雪蓮果葉UPLC-ECD指紋圖譜及其抗氧化活性成分研究

丁小倩，李姿瑤，王 艷，何 婷，陳榮祥，袁曉艷

（遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 分析化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099）

雪蓮果（Smallanthus Sonchifolius），又稱亞貢（yacon），是菊科Smallanthus屬多年生草本植物，原產(chǎn)于安迪斯山脈的中高原地帶，目前在日本、巴西、韓國、中國等多個(gè)國家均有引種，我國境內(nèi)主要分布于云南、貴州、四川等地區(qū)[1]。研究表明，雪蓮果中含豐富的酚酸、黃酮和低聚果糖類成分[2-3]，該類成分被認(rèn)為具有抗氧化、降血脂、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[4-5]。雪蓮果葉研究及應(yīng)用較少，民間將其加工為飲料或糖漿用于降血脂及預(yù)防因自由基過剩引起的慢性疾病[6]。事實(shí)上酚酸黃酮類物質(zhì)主要集中在雪蓮果的葉子中，Khajehei 等[7-8]的研究顯示，雪蓮果葉的總酚含量在(53.39±1.94) mg/g～(76.67±21.67) mg/g范圍內(nèi)，遠(yuǎn)高于其塊莖中的酚酸含量，因此雪蓮果葉具有較強(qiáng)的抗氧化能力。已有研究人員將其研制為清咽含片[9]，研究其降血糖含片工藝[10]、制茶工藝[11]，因而篩選雪蓮果葉的抗氧化成分有利于雪蓮果葉進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用。

電化學(xué)檢測器（electrochemical detector，ECD），用于選擇性檢測具有氧化還原性的物質(zhì)，靈敏度高，能輔助篩選中藥中的抗氧化成分[12]，如帶有硝基、巰基、酚羥基等基團(tuán)的有機(jī)化合物，因此適用于檢測含大量酚酸類成分的雪蓮果葉。前期研究發(fā)現(xiàn)，所建ECD分析方法得到的藥材譜圖中峰面積與其抗氧化能力具有相關(guān)性，同時(shí)圖譜中的成分均有較強(qiáng)的抗氧化能力[13-14]，因此采用ECD篩選抗氧化成分的方法具有可靠性。本研究通過UPLCECD法建立指紋圖譜，尋找雪蓮果葉抗氧化活性成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC-Xevo TQ-S超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（配有MassLynx V.4.1工作站軟件，美國Waters）；Thermo UltiMate 3000 bio-RS超高效液相色譜儀（配有Chromeleon 7.2工作站，ECD-3000 RS電化學(xué)檢測器，賽默飛世爾）；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝）；ME104E/02型電子天平（梅特勒-托利多）；ThermoST8R小型臺式離心機(jī)（賽默飛世爾）；埃爾格Purelab Chorus 2超純水系統(tǒng)（英國埃爾格）；Multiskan FC酶標(biāo)儀（賽默飛世爾）。

1.2 試藥

雪蓮果葉藥材采集于四川、云南、貴州多個(gè)產(chǎn)地，具體信息見表1。經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張玉金副教授鑒定為菊科Smallanthus屬亞貢（Smallanthus Sonchifolius）的新鮮葉子。

表1 雪蓮果葉藥材來源

乙腈（色譜純，北京伊諾凱）；甲酸（分析純，賽默飛世爾）；無水乙酸鈉（分析純，重慶川東化工）；3, 7-二-O-甲基異槲皮苷對照品（HPLC純度≥98 %，成都埃法）；蘆丁，異槲皮苷，異綠原酸A對照品（HPLC純度≥98 %）以及福林酚，三氯化鐵六水合物，氫氧化鈉，無水碳酸鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，硫酸亞鐵七水合物，過硫酸鉀，冰乙酸，生育酚，檸檬酸鉀，2, 2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），4, 4’-二（1H-1, 2, 4-三唑-1-基）-1, 1’-聯(lián)苯（TPTZ），1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等試劑均為分析純（上海阿拉?。?。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 供試溶液制備 將10批新鮮雪蓮果葉置烘箱，50 °C烘干至恒重，取適量干燥雪蓮果葉，粉碎，分別稱取1 g粉末，加入70 %乙醇10 ml，超聲提取30 min，10 000 r/min離心5 min，取5 ml上清，用70 %乙醇定容至20 ml，0.22 μm濾膜過濾得樣品溶液。分別取10批藥材樣品溶液0.1 ml，混勻得混合樣品溶液。

2.1.2 混合對照品溶液的配制 分別取蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸A對照品1 mg，用70 %乙醇定容至100 ml量瓶，得0.01 mg/ml混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：XBrigde BEH Shield RP18（3 mm×150 mm，2.5 μm）；流動相：0.1 %甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～14 min，95 %A～77 %A；14～24 min，77 %A～72 %A；24～32 min，72 %A～57 %A；32～37 min，57 %A～0 %A；37～39 min，0 %A～0 %A；39～43 min，0 %A～95 %A）；因ECD需要高濃度的鹽[15]，所以將100 mmol/L檸檬酸鉀溶液以0.1 ml/min的流速于色譜柱后，檢測器前的位置補(bǔ)充；流速：0.4 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：3 μl；電化學(xué)檢測池電流：600 nA。

