HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地木棉花藥材質(zhì)量

黎桃敏，陳丹燕，余欣彤，甘力帆，張?zhí)m蘭，黃 森，魏 梅*

（1. 廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；2. 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

木棉花又名攀枝花、紅茉莉、紅棉花、英雄樹花，是木棉科植物木棉Gossampinus malabarica(DC.) Merr.的干燥花，性涼，具清熱利濕、解毒功效，可用于治療泄瀉，痢疾，痔瘡出血等癥，主產(chǎn)于云南、廣東、廣西、海南、福建、臺(tái)灣等地[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，木棉花藥材的化學(xué)成分主要有黃酮類化合物、苯丙素類化合物、有機(jī)酸及酯類化合物等，在抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝等方面有重要的藥理作用[2-4]。

木棉花是我國南方地區(qū)常用的一味藥食同源中藥材，民間藥用經(jīng)驗(yàn)豐富[5-6]，但由于其產(chǎn)地多、生長環(huán)境不同，藥材質(zhì)量難以控制。2020年版《中國藥典》一部木棉花項(xiàng)下僅規(guī)定了性狀、鑒別、浸出物檢驗(yàn)項(xiàng)，難以判別藥材質(zhì)量優(yōu)劣?，F(xiàn)行的中藥材質(zhì)量控制模式主要有指標(biāo)成分含量測(cè)定和指紋圖譜技術(shù)[7-10]。目前已有木棉花花萼高效液相色譜（HPLC）含量測(cè)定方法的文獻(xiàn)報(bào)道[11]，但尚無采用HPLC指紋圖譜評(píng)價(jià)木棉花藥材質(zhì)量的相關(guān)報(bào)道。本研究通過建立木棉花HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法研究不同產(chǎn)地木棉花藥材質(zhì)量差異，明確質(zhì)量差異標(biāo)志物，以期為木棉花藥材資源評(píng)價(jià)及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XP26型百萬分之一天平，ME204E型萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（德國Merck公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；111B型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)：110809-201906，純度：97.7 %），芒果苷對(duì)照品（批號(hào)：111607-201704，純度：98.1 %），蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201811，純度：91.7 %，中國食品藥品檢定研究院）；新綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：151217，純度：98.5 %，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；乙腈，甲醇為色譜級(jí)（德國Merck公司），磷酸為色譜級(jí)（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

15批木棉花藥材（編號(hào)：Y1～Y15）經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，均符合2020年版《中國藥典》一部木棉花項(xiàng)下要求。樣品來源及編號(hào)分別為云南?。ň幪?hào)：Y1～Y6，Y10～Y12），海南省（編號(hào)：Y7～Y9），廣西壯族自治區(qū)（編號(hào)：Y13～Y15）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[12]

色譜柱：Waters Xselect HSS T3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，5 %A→10 %A；15～30 min，10 %A→17 %A；30～40 min，17 %A→18 %A；40～41 min，18 %A→5 %A；41～45 min，5 %A）；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長：230 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

分別取原兒茶酸、新綠原酸、芒果苷、蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加入50 %甲醇，制成每1 ml分別含84.804，43.096，41.594，48.513 μg的混合對(duì)照品貯備液。另取芒果苷對(duì)照品適量，精密稱定，加入50 %甲醇，制成每1 ml含芒果苷42.771 μg的對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

取木棉花藥材粉末（過三號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定重量，用50 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 HPLC指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。計(jì)算得各色譜峰峰面積的RSD均小于3.0 %，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取木棉花藥材（Y5）粉末，精密稱定，平行稱定6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以4號(hào)芒果苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取木棉花藥材（Y5）粉末，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以4號(hào)芒果苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取15批木棉花藥材，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將15批木棉花藥材色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）軟件中，以Y1樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜，將時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行色譜峰匹配，選擇中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜R，計(jì)算各批次木棉花藥材與對(duì)照指紋圖譜R的相似度。15批木棉花藥材的HPLC指紋圖譜見圖2，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表1。15批木棉花藥材指紋圖譜共標(biāo)記了8個(gè)共有峰，通過與對(duì)照品圖譜對(duì)比，指認(rèn)了4個(gè)共有峰，分別為原兒茶酸（峰2），新綠原酸（峰3），芒果苷（峰4）和蘆?。ǚ?）。15批木棉花藥材指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜R的相似度均大于0.990，表明不同批次木棉花藥材的整體質(zhì)量較一致，為進(jìn)一步探究不同產(chǎn)地樣品內(nèi)在成分的差異性，還需結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分析。

