含Pm21基因的次級易位創(chuàng)制及鑒定

張藍(lán)月 羅江陶 范超蘭 李亞洲 姜 博 陳 雪 陳雪姣 袁中偉 甯順腙 張連全 劉登才,* 郝 明,*

含基因的次級易位創(chuàng)制及鑒定

張藍(lán)月1,**羅江陶2,**范超蘭1李亞洲1姜 博1陳 雪1陳雪姣1袁中偉1甯順腙1張連全3劉登才3,*郝 明1,*

1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所, 四川溫江 611130;2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 四川錦江 610066;3西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點實驗室, 四川溫江 611130

小麥-簇毛麥6VS.6AL易位攜帶抗白粉病基因, 對我國小麥抗白粉病育種做出了重要貢獻(xiàn)。本文對162份四川小麥品種(系)的55K SNP芯片數(shù)據(jù)分析表明, 25份含6VS.6AL易位染色體, 占15.4%。重組位置和單倍型分析表明, 這些材料的6VS.6AL均為著絲點易位、具有單一來源。根據(jù)系譜分析, 92R178為最原始的供體材料。利用由誘導(dǎo)6VS/6AS部分同源重組形成的, 含基因的初級易位6VS-6AS.6AL和6AS-6VS.6AL為親本, 創(chuàng)制了1個含基因、6VS片段大幅減小的6AS-6VS-6AS.6AL次級易位。根據(jù)中國春參考基因組, 該次級易位的2個重組位點, 分別位于6A染色體53.1～53.8 Mb和90.7～92.2 Mb之間, 易位片段大小在36.9～39.1 Mb之間。分子細(xì)胞學(xué)鑒定表明,誘導(dǎo)外源易位的同時, 小麥自身的內(nèi)源染色體也發(fā)生了大量易位, 這影響易位系的遺傳穩(wěn)定和育種利用。為了解決這個問題, 建議將基因突變系以雜合的形式進(jìn)行長期保存。同時, 在利用誘導(dǎo)小麥-外源易位的過程中, 盡量減少純合狀態(tài)下的繁殖世代, 以減少小麥內(nèi)源染色體易位。育種利用時, 應(yīng)盡快消除小麥內(nèi)源易位。

小麥; 簇毛麥; 白粉病; 6VS.6AL易位;基因; 小片段易位系

白粉病是危害小麥生產(chǎn)的重要真菌病害。利用抗病基因, 選育推廣抗病品種是防治小麥白粉病的經(jīng)濟(jì)有效途徑。簇毛麥(, 2=14, VV)是小麥抗病改良的重要三級基因源。到目前為止, 已從中鑒定命名了4個抗白粉病基因, 包括位于6VS的、5VS的、2VL的和1VS的[1-4]。其中,是全生育期廣譜抗白粉病基因。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)以6VS.6AL易位的形式將該基因?qū)胄←? 創(chuàng)制了“92R系列”材料, 分發(fā)給育種家, 加速了其育種利用, 已有一大批攜帶的小麥品種被審定和推廣應(yīng)用[5-10]。除了抗白粉病, 6VS.6AL易位材料對種子蛋白質(zhì)含量和千粒重也有正向作用, 前者可能與6VS上的基因有關(guān)[11]。

導(dǎo)入外源染色體片段, 可能會引入目標(biāo)基因以外的不利基因, 造成連鎖累贅。遺傳分析表明, 6VS.6AL易位染色體在雄配子中的傳遞效率相對較低[12]。6VS.6AL易位染色體還攜帶分蘗減少、株高增加等不利性狀[13-15]。創(chuàng)制6VS/6AS小片段易位, 可能會進(jìn)一步促進(jìn)基因的育種利用效率。

小片段易位引入的外源片段小, 降低了不利連鎖基因?qū)氲目赡苄浴ears教授以基因操作為工具, 建立了定向創(chuàng)制小片段易位的“兩步法”染色體工程技術(shù)體系[16]。第一步, 創(chuàng)制基因純合、目標(biāo)外源染色體(臂)和小麥部分同源染色體(臂)均呈單存在的雙單體, 對其后代進(jìn)行篩選, 獲得含小麥-外源重組的初級易位系。第二步, 篩選出含目標(biāo)基因且易位方向相反的兩個初級易位, 即一個易位的外源片段靠近著絲粒方向、另一個易位的外源片段靠近端粒方向。通過雜交, 將兩個初級易位聚合在同一背景, 同時引入基因, 2個含目標(biāo)基因的共享外源染色體區(qū)段發(fā)生同源重組, 即可獲得含目標(biāo)基因且外源染色體片段大幅減小的插入型次級易位。只要獲得在不同位點發(fā)生重組的初級易位, 就可以根據(jù)需要, 設(shè)計并定向創(chuàng)制具有不同插入大小的次級易位。Lukaszewski和Cowger[17]利用該方法, 將插入到6AS亞端部。

