。

2.2.1 偽三元相圖的繪制 按乳化劑與助乳化劑的質(zhì)量比為1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，分別稱取相應(yīng)量的ELP35與丙三醇，再將此混合乳化劑與油相MCT按9:1～5:5的質(zhì)量比分別混勻，然后將CXB按25 mg/g的載藥量加入上述空白SMEDDS中，混勻，即得系列CXB-SMEDDS。將0.5 g CXB-SMEDDS在磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入50 ml 37 ℃蒸餾水中，觀察各CXB-SMEDDS能否發(fā)生自乳化。乳化的標(biāo)準(zhǔn)分為5個(gè)等級(jí)：A：乳化時(shí)間＜1 min，溶液呈澄清或略泛藍(lán)光；B：乳化時(shí)間＜1 min，略濁，呈藍(lán)白色；C：乳化時(shí)間1～2 min，呈亮白色不透明液體；D：乳化時(shí)間＞2 min，色澤暗，呈灰白色，略帶油狀；E：難乳化，一直有油滴存在[8]。記錄形成A、B等級(jí)微乳時(shí)MCT、ELP35及丙三醇各自的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并以各組分為三元相圖頂點(diǎn)，利用origin軟件繪制三元相圖。圖1為根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制的偽三元相圖，由圖1可知，能發(fā)生乳化的各組分比例范圍為，MCT 10 %～40 %，ELP35 9 %～81 %，丙三醇6 %～81 %。

圖1 CXB-SMEDDS的偽三元相圖

2.2.2 單純形網(wǎng)格法優(yōu)化處方 固定處方中MCT、ELP35、丙三醇的總比例為100 %，以2.2.1項(xiàng)下各組分比例范圍為基礎(chǔ)，結(jié)合單純形網(wǎng)格法比例約束及各組分一般用量，確定M C T 比例范圍為10 %～40 %，ELP35為30 %～60 %，丙三醇為30 %～60 %。以CXB-SMEDDS的平均粒徑（Y1）、多分散指數(shù)（PDI，Y2）、乳化時(shí)間（Y3）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design Expert軟件中Simplex Lattice對(duì)處方進(jìn)行設(shè)計(jì)，見表1。按表1稱取各組分，磁力攪拌10 min，得空白SMEDDS，按25 mg/g的比例稱取CXB，加入空白SMEDDS中，磁力攪拌10 min，得CXB-SMEDDS。稱取1 g CXB-SMEDDS，磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入到100 ml 37 ℃蒸餾水中。記錄乳化時(shí)間，并取部分乳液用馬爾文激光粒度分布儀測(cè)定其粒徑和PDI。

表1 單純形網(wǎng)格法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

單純形網(wǎng)格法優(yōu)化處方實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。采用Design Expert軟件，以Y1、Y2、Y3為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過模型擬合得響應(yīng)方程分別為：Y1=182.01A+18.16B+25.87C-265.30AB-232.02AC-2.08BC-2238.07A2BC+1381.37AB2C+1281.95ABC（P＜0.0001，R2=0.9994）；Y2=0.2405A+0.0707B+0.0964C-0.3584AB-0.2005AC+0.0209BC（P＜0.0001，R2=0.9660）；Y3=70.85A+8.79B+9.15C+65.78AB-63.83AC-0.5055BC-347.69A2BC+253.15AB2C+65.98ABC2（P＜0.0001，R2=0.9999）。對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，模型的P值均小于0.0001，遠(yuǎn)小于 0.05，表明模型顯著可靠；模型的回歸方程系數(shù)R2及校正決定系數(shù)（adjustR2）均大于 0.95，表明模型相關(guān)系數(shù)較高，非線性擬合的效果良好。