表1 15批木棉花藥材HPLC指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

圖2 15批木棉花藥材的HPLC指紋圖譜疊加圖

2.6 化學(xué)計(jì)量學(xué)方法評(píng)價(jià)

2.6.1 熱圖聚類分析（CA） 以8個(gè)共有峰的峰面積為變量，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用線性歸一化法，以Euclidean平方距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，利用HemI 1.0軟件對(duì)15批木棉花藥材指紋圖譜進(jìn)行熱圖和聚類分析，結(jié)果見圖3。

圖3 15批木棉花藥材HPLC指紋圖譜熱圖聚類分析圖

聚類分析結(jié)果顯示15批木棉花藥材可大致聚為2類，其中海南3批藥材（Y7～Y9）聚為I-a類，廣西3批藥材（Y13～Y15）聚為I-b類，9批云南藥材（Y1～Y6、Y10～12）聚為II類。說明不同產(chǎn)地的木棉花藥材之間存在一定差異，海南與廣西的藥材質(zhì)量更接近。

熱圖分析以一種漸進(jìn)的藍(lán)紅色將結(jié)果直觀展現(xiàn)出來，其顏色代表歸一化后的值，值越高顏色越紅，值越低顏色越藍(lán)，可用于反映研究對(duì)象化學(xué)成分的含量高低[13-14]。熱圖分析結(jié)果顯示不同產(chǎn)地木棉花藥材的化學(xué)成分含量差異較大，其中云南9份樣品（Y1～Y6、Y10～12）各特征峰顏色整體偏暖，表明其各成分含量普遍較高；廣西3份樣品（Y13～Y15）各特征峰顏色整體偏冷，表明其各成分含量普遍較低；海南3份樣品（Y7～Y9）的峰2（原兒茶酸）顏色偏暖，其他特征峰顏色整體呈藍(lán)色，說明除原兒茶酸外，其他成分的含量普遍較云南、廣西要低。

2.6.2 主成分分析（PCA） 主成分分析可根據(jù)實(shí)際需要提取少數(shù)幾個(gè)互相獨(dú)立的綜合指標(biāo)變量，以盡可能反映原有變量信息，是一種科學(xué)有效的降維方法[15]。以各共有峰的峰面積為變量，采用SPSS 20.0軟件對(duì)15批木棉花藥材的峰面積數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理，并進(jìn)行因子分析，計(jì)算得特征值和方差貢獻(xiàn)率，見表2，旋轉(zhuǎn)成分矩陣見表3。以特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)提取主成分，提取出前2個(gè)主成分，主成分1和主成分2的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)83.938 %，表明前2個(gè)主成分能反映樣品中絕大部分的原變量信息，是影響木棉花藥材質(zhì)量差異的重要因素。由表3可知，以載荷系數(shù)絕對(duì)值≥0.60為選取標(biāo)準(zhǔn)，主成分因子1所反映的色譜峰有峰1、新綠原酸、芒果苷、峰5、峰6和峰8，主成分因子2所反映的色譜峰有原兒茶酸和蘆丁。

表2 特征值和方差貢獻(xiàn)率

表3 旋轉(zhuǎn)成分矩陣

2.6.3 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）為進(jìn)一步篩選影響不同產(chǎn)地木棉花藥材質(zhì)量差異的標(biāo)志物，將15批木棉花藥材的共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，采用監(jiān)督模式識(shí)別法進(jìn)行OPLSDA，并繪制OPLS-DA模型得分圖，見圖4。所得OPLS-DA模型中的擬合參數(shù)R2X=0.956，R2Y=0.952，模型預(yù)測(cè)參數(shù)（Q2）=0.927>0.5，表明建立的模型良好且預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)。樣品分布距離越遠(yuǎn)表明差異性越大[16]，由圖4可見，3個(gè)產(chǎn)地藥材間的距離均較遠(yuǎn)，各自聚為一類，表明不同產(chǎn)地的木棉花藥材之間存在明顯差異。

圖4 15批木棉花藥材HPLC指紋圖譜的OPLS-DA得分圖

以模型變量投影重要性（VIP）值＞1為指標(biāo)篩選15批木棉花藥材的差異成分，見圖5。VIP值越高，對(duì)組間差異的影響越大。結(jié)果顯示峰4和峰8的VIP值大于1，說明這2個(gè)色譜峰所代表的化學(xué)成分是引起不同產(chǎn)地木棉花藥材質(zhì)量差異的標(biāo)志物。由于2個(gè)色譜峰只指認(rèn)了4號(hào)色譜峰為芒果苷，故選擇芒果苷作為質(zhì)量差異成分對(duì)15批木棉花藥材進(jìn)行含量測(cè)定。