2.1.4 指紋圖譜分析方法 取2.1.1項(xiàng)下10批樣品溶液和2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄43 min的色譜圖。UPLC指紋圖譜見圖1，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行分析，得UPLC對照指紋圖譜（見圖2）。以UPLC對照指紋圖譜為參照圖譜，進(jìn)行10批樣品的相似度評價(jià)，結(jié)果見表2，10批樣品的相似度在0.983～0.754之間。10批雪蓮果葉樣品共有12個(gè)共有峰，選取共有峰中分離度大，峰形好，峰面積適中的6號峰作為參照峰，計(jì)算其余峰的相對峰面積，結(jié)果見表3。

圖1 10批雪蓮果葉樣品UPLC-ECD指紋圖譜

圖2 雪蓮果葉UPLC對照指紋圖譜

表2 10批雪蓮果葉樣品相似度評價(jià)結(jié)果

表3 10批雪蓮果葉樣品UPLC圖譜共有峰相對峰面積

2.2 共有峰的鑒別

2.2.1 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，負(fù)離子檢測模式下多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；蒸發(fā)溫度：600 °C；氣流量：750 L/h。

2.2.2 鑒別方法及結(jié)果 根據(jù)對照品離子對并參考文獻(xiàn)中報(bào)道的離子對[16]，得化合物質(zhì)譜參數(shù)，見表4。取2.1.2項(xiàng)下混合對照品溶液和2.1.1項(xiàng)下混合樣品溶液，按2.1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測。通過對比UPLC-ECD混合對照品色譜圖（圖3）、UPLCECD指紋圖譜（圖1）、UPLC-MS所得混合樣品和混合對照品的圖譜（圖4、圖5），將1，6，7，8，9，11號峰分別指認(rèn)為咖啡酰葡萄糖二酸、雙咖啡酰太洛黏酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸A和2, 3,5-或2, 4, 5-三咖啡酰太洛黏酸。

圖3 混合對照品UPLC圖譜

圖4 混合樣品UPLC-MS圖譜

圖5 混合對照品UPLC-MS圖譜

表4 UPLC-MS鑒定雪蓮果葉中的成分

2.3 聚類分析

采用SPSS 26軟件進(jìn)行聚類分析。以10批藥材樣品12個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用組間連接法，當(dāng)歐式距離為12時(shí)，10批雪蓮果葉藥材可分為兩類，S5、S7為一類，S1～S4、S6、S8～S10為第二類，提示這兩類雪蓮果葉樣品存在質(zhì)量差異，詳見圖6。

圖6 聚類分析樹狀圖

2.4 總酚含量分析

總酚含量的測定采用福林-酚比色法。分別取2.1.1項(xiàng)下供試品溶液0.5 ml，加入0.5 ml福林酚試劑（0.25 mol/L），反應(yīng)3 min，加15 % Na2CO31 ml，混勻，反應(yīng)30 min后，3500 r/min離心3 min，取上清，760 nm下測得吸光度。配制濃度為0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按上述方法測定，得回歸方程y=115.77x+0.074，R2=0.9988?？偡咏Y(jié)果表示為每克雪蓮果葉中所含沒食子酸當(dāng)量（mg/g），由結(jié)果可知，第一類雪蓮果葉S5、S7的總酚含量明顯高于第二類雪蓮果葉，詳見表5。此外，將Origin軟件中不同批次雪蓮果葉UPLC指紋圖譜的總峰面積和總酚含量結(jié)果進(jìn)行線性回歸，發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān)，說明在所采用的色譜條件下，ECD檢測器檢測到的主要化合物為酚酸類化合物。

表5 不同產(chǎn)地雪蓮果葉總酚含量測定結(jié)果

2.5 抗氧化活性成分

2.5.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) DPPH自由基清除率的測定基于Abbas等[17]的方法并稍作修改。取適量DPPH，用80 %甲醇溶液溶解并稀釋至0.1 mg/ml，得DPPH工作液。取10批藥材粉末，加10倍量70 %乙醇（w/v），超聲提取30 min后得樣品溶液。樣品溶液S5、S7用80 %甲醇稀釋10倍，其余樣品溶液稀釋5倍后，分別取40 μl，用80 %甲醇稀釋至200 μl，混勻后加入DPPH工作液400 μl，搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，使用酶標(biāo)儀在517 nm處測定溶液的吸光度，平行操作3次。結(jié)果見表6。

表6 抗氧化活性測定結(jié)果

2.5.2 ABTS+˙清除實(shí)驗(yàn) ABTS+˙清除能力測定參考Rajakumari等[18]的方法并稍作修改。取3.75 mg/ml ABTS溶液1.6 ml和0.67 mg/ml的過硫酸鉀溶液各3 ml，混合，室溫、避光條件下靜置反應(yīng)12～16 h，制備成ABTS+˙儲備液。將ABTS+˙儲備液用水稀釋，使其在734 nm波長處的吸光度在0.7～0.8之間，得ABTS+˙工作液。取10批藥材粉末，加10倍量70 %乙醇（w/v），超聲提取30 min后得樣品溶液，將S1、S2、S4、S6用水3:7（v/v）稀釋，S3、S8～S10用水稀釋5倍，S5、S7用水稀釋10倍。測定時(shí)取0，20，60，100，140，200 μl稀釋后的樣品溶液，加水稀釋至200 μl，搖勻，加400 μl ABTS+˙工作液，混勻后于室溫下反應(yīng)30 min，734 nm波長處測定吸光度，重復(fù)操作3次。