本研究以課題組前期利用基因誘導(dǎo)6VS/6AS重組創(chuàng)制的初級易位系為材料[18], 創(chuàng)制含基因的插入型次級小片段易位系, 為基因的育種利用提供新材料。同時, 探討應(yīng)用基因進(jìn)行染色體工程操作及相關(guān)衍生材料利用過程中應(yīng)注意的問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

6VS/6AS初級易位系1-56和1-73, 為本課題組前期以中國春突變系(CS)和6VS.6AL易位系PM99915-1作為親本材料, 通過基因誘導(dǎo)6VS和6AS部分同源重組的方法創(chuàng)制而來[18]。1-56攜帶初級易位6VS-6AS.6AL, 該易位染色體命名為C_6VS/6AS_VA-1; 1-73攜帶初級易位6AS-6VS.6AL,該易位染色體命名為C_6VS/6AS_AV-1。2個初級易位均攜帶基因。普通小麥品種蜀麥830 (SM830)和蜀麥969 (SM969)是本課題組利用人工合成小麥為親本選育審定的普通小麥新品種。

1.2 分子標(biāo)記檢測

基因組DNA的提取采用常規(guī)CTAB法。6VS/ 6AS近著絲粒和近端部特異性共顯性KASP分子標(biāo)記CV/CA和TV/TA的引物序列和PCR檢測方法, 參見Zhang等[18];顯性標(biāo)記Xwgc2049、顯性標(biāo)記Xwgc2111的引物序列參見Gyawali等[19];基因的特異分子標(biāo)記CINAU-NLR1的引物序列參見Xing等[20]。所有引物由成都擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物檢測使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。

小麥16K高通量液相SNP芯片用于檢測創(chuàng)制的6AS-6VS-6AS.6AL次級易位和初級易位6AS- 6VS.6AL (C_6VS/6AS_AV-1)的重組斷裂位置。芯片檢測工作由博瑞迪生物有限公司完成。理論上, 如果6VS和6AS發(fā)生了部分同源重組, 則被6VS片段替換的對應(yīng)6AS片段區(qū)間會顯示出高頻率的分子標(biāo)記缺失, 據(jù)此判斷重組發(fā)生的位置。165份四川小麥品種(系)群體的55K SNP芯片數(shù)據(jù)從Ye等[21]發(fā)表的論文中獲取。與基于測序的16K液相芯片不同, 55K SNP芯片基于探針雜交熒光信號來判斷分型結(jié)果, 背景熒光信號閾值的選擇, 可能會影響缺失標(biāo)記和雜合標(biāo)記的準(zhǔn)確性(特別是涉及外源染色體的時候), 因此在鑒定6VS.6AL易位品種(系)過程中, 我們不僅關(guān)注高頻率標(biāo)記缺失區(qū)段, 同時還關(guān)注了高頻率雜合區(qū)段。后續(xù)的分析和畫圖使用WPS和R包ggplot2 (v3.3.5)完成。

1.3 細(xì)胞學(xué)檢測

為了檢測6VS相關(guān)易位系, 提取的簇毛麥基因組DNA, 利用Atto550 NT labeling kit (Jena Bioscience, 德國)試劑盒標(biāo)記后, 作為基因組原位雜交(GISH)探針。普通小麥中國春基因組DNA經(jīng)高溫蒸汽打斷后作為封組。為了進(jìn)行A和D雙色基因組原位雜交, 分別提取烏拉爾圖小麥和節(jié)節(jié)麥的基因組DNA, 然后分別用Atto550 NT labeling kit (Jena Bioscience, 德國)和Atto488 NT labeling kit (Jena Bioscience, 德國)試劑盒標(biāo)記, 作為探針。經(jīng)高溫蒸汽打斷的擬斯卑爾脫山羊草基因組DNA作為封組。原位雜交流程參見范超蘭等[22]。

寡序列探針Oligo-pSc119.2和Oligo-pTa535用于檢測易位系的染色體組成。熒光探針由成都擎科生物科技有限公司合成。FISH檢測的流程和方法參見Zhao等[23]。原位雜交圖片采集使用裝備了DP80相機(jī)的奧林巴斯BX63熒光顯微鏡完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 四川小麥品種(系)群體中6VS.6AL易位的鑒定