根據(jù)上述回歸模型，繪制三維效應(yīng)面圖，見圖2。由圖2可見，MCT用量對(duì)3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響最大，隨著MCT比例的增大，粒徑、PDI和乳化時(shí)間都逐漸增大，可能是因?yàn)殡S著油相比例增大，乳化過程變得困難，導(dǎo)致乳化時(shí)間延長(zhǎng)，形成的乳液粒徑較大，粒徑均一性也較差。ELP35用量對(duì)3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響弱于MCT，但也有一定影響，粒徑、PDI和乳化時(shí)間都隨著ELP35比例的增大而減小，表明隨著乳化劑用量的增加，CXBSMEDDS在水中更易自發(fā)形成粒徑較小的乳液。而助乳化劑丙三醇對(duì)3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響比較小，其主要起增溶藥物、促進(jìn)微乳形成并增加微乳穩(wěn)定性的作用。

圖2 各組分比例對(duì)CXB-SMEDDS的粒徑（A）、PDI（B）及乳化時(shí)間（C）影響的三維效應(yīng)面圖

2.2.3 最優(yōu)處方確定與驗(yàn)證 CXB-SMEDDS的粒徑越小，比表面積越大，藥物溶出與吸收就越快；自乳化時(shí)間越短，乳化效果越好；PDI值小于0.2時(shí)，乳液的分散性較好。綜合3個(gè)指標(biāo)，通過軟件預(yù)測(cè)得最優(yōu)處方為MCT 10 %、ELP35 59.45 %、丙三醇30.55 %。為便于實(shí)驗(yàn)操作，將處方調(diào)整為MCT 10 %、ELP35 60 %、丙三醇30 %。根據(jù)預(yù)測(cè)的最優(yōu)處方制備 3 批CXB-SMEDDS，測(cè)定其粒徑、PDI與乳化時(shí)間，計(jì)算預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的偏差，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，各評(píng)價(jià)指標(biāo)的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的偏差較小，說明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)效果。

表2 最優(yōu)處方驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（ ±s，n=3）

表2 最優(yōu)處方驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（ ±s，n=3）

評(píng)價(jià)指標(biāo)預(yù)測(cè)值實(shí)測(cè)值偏差/%粒徑/nm15.5316.21±0.724.38 PDI0.0660.072±0.0112.26乳化時(shí)間/s8.748.42±0.633.66

2.3 CXB-SMEDDS的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 外觀性狀 將新鮮制備的CXB-SMEDDS置于西林瓶中，肉眼觀察其外觀性狀，見圖3。稱取CXB-SMEDDS 1 g，磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入到100 ml 37 ℃蒸餾水中，觀察乳液的外觀性狀。由圖3A可見，CXB-SMEDDS在室溫（25 ℃）下呈無色透明溶液，流動(dòng)性較好。由圖3B可見，CXB自乳化后能形成略泛藍(lán)光的溶液。

圖3 CXB-SMEDDS自乳化前（A）和自乳化后（B）的外觀性狀

2.3.2 微觀形態(tài) 采用透射電子顯微鏡觀察CXBSMEDDS的微觀形態(tài)。稱取CXB-SMEDDS 1 g，磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入37 ℃蒸餾水100 ml中，得到CXB乳液。將該乳液滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，靜置10 min，再滴加1 %磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上，負(fù)染2 min后用濾紙片吸干，過夜干燥，透射電鏡下觀察，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，CXBSMEDDS 自乳化后形成的乳滴呈均一的圓球形，粒徑為20 nm左右。

圖4 CXB-SMEDDS的透射電鏡圖

2.3.3 粒徑與電位分布 稱取CXB-SMEDDS 1 g，磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入到100 ml 37 ℃蒸餾水中，得到CXB乳液。用Malvern激光粒度分布與電勢(shì)分析儀測(cè)定該乳液平均粒徑及Zeta電位分布，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，CXB-SMEDDS自乳化后形成的乳滴的平均粒徑為（16.21±0.72）nm，粒徑較小。PDI為0.072±0.011，表明粒度分布比較均勻。電位為（-15.8±1.2）mV。