圖5 15批木棉花藥材HPLC指紋圖譜的OPLS-DA VIP值

2.7 芒果苷含量測(cè)定

2.7.1 線性關(guān)系考察 取芒果苷對(duì)照品適量，精密稱定，加入50 %甲醇，制成每1 ml含芒果苷285.275 μg的對(duì)照品母液。精密吸取芒果苷對(duì)照品母液適量，加50 %甲醇制成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得芒果苷線性回歸方程為Y=2.158×103X-2.793×103（r=0.9993），結(jié)果表明芒果苷質(zhì)量濃度在2.853～285.275 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下芒果苷對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。計(jì)算得芒果苷峰面積的RSD為0.45 %，表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取木棉花藥材（Y5）粉末，精密稱定，平行稱定6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。計(jì)算得芒果苷含量的RSD為0.51 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取木棉花藥材（Y5）粉末，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。計(jì)算得芒果苷含量的RSD為0.32 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知芒果苷含有量的木棉花藥材粉末，精密稱取9份，每份約0.5 g，置具塞錐形瓶中，均分為3組，每組分別精密加入相當(dāng)于含有量50 %，100 %，150 %的芒果苷對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果見表4，芒果苷的平均加樣回收率為101.04 %，RSD為1.57 %，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表4 芒果苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.8 Spearman相關(guān)分析

取15批木棉花藥材，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，芒果苷含量測(cè)定結(jié)果見表5?；赑CA模型，將主成分因子得分與其方差貢獻(xiàn)率乘積之和相加[17]，計(jì)算15批木棉花藥材指紋圖譜的綜合評(píng)分F，結(jié)果見表5。采用SPSS 20.0軟件對(duì)15批木棉花藥材的芒果苷含量與其指紋圖譜綜合評(píng)分進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果兩者的相關(guān)系數(shù)r為0.975（P<0.01），表明芒果苷含量與指紋圖譜綜合評(píng)分呈顯著正相關(guān)性。由表5可見，芒果苷含量和指紋圖譜綜合得分排名前9的木棉花藥材均為云南產(chǎn)地，表明云南產(chǎn)地的木棉花藥材質(zhì)量較好。

表5 15批木棉花藥材芒果苷含量及指紋圖譜綜合評(píng)分結(jié)果

3 討論

研究結(jié)果表明，15批木棉花藥材指紋圖譜的CA結(jié)果分為2類，海南樣品與廣西樣品分別聚為I-a、I-b類，云南產(chǎn)樣品聚為II類。說明3個(gè)產(chǎn)地的藥材質(zhì)量差異較大，其中海南與廣西的藥材質(zhì)量相對(duì)較接近，這可能與地理位置、氣候環(huán)境等因素有關(guān)。熱圖分析結(jié)果顯示不同產(chǎn)地間木棉花藥材的化學(xué)成分含量存在差異。經(jīng)OPLS-DA篩選出2個(gè)主要影響藥材質(zhì)量的差異成分，通過對(duì)照品的指認(rèn)，僅可確定其中1種成分（芒果苷），后續(xù)可結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)未知的色譜峰成分進(jìn)行指認(rèn)。指紋圖譜綜合評(píng)分、芒果苷含量測(cè)定等結(jié)果均表明不同產(chǎn)地木棉花藥材質(zhì)量存在一定差異，其中云南產(chǎn)的木棉花藥材質(zhì)量更優(yōu)。另本研究收集到的木棉花藥材樣品共15批，所屬產(chǎn)地僅3個(gè)，后續(xù)可增加多個(gè)其他產(chǎn)地的樣品，并加大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以獲得可靠的數(shù)據(jù)，為篩選優(yōu)良種質(zhì)木棉花藥材提供參考。

近年，化學(xué)計(jì)量學(xué)在中藥制劑各環(huán)節(jié)和質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用愈為常見，其中在藥材收集環(huán)節(jié)中的應(yīng)用，旨在對(duì)藥材進(jìn)行分類和鑒別，從藥材源頭控制中藥產(chǎn)品的質(zhì)量，以保證用于制備中藥制劑的原藥材一致性良好。本研究構(gòu)建的指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的綜合評(píng)價(jià)體系，能成功應(yīng)用于不同產(chǎn)地木棉花藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)，可為木棉花藥材資源評(píng)價(jià)提供理論支撐，也對(duì)木棉花相關(guān)制劑生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制具有一定的指導(dǎo)作用。