為了分析四川小麥品種(系)群體中的6VS.6AL易位頻率和來源, 我們重新分析了Ye等[21]獲得的165份四川小麥55K SNP芯片數(shù)據(jù)。位于6A染色體的SNP標(biāo)記有2457個, 提取出這165份小麥的6A染色體分型結(jié)果后發(fā)現(xiàn), 其中有3份材料的分型結(jié)果較差, 未用于后續(xù)分析。分析發(fā)現(xiàn), 有25份品種(系) (表1)在6AS短臂的0.1～283.3 Mb區(qū)段內(nèi)(IWGSC v1.0)存在高頻率的標(biāo)記顯示為雜合(圖1)。25份材料在該區(qū)段內(nèi)的雜合標(biāo)記平均占比為68.6% (56.6%～70.6%), 極顯著高于另外137份材料的3.5% (1.5%～25.2%), 表明這些25份材料可能為6VS.6AL易位系, 占15.4%。比較Hu等[10]對四川小麥品種(系)的細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果, 有19份在2個研究中共有。其中, 14份材料的細(xì)胞學(xué)結(jié)果也支持它們是6VS.6AL易位系, 但另外5份材料細(xì)胞學(xué)顯示為非易位系, 2個實驗結(jié)果的不一致可能由于試驗樣品有誤或這些品種本身屬于雜合群體導(dǎo)致, 具體原因還需進(jìn)一步驗證。

圖1 162份四川小麥6A (6VS.6AL)染色體基因型

圖中每一行代表1個品種(系); 每一列代表1個標(biāo)記, 標(biāo)記按照IWGSC v1.0參考基因組6A短臂至長臂的順序從左向右排列。每個標(biāo)記的分型結(jié)果分別按照A (紅色)、C (綠色)、G (黃色)、T (藍(lán)色)、雜合H (灰色)、缺失NA (粉色)表示。Hap1～3代表近著絲粒無重組區(qū)劃分的單倍型, 括號里面數(shù)字代表歸屬該單倍型的品種(系)數(shù)。箭頭示在IWGSC v1.0參考基因組上的位置。

Each row represents a cultivar (line); each column represents a marker. The markers are arranged from left to right according their physical location on the Chinese spring reference genome of IWGSC v1.0. Markers are labeled in red with a genotype of A, in green with a genotype of C, in yellow with a genotype of G, in blue with a genotype of T, in grey with a genotype of heterozygote, and in pink with a genotype of missing. Hap1–3 represent haplotypes of centric region without recombination. Number in the bracket represents the cultivar (lines) number. Arrow points out the physical position on IWGSC v1.0.

根據(jù)分子標(biāo)記結(jié)果, 所有25份材料6VS.6AL易位的斷裂-融合點均相同, 由位于6A染色體283.3和286.0 Mb的2個標(biāo)記界定, 表明這些6VS.6AL易位染色體可能具有單一來源。為進(jìn)一步驗證該推測, 進(jìn)一步分析了6A(6VS.6AL)的近著絲區(qū)域, 137份非6VS.6AL易位系品種(系)的近著絲點區(qū)域?qū)儆谥亟M缺乏區(qū)(225.1～442.0 Mb) (圖1)?；谠搮^(qū)域的分型結(jié)果, 可以將137四川小麥分成3種單倍型, 分別有101 (hap1)、20 (hap2)和16 (hap3)份材料。25份6VS.6AL易位系品種(系)全部屬于hap1類型(依據(jù)286.0～442.0 Mb區(qū)段單倍型判斷), 且相互間不存在多樣性。因此, 無論從易位的斷點位置, 還是著絲粒區(qū)域的單倍型來看, 四川小麥品種(系)中的6VS.6AL易位屬于單一起源的臂間易位。從系譜信息推斷(表1), “92R178”可能是這些6VS.6AL易位的最原始供體材料。

表1 25份攜帶6VS.6AL易位的四川小麥品種(系)

(續(xù)表1)

*細(xì)胞學(xué)結(jié)果引自Hu等[10]?！?”表示該材料沒有細(xì)胞學(xué)結(jié)果; “√”表示該材料細(xì)胞學(xué)鑒定為6VS.6AL易位系; “×”表示該材料細(xì)胞學(xué)鑒定為非6VS.6AL易位系。

* Cytological results were extracted from Hu et al.[10]“/” indicates that the material has no cytological results; “√” indicates that the material is cytologically identified as a 6VS.6AL translocation line. “×” indicates that the material is cytologically identified as a non-6VS.6AL translocation line.