圖5 CXB-SMEDDS和CXB原料藥在水（A）、pH 1.2鹽酸溶液（B）、pH 4.5醋酸鹽溶液（C）和pH 6.8磷酸鹽溶液（D）中的溶出曲線

2.3.4 載藥量與包封率

2.3.4.1 CXB的含量測(cè)定 采用紫外分光光度法測(cè)定CXB的含量。精密稱取CXB原料藥細(xì)粉30.00 mg，置于100 ml量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，并用甲醇稀釋至刻度，配成300 μg/ml的儲(chǔ)備液。精密移取200 μl儲(chǔ)備液至10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，得6 μg/ml的溶液，紫外掃描確定CXB的最大吸收波長(zhǎng)。精密移取儲(chǔ)備液50，100，200，300，400，500 μl至10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，于最大波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述步驟配制低、中、高3種不同濃度的溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率和精密度。結(jié)果顯示，CXB在甲醇中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0563x-0.0143，R2=0.9998,表明CXB在1.5～15 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；厥章屎途芏仍囼?yàn)的結(jié)果也表明，本含量測(cè)定方法的回收率與精密度良好。

2.3.4.2 載藥量與包封率的測(cè)定 精密稱取1.0000 g CXB-SMEDDS（其中含CXB的量為W0），置于100 ml量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，并用甲醇稀釋至刻度，配成儲(chǔ)備液。精密移取500 μl儲(chǔ)備液至10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，于最大波長(zhǎng)條件下測(cè)定其吸光度，按2.2.4.1 項(xiàng)下方法計(jì)算其藥物含量（W1）。精密稱取1.0000 g CXB-SMEDDS，磁力攪拌條件下（100 r/min）緩慢加入100 ml 37 ℃蒸餾水中，得CXB乳液。取該乳液2 ml，置于離心管中，10 000 r/min離心 15 min，精密移取上清500 μl至10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于最大波長(zhǎng)條件下測(cè)定其吸光度，按2.2.4.1 項(xiàng)下方法計(jì)算其藥物含量（W2）。根據(jù)公式：載藥量=W1/W0，包封率=W2/W1，計(jì)算相應(yīng)的載藥量與包封率。最終測(cè)得CXB-SMEDDS的載藥量為標(biāo)示量的101.42 %±0.29 %，包封率為98.05 %±0.18 %，均符合要求。

2.4 CXB-SMEDDS的體外溶出評(píng)價(jià)

2.4.1 CXB溶出度測(cè)定方法的建立 建立CXB在4種不同溶出介質(zhì)（水、pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽溶液、pH 6.8磷酸鹽溶液）中的含量測(cè)定方法。精密稱取CXB原料藥細(xì)粉 15.00 mg，置于100 ml量瓶中，加適量溶出介質(zhì)（含SDS）超聲溶解，并稀釋至刻度，配成150 μg/ml儲(chǔ)備液。精密移取400 μl儲(chǔ)備液至10 ml量瓶，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，得6 μg/ml的溶液，紫外掃描確定CXB的最大吸收波長(zhǎng)。精密移取儲(chǔ)備液100，200，400，600，800，1000 μl至 10 ml量瓶，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，于最大波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C（μg/ml）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述步驟配制低、中、高3種不同濃度的溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率和精密度。結(jié)果見表3。由表3可知，本方法回收率與精密度良好，CXB在各溶出介質(zhì)中線性關(guān)系良好。

表3 CXB在各溶出介質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度與回收率測(cè)定結(jié)果

2.4.2 CXB-SMEDDS體外溶出度的測(cè)定 按《中國(guó)藥典》2020年版溶出度測(cè)定法第二法（槳法）進(jìn)行CXB-SMEDDS的溶出度測(cè)定。溶出度測(cè)定要求為：溶出介質(zhì)為水、pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽溶液及pH 6.8磷酸鹽溶液，溶出介質(zhì)的體積為500 ml，轉(zhuǎn)速為 50 r/min，溫度為（37±0.5）℃。精密稱取原料藥12.50 mg和CXB-SMEDDS 0.5000 g，分別投入溶出杯中，分別于 5，10，15，30，45，60，90，120 min取樣7 ml，并及時(shí)補(bǔ)入同溫度介質(zhì)7 ml，所取樣品用0. 45 μm微孔濾膜濾過。按2.4.1項(xiàng)下方法，測(cè)定溶出量，繪制溶出曲線。