2.5.3 Fe3＋還原能力實(shí)驗(yàn)（FRAP實(shí)驗(yàn)） Fe3＋還原能力參考Adedayo等[19]的方法并稍作修改。TPTZ溶液由5 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、9 mmol/L TPTZ工作液（用40 mmol/L鹽酸溶解，37 ℃提前預(yù)熱30 min）、20 mmol/L FeCl3溶液（10:1:1，v/v/v）組成，現(xiàn)配現(xiàn)用。取10批藥材粉末，加10倍量70 %乙醇（w/v），超聲提取30 min后得樣品溶液，分別用水稀釋30倍，準(zhǔn)確量取100 μl樣品稀釋液，加入300 μl TPTZ工作液，混勻后反應(yīng)5 min，于593 nm波長處測定吸光度，重復(fù)操作3次。

DPPH、ABTS、TRAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表示為生育酚當(dāng)量。DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合為y=-0.0202x+0.817，R2=0.9918；ABTS+˙清除實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合為y=-0.0217x+1.3891，R2=0.9958；FRAP實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合為y=0.0396x+0.0489，R2=0.9998?？寡趸钚詼y定結(jié)果詳見表6 。

2.5.4 灰色關(guān)聯(lián)度分析 參考文獻(xiàn)[20]方法，采用均值法對10批樣品的抗氧化結(jié)果進(jìn)行無量綱化處理，將雪蓮果葉抗氧化結(jié)果作為母序列[記為Y(k)]，共有峰峰面積作為子序列[記為X(k)]，按下式計(jì)算母序列與子序列的關(guān)聯(lián)度系數(shù)[p(k)]。

式中ρ為分辨系數(shù)，通常情況下取0.5；Δ(k)為母序列與子序列差的絕對值；Δ(k)min為第二級最小差；Δ(k)max為第二級最大差。

按下式計(jì)算關(guān)聯(lián)度。

式中，n為樣品數(shù)量。

采用SPSS軟件計(jì)算得灰色關(guān)聯(lián)度，12個(gè)共有峰的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，詳見表7、表8。

表7 灰色關(guān)聯(lián)母序列及子序列

表8 雪蓮果葉12種共有成分抗氧化活性與峰面積的關(guān)聯(lián)度

抗氧化活性檢測中S5和S7清除DPPH自由基的能力高出其余批次1.69～5.47倍，清除ABTS+˙能力高出3.26～9.08倍，F(xiàn)e3+還原能力高出2.19～9.47倍，說明第一類雪蓮果葉質(zhì)量較好，抗氧化能力優(yōu)于第二類。

在灰色關(guān)聯(lián)分析中，關(guān)聯(lián)度R介于0～1之間，該值越大代表其與母序列之間的相關(guān)性越強(qiáng)，當(dāng)R>0.6時(shí)，表示該成分與藥效指標(biāo)有關(guān)聯(lián)性，當(dāng)R>0.8時(shí)，表示該成分與藥效指標(biāo)有較大關(guān)聯(lián)性[21]。在灰色關(guān)聯(lián)分析結(jié)果中，12個(gè)共有峰的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，說明ECD所建指紋圖譜中所有共有成分均具有抗氧化能力，再次證明了使用ECD篩查抗氧化成分的有效性和可靠性。

3 討論

本研究建立了10批雪蓮果葉的UPLC-ECD指紋圖譜，并結(jié)合UPLC-MS鑒定出6種成分。聚類分析結(jié)果顯示，10批雪蓮果葉樣品可分為兩類，S5、S7為第一類，其余樣品為第二類，結(jié)合總酚結(jié)果和抗氧化結(jié)果可知，第一類雪蓮果葉的總酚含量高于第二類，抗氧化能力也高出第二類，證明第一類雪蓮果葉的質(zhì)量優(yōu)于第二類。前期研究中曾使用PDA 2695、DAD等紫外檢測器，但所得譜圖復(fù)雜，有諸多雜峰，且分析時(shí)間長。本文采用的方法具有選擇性，能大幅改善上述情況，即通過ECD突出的篩選能力，僅留下抗氧化成分，從而使圖譜簡化，分析時(shí)間縮短。本實(shí)驗(yàn)中不同批次雪蓮果葉總酚的含量與其對應(yīng)的色譜圖總峰面積具有相關(guān)性，同時(shí)灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果顯示12個(gè)共有峰與抗氧化活性均具有相關(guān)性，證明了該方法的有效性與可靠性。

綜上，所建ECD篩選分析方法能有效篩選藥材中的抗氧化成分，所建指紋圖譜及聚類分析可用于雪蓮果葉的質(zhì)量評價(jià)。