2.2 創(chuàng)制含Pm21基因的6AS-6VS-6AS.6AL次級小片段易位

6VS/6AS初級易位系1-56和1-73均為雜合, 染色體組成分別為6A’+6VS-6AS.6AL’和6VS.6AL’+ 6AS-6VS.6AL’[18]。它們分別與小麥品種蜀麥830和蜀麥969雜交, 經(jīng)CV/CA和TV/TA分子標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)鑒定, 分別獲得攜帶C_6VS/6AS_VA-1 (6VS- 6AS.6AL)和C_6VS/6AS_AV-1 (6AS-6VS.6AL)初級易位的F1雜種HM782-15和HM780-7 (圖2-A)。功能標(biāo)記鑒定表明, HM782-15和HM780-7均含有基因(圖2-B)。兩株F1雜交, 獲得12粒雜交種子。以/基因分子標(biāo)記、CV/CA和TV/TA分子標(biāo)記篩選, 獲得1株基因純合且同時攜帶C_6VS/6AS_VA-1和C_6VS/6AS_AV-1初級易位的植株HM887-9。HM887-9自交獲得超過400顆種子。取其中73顆種子發(fā)芽, 經(jīng)CV/CA和TV/TA分子標(biāo)記篩選, 獲得2株疑似攜帶6AS-6VS-6AS.6AL次級易位的后代, 分別命名為Rec32和Rec50。簇毛麥為探針的GISH鑒定表明, Rec32和Rec50的染色體組成分別為6VS-6AS.6AL’+6AS-6VS-6AS.6AL’ (圖2-C)和6AS-6VS.6AL’+6AS-6VS-6AS.6AL’ (圖2-D)。因此, 成功獲得含基因的次級易位, 將該次級易位命名為C_6VS/6AS_AVA--1 (Rec32和Rec50中的次級易位染色體相同)。同時, 還獲攜帶經(jīng)重組恢復(fù)為6VS.6AL易位的后代2株, 細(xì)胞學(xué)鑒定同樣驗證了其真實性(圖2-E)。上述結(jié)果表明, 在基因的限制下, 2個初級易位共享的6VS區(qū)段, 按設(shè)計發(fā)生了同源重組(圖2-F)。

2.3 高通量分子標(biāo)記鑒定6AS-6VS-6AS.6AL次級易位重組位置

攜帶次級易位C_6VS/6AS_AVA--1的Rec50和初級易位C_6VS/6AS_AV-1純合的HM887- 9-51送公司進(jìn)行16K SNP芯片分析, 共獲得14,878個位點的SNP分型結(jié)果, 其中位于6A的有738個。如圖3所示, C_6VS/6AS_AVA--1次級易位的2個部分同源重組斷點位置分別位于6A染色體53.1～53.8 Mb和90.7～92.2 Mb, 估算外源易位片段大小為36.9～39.1 Mb之間(以中國春IWGSC v1.0基因組的6A為參考); C_6VS/6AS_AV-1初級易位的2個重組斷點位置分別位于6A染色體的53.1～53.8 Mb和285.6～286.8 Mb, 估算外源易位片段大小為231.8～233.7 Mb之間。C_6VS/6AS_AVA--1與C_6VS/6AS_AV-1近端部斷點位置相同, 證明了C_6VS/6AS_AVA--1易位來源于初級易位C_ 6VS/6AS_VA-1和C_6VS/6AS_AV-1之間的同源重組交換。根據(jù)C_6VS/6AS_AVA--1的重組斷點可以知道, C_6VS/6AS_VA-1 (1～56)初級易位中的6VS片段大小為90.7～92.2 Mb之間。因此, 次級易位C_6VS/6AS_AVA--1中的6VS片段大小(36.9～39.1 Mb)相較于2個初級易位C_6VS/6AS_ VA-1 (90.7～92.2 Mb)和C_6VS/6AS_AV-1 (231.8～ 233.7), 分別減小了約59%和84%。所以, 通過有目的地挑選初級易位, 借助共享外源片段的同源重組, 能夠創(chuàng)制出外源片段顯著減小的次級易位。

圖2 6VS/6AS次級易位創(chuàng)制流程及細(xì)胞學(xué)鑒定

A: 利用6VS/6AS易位創(chuàng)制次級易位的雜交和篩選流程; B:特異標(biāo)記CINAU-NLR1標(biāo)記鑒定(從左至右, 依次為marker、Pm99915-1、CS、HM782-15和HM780-7); C: 次級易位系Rec32的基因組原位雜交鑒定結(jié)果; D: 次級易位系Rec50的基因組原位雜交鑒定結(jié)果; E: 6VS/6AS初級易位重組重新形成6VS.6AL易位系的基因組原位雜交鑒定結(jié)果; F: 初級易位配對重組形成次級易位示意圖。MI: 減數(shù)分裂中期I; AI: 減數(shù)分裂后期I。6VS染色體臂或片段在模式染色體中用紅色填充表示, 6A染色體或片段用藍(lán)色填充表示, 黃色短橫線則代表基因。黃色箭頭指示經(jīng)同源重組形成的次級易位C_6VS/6AS_AVA--1或6VS.6AL臂間易位, 白色箭頭指示未參與重組的初級易位。