CXB-SMEDDS和CXB原料藥在各介質(zhì)中的溶出曲線見圖5。由圖5可見，CXB原料藥在各介質(zhì)中的溶出都比較少，24 h內(nèi)累積溶出度均小于10 %，表明原料藥較差的水溶性限制了其溶出。而CXB-SMEDDS在4種溶出介質(zhì)的溶出均較快，5 min內(nèi)平均溶出度大于43.94 %，45 min的累積溶出度達(dá)到了87.48 %以上，此后一直維持在這個(gè)水平，溶出較完全。CXB-SMEDDS在各個(gè)介質(zhì)中溶出行為沒有差異，可以預(yù)測(cè)CXB-SMEDDS口服后在胃以及小腸、十二指腸等部位的溶出行為也相似，都能實(shí)現(xiàn)較快較完全的溶出。綜上，與CXB原料藥相比，CXB-SMEDDS的溶出度大大提高，由此推測(cè)，將CXB制成CXB-SMEDDS后可改善CXB的胃腸道吸收，大大提高CXB的口服生物利用度。

3 討論

SMEDDS體系通常由油相、乳化劑及助乳化劑組成，油相對(duì)SMEDDS的形成十分重要。本研究選擇MCT作為油相，是因?yàn)镸CT是脂溶性藥物強(qiáng)大的增溶劑，CXB在MCT中的溶解度可達(dá)到載藥量的要求，同時(shí)MCT脂肪鏈較短，易微乳化，消化吸收快。且MCT還具有很多其他優(yōu)良性質(zhì)，如安全性高、預(yù)防肥胖、抗疲勞及提高免疫力等[9]。

篩選最佳處方是制備SMEDDS的中心環(huán)節(jié)。SMEDDS一般先通過偽三元相圖的繪制，確定能發(fā)生自乳化的各因素的比例范圍，再通過單純網(wǎng)格優(yōu)化確定各因素的最佳比例。當(dāng)實(shí)驗(yàn)因素總量恒定時(shí)，單純形網(wǎng)格法僅需確定各因素比例范圍就可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)其他點(diǎn)的性能，被廣泛用于SMEDDS制劑處方優(yōu)選[7]。與其他方法相比，單純形網(wǎng)格法可通過較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，確定最優(yōu)處方，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，且預(yù)測(cè)性良好[10]。使用單純形網(wǎng)格法優(yōu)化處方時(shí)，把粒徑、PDI、乳化時(shí)間作為參考因素，這是因?yàn)镾MEDDS粒徑越小，比表面積越大，越容易被吸收；較小的PDI可保證乳液的分散性；乳化時(shí)間越短，自乳化過程越容易進(jìn)行?？傊?，合適的粒徑、PDI、乳化時(shí)間可保證SMEDDS優(yōu)良的體內(nèi)外性質(zhì)。

體外溶出試驗(yàn)結(jié)果表明與C X B 原料藥相比，CXB-SMEDDS的溶出度大大提高，據(jù)此預(yù)測(cè)，CXB-SMEDDS可提高CXB的口服生物利用度。體外溶出試驗(yàn)可以一定程度上預(yù)測(cè)藥物的體內(nèi)行為，但體外溶出并不能完全模擬藥物的體內(nèi)吸收情況，因此后續(xù)試驗(yàn)還可以進(jìn)行CXB-SMEDDS的藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)，通過測(cè)定CXB原料藥和CXB-SMEDDS的血藥濃度，進(jìn)一步驗(yàn)證CXB-SMEDDS確實(shí)能大大提高CXB的體內(nèi)吸收[11]。同時(shí)，還可比較體內(nèi)體外試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行體內(nèi)外相關(guān)性研究。