A: the crossing and selecting diagram to induce 6VS/6AS secondary translocation using their primary translocation; B: the confirmation the presence ofgene using its specific marker CINAU-NLR1 (from left to right: marker, Pm99915-1, CS, HM782-15, HM780-7); C: genomichybridization (GISH) pattern of secondary translocation line Rec32; D: GSIH pattern of secondary translocation line Rec50; E: GISH pattern of 6VS.6AL translocation lines formed by homologous recombination between two 6VS/6AS primary translocation; F: the diagram of how primary translocation pair and exchange to generate secondary translocation. MI: metaphase I of meiosis; AI: anaphase I of meisosis. 6VS chromosome arm or fragment was filled in red, 6A chromosome or fragment in blue. Yellow line representsgene. Yellow arrows represent C_6VS/6AS_AVA--1 or 6VS.6AL. White arrows represent primary translocation without recombination.

分子標(biāo)記顯示, Rec50的3D染色體在363.6～ 505.8 Mb區(qū)段和7D染色體在91.1～629.8 Mb區(qū)段存在大片段的缺失, 而5A染色體端部的0～19.6 Mb區(qū)段存在一個相對小的片段缺失, 暗示這幾條染色體可能存在結(jié)構(gòu)變異或易位(圖3)。

2.4 非目標(biāo)易位檢測

高通量分子標(biāo)記顯示Rec50次級小片段易位系中可能還存在內(nèi)源小麥染色體結(jié)構(gòu)變異或易位。為此, 我們結(jié)合雙色GISH和FISH對Rec50的染色體組成進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定。如圖4所示, Rec50含有42條完整或易位染色體和1個A基因組染色體片段。Rec50中存在至少11個6VS/6AS目標(biāo)染色體臂以外的小麥染色體間重組(圖4中白色箭頭所示)。其中, 除2個發(fā)生在6B和6A之間(6BL/6AL), 其余均發(fā)生自A-D基因組染色體間。16K芯片顯示存在染色體片段缺失的5A和7D染色體, 分別以5BS-5AS.5AL (1對)和7DS-7AS.7AL (1對)的形式存在; 而3D的片段缺失由兩對3D/3A間易位(1對3DS.3DL-3AL和1對3AS.3AL-3DL)導(dǎo)致。

圖3 Rec50和HM887-9-51的16K缺失標(biāo)記分布圖

圖中每個染色體的左邊表示Rec50, 右邊表示HM887-9-51。缺失標(biāo)記位置用綠色表示, 非缺失標(biāo)記用紅色表示。實線框指示非目標(biāo)小麥內(nèi)源結(jié)構(gòu)變異染色體區(qū)段, 虛線框指示目標(biāo)次級和初級易位缺失6AS片段。

Chromosomes on the left are from Rec50, right from HM887-9-51. Missing marker locations are labeled in green, others in red. The solid boxes indicate the deletion regions on nontarget wheat endogenous chromosomes. The dotted box indicates the deletion 6AS fragments on target primary and secondary recombined chromosome.

同時, 次級易位C_6VS/6AS_AVA--1的長臂還攜帶1個B基因組染色體片段, 可能來源于6B, 推測次級易位的存在形式是6AS-6VS-6AS.6AL- 6BL。

3 討論

本研究表明, 四川小麥品種(系)利用的6VS.6AL染色體為單一來源的著絲點易位。Hu等[10]利用熒光原位雜交發(fā)現(xiàn), 四川小麥6VS.6AL易位的6AL長臂上存在雜交信號多態(tài)性, 但對應(yīng)的6VS臂上不存在多態(tài)性, 也表明其可能具有單一的來源。重組斷點的位置(相同來源的小麥-外源易位具有相同的重組位置)及斷點附近的DNA序列單倍型(小麥-外源重組位點附近的重組會受到抑制)是判斷易位染色體來源的重要指標(biāo)。根據(jù)CENH3 CHIP-seq結(jié)果, 6A染色體著絲粒區(qū)域大致位于中國春1.0參考基因組的283.3～288.7 Mb和290.7～292.5 Mb區(qū)段[24]。55K SNP芯片數(shù)據(jù)表明, 四川小麥品種(系)中6VS.6AL易位具有相同的斷裂-融合位置, 位于283.3～286.0 Mb之間, 因此其為一個標(biāo)準(zhǔn)的著絲粒斷裂-融合臂間易位。著絲粒區(qū)域?qū)儆谥亟M冷區(qū)。本研究發(fā)現(xiàn)四川小麥品種(系) 6A染色體(不包括6VS.6AL易位系), 225.1～442.0 Mb跨著絲粒區(qū)域可分為截然不同的3種單倍型, 且相互之間完全缺乏重組(圖1)。所有6VS.6AL易位品種(系)的286.0～ 442.0 Mb區(qū)段單倍型與單倍型I相同, 進(jìn)一步說明四川小麥中的6VS.6AL易位染色體具有單一的起源。結(jié)合系譜分析來看, 92R178很有可能是四川小麥品種群體中6VS.6AL易位的最原始供體。

圖4 Rec50染色體組成鑒定

a: 基因組原位雜交鑒定。A基因組標(biāo)記為粉紅色, B基因組標(biāo)記為藍(lán)色, D基因組標(biāo)記為綠色。b: 熒光原位雜交鑒定。探針Oligo-pSc119.2標(biāo)記為綠色, Oligo-pTa535標(biāo)記為粉紅色。白色箭頭指示6VS/6AS目標(biāo)染色體臂以外的小麥染色體間重組, 紅色箭頭指示6VS/6AS目標(biāo)初級和次級重組染色體。

a: genomichybridization on the root-tip chromosomes from A (pink), B (blue), and D (green) genomes. b: the fluorescencehybridization using Oligo-pSc119.2 (green) and Oligo-pTa535 (pink) as the probes. White arrows indicate the nontarget wheat endogenous recombination chromosomes. Red arrows indicate the target primary and secondary 6VS/6AS recombined chromosomes.

本研究為基因的育種利用提供了新材料。基因(6VS.6AL)的發(fā)現(xiàn)和利用歷史已經(jīng)超過30年, 至今仍然保持優(yōu)良的白粉病抗性[1,9]?？寺”砻?基因編碼CC-NBS-LRR抗病蛋白[20,25], 這為轉(zhuǎn)基因利用基因進(jìn)行抗白粉病育種奠定了基礎(chǔ)。然而, 轉(zhuǎn)基因小麥在生產(chǎn)中仍然被限制使用。因此,基因的育種利用, 在相當(dāng)長的時間內(nèi)仍然依賴于染色體工程材料。整臂6VS.6AL易位是目前基因育種利用的主要形式, 然而6VS攜帶有導(dǎo)致小麥分蘗數(shù)減少和株高增加的不利性狀[13-15]。創(chuàng)制含基因的小片段易位是提高其育種利用效率的重要途徑。在前期創(chuàng)制的6VS-6AS.6AL (參與重組的6VS片段大小約為90.7～92.2 Mb; 以中國春6A染色體為參考)和6AS-6VS.6AL (參與重組的6VS片段大小約為231.8～233.7 Mb; 以中國春6A染色體為參考)初級易位基礎(chǔ)上, 本研究通過基因誘導(dǎo)共享6VS片段同源重組, 創(chuàng)制了一個6VS片段大幅減小的6VS/6AS插入型次級易位, 參與重組的6VS片段大小約36.9～39.1 Mb (以中國春6A染色體為參考, 53.1～53.8 Mb到90.7～92.2 Mb), 極大減小了攜帶不利基因的可能性, 為基因育種利用提供了新材料。本研究進(jìn)一步證明, 通過染色體工程精細(xì)操作, 能夠大幅度減小導(dǎo)入小麥的外源染色體片段大小, 為優(yōu)異外源基因的高效利用奠定材料基礎(chǔ)。

另一方面,基因的發(fā)現(xiàn)及在染色體工程中的應(yīng)用, 已超過60年[26]。但是, 基于操控基因創(chuàng)制的新種質(zhì), 成功用于新品種選育的案例卻很少。目前來看, 有兩大因素限制了小麥-外源易位系的育種利用。首先, 非目標(biāo)染色體易位, 特別是小麥自身的內(nèi)源染色體易位。基因是保障小麥二倍化減數(shù)分裂的關(guān)鍵核心基因, 該基因的缺失(5B缺體、突變體、c突變體)或失活(Ph基因的抑制), 會導(dǎo)致普通小麥在減數(shù)分裂過程中發(fā)生部分同源配對重組[26]。伴隨著自交, 這種小麥內(nèi)源的部分同源易位會進(jìn)一步導(dǎo)致復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異[27]。本研究所用的2個初級易位系1-56和1-73均由CS作為親本誘導(dǎo)而來[18]。CS突變體在本實驗室已繁殖超過20年, 本研究在次級易位系中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源小麥部分同源易位可能來自CS的繁殖保存過程, 也可能來自6VS/6AS初級易位系創(chuàng)制過程。但無論如何,基因利用過程中產(chǎn)生的小麥內(nèi)源染色體易位, 不利于獲得的小麥-外源易位系的穩(wěn)定保存和育種利用。其次, 創(chuàng)制材料的綜合農(nóng)藝性狀差。例如中國春廣泛用作染色體工程工具材料, 但是中國春的綜合農(nóng)藝性狀差。與推廣品種相比, 外源易位系在一些特定性狀上表現(xiàn)突出, 但通常綜合農(nóng)藝性狀差、產(chǎn)量水平低?；亟环椒ǔＳ糜诟牧季C合農(nóng)藝性狀, 但從育種家實際應(yīng)用看, 回交育種的效果不理想。

優(yōu)化利用突變系進(jìn)行染色體工程的操作程序, 可以減少小麥內(nèi)源染色體易位、改良易位系的綜合性狀。第一,突變系以雜合形式保存。建議拿到純合的突變系后, 盡量利用優(yōu)良小麥品種進(jìn)行雜交、回交, 在此過程中不斷選擇/雜合植株, 同時檢測其染色體結(jié)構(gòu), 丟掉積累的內(nèi)源易位, 利用雜合的基因抑制新的部分同源重組染色體形成, 同時改良突變系背景的農(nóng)藝性狀。目前, 一些實驗室通過雜交、回交的方式將基因向當(dāng)?shù)仄贩N背景進(jìn)行了轉(zhuǎn)移, 例如Pavon[28](Fan et al. 2021)、蜀麥126[29]、Mv9kr1[30]。第二, 利用Sears兩步法創(chuàng)制小麥-外源易位過程中, 盡量減少純合背景下的自交代數(shù)。例如, 在篩選得到基因純合, 且目標(biāo)外源染色體(或臂)和小麥部分同源染色體(或臂)均呈單存在的雙單體后代, 與普通小麥(含野生型)測交, 來構(gòu)建初級易位篩選群體。第三, 對綜合農(nóng)藝性狀差的小麥-外源易位系, 例如利用中國春創(chuàng)制的易位系, 不是采用傳統(tǒng)的回交、而是采用其它方式進(jìn)行改良。例如, “雙頂交-兩段選擇”育種技術(shù)體系, 在改良原始育種材料的綜合農(nóng)藝性狀方面, 效率很高[31-32]。第四, 為了減少小麥內(nèi)源易位, 需要利用具有正常染色體組成的小麥品種, 進(jìn)行多次雜交, 替換內(nèi)源易位。例如, 本研究創(chuàng)制的次級易位含有10多個小麥內(nèi)源易位, 單次雜交很難同時消除這些內(nèi)源易位, 需要多次雜交才能得到具有目標(biāo)小麥-外源易位、但無小麥內(nèi)源易位的材料。

4 結(jié)論

四川小麥品種(系)群體攜帶的6VS.6AL易位為單一來源的著絲點易位, 來源于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)制的種質(zhì)“92R178”。本研究通過染色體工程操作, 創(chuàng)制了一份攜帶基因、保留6VS大約36.9～39.1 Mb (以中國春6A染色體為參考, 53.1～53.8 Mb到90.7～92.2 Mb)的次級小片段易位, 大大減小了不利基因連鎖導(dǎo)入的可能性, 可用于抗白粉病育種。為了提高突變體轉(zhuǎn)移外源基因的效率, 建議突變體以雜合的形式進(jìn)行長期保存, 以減少小麥內(nèi)源易位, 影響后續(xù)的遺傳研究和育種應(yīng)用。同時, 在利用誘導(dǎo)小麥-外源部分同源重組的過程中, 減少純合狀態(tài)下的繁殖世代數(shù)。育種利用時, 應(yīng)盡快消除小麥內(nèi)源易位。

[1] Chen P, Qi L, Zhou B, Zhang Z, Liu D. Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew., 1995, 91: 1125–1128.

[2] Zhang R, Sun B, Chen J, Cao A, Xing L, Feng Y, Lan C, Chen P., a developmental-stage and tissue-specific powdery mildew resistance gene introgressed frominto common wheat., 2016, 129: 1975–1984.

[3] Zhang R, Fan Y, Kong L, Wang Z, Wu J, Xing L, Cao A, Feng Y., an adult-plant powdery mildew resistance gene introgressed fromchromosome arm 2VL into wheat., 2018, 131: 2613–2620.

[4] Zhang R, Xiong C, Mu H, Yao R, Meng X, Kong L, Xing L, Wu J, Feng Y, Cao A., a new powdery mildew resistance gene transferred fromchromosome 1V to common wheat (L.)., 2021, 9: 882–888.

[5] 江崢, 王琪琳, 吳建輝, 薛文波, 曾慶東, 黃麗麗, 康振生, 韓德俊. 基于基因特異性標(biāo)記分析在中國冬小麥品種(系)中的分布. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47: 2078–2087. Jiang Z, Wang Q L, Wu J H, Xue W B, Zeng Q D, Huang L L, Kang Z S, Han D J. Distribution of powdery mildew resistance genein Chinese winter wheat cultivars and breeding lines based on gene-specific marker., 2014, 47: 2078–2087 (in Chinese with English abstract).

[6] 高煜, 程斌, 丁延慶, 曹寧, 高旭, 張立異. 西南地區(qū)小麥種質(zhì)資源白粉病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析. 麥類作物學(xué)報, 2021, 41: 164–173. Gao Y, Cheng B, Ding Y Q, Cao N, Gao X, Zhang L Y. Genome- wide association study of powdery mildew resistance of wheat germplasm in Southwest China., 2021, 41: 164–173 (in Chinese with English abstract).

[7] Cao A, Xing L, Wang X, Yang X, Wang W, Sun Y, Qian C, Ni J, Chen Y, Liu D, Wang X, Chen P. Serine/threonine kinase gene, a key member of powdery mildew resistance gene, confers powdery mildew resistance in wheat., 2011, 108: 7727–7732.

[8] Huang X, Zhu M, Zhuang L, Zhang S, Wang J, Chen X, Wang D, Chen J, Bao Y, Guo J, Zhang J, Feng Y, Chu C, Du P, Qi Z, Wang H, Chen P. Structural chromosome rearrangements and polymorphisms identified in Chinese wheat cultivars by high-resolution multiplex oligonucleotide FISH., 2018, 131: 1967–1986.

[9] Wu N, Lei Y, Pei D, Wu H, Liu X, Fang J, Guo J, Wang C, Guo J, Zhang J, Liu A, Wen M, Qi Z, Yang X, Bie T, Chu C, Zhou B, Chen P. Predominant wheat-alien chromosome translocations in newly developed wheat of China., 2021, 41: 30.

[10] Hu Z, Luo J, Wan L, Luo J, Li Y, Fu S, Liu D, Hao M, Tang Z. Chromosomes polymorphisms of Sichuan wheat cultivars displayed by ND?FISH landmarks., 2022, 50: 253–262.

[11] Zhao C, Lyu X, Li Y, Li F, Geng M, Mi Y, Ni Z, Wang X, Xie C, Sun Q.is linked with the powdery mildew resistance geneand contributes to increasing grain protein content in wheat., 2016, 17: 82.

[12] 李桂萍, 陳佩度, 張瑞奇, 王春梅, 曹愛忠, 張守忠. 小麥-簇毛麥6VS/6AL易位染色體在不同小麥背景中的遺傳穩(wěn)定性及其在配子中的傳遞. 麥類作物學(xué)報, 2007, 27: 183–187. Li G P, Chen P D, Zhang R Q, Wang C M, Cao A Z, Zhang S Z. Transmission of the 6VS/6AL chromosome through gametes and its genetic stability in different genetic background., 2007, 27: 183–187 (in Chinese with English abstract).

[13] 馬秋香. 普通小麥-簇毛麥6VS·6AL易位系與輝縣紅的RIL群體及其部分農(nóng)藝性狀的遺傳分析. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 江蘇南京, 2007. pp 43–48. Ma Q X. Genetic Analysis of a New Wheat Recombinant Inbred Lines Population Derived from wheat-6VS·6AL Translocation and Huixian Hong and Some Agronomic Traits. MS Thesis of Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu, China, 2007. pp 43–48 (in Chinese with English abstract).

[14] 李桂萍, 陳佩度, 張守忠, 趙和. 小麥-簇毛麥6VS/6AL易位染色體對小麥農(nóng)藝性狀的影響. 植物遺傳資源學(xué)報, 2011, 12: 744–749. Li G P, Chen P D, Zhang S Z, Zhao H. Effects of the 6VS/6AL translocation chromosome on agronomic characteristics of wheat., 2011, 12: 744–749 (in Chinese with English abstract).

[15] Zhao R, Jiang Z, Chen T, Wang L, Ji Y, Hu Z, He H, Bie T. Comparative analysis of genetic effects of wheat-translocations T6V#2S·6AL and T6V#4S·6DL., 2019, 138: 503–512.

[16] Sears E R. Transfer of alien genetic material to wheat. In: Evans L, Peacock W J, eds. Wheat Science: Today and Tomorrow. Cambridge: Cambridge University Press, 1981. pp 75–89.

[17] Lukaszewski A J, Cowger C. Re-engineering oftransfer fromto bread wheat by induced homoeologous recombination., 2017, 57: 2590–2594.

[18] Zhang S, Fan C, Luo J, Huang L, Xie D, Li Y, Chen Z, Jiang B, Ning S, Yuan Z, Huang L, Zhang L, Liu D, Hao M. KASP markers to detect sub-chromosomal arm translocations between 6VS ofand 6AS of wheat., 2021, 217: 10.

[19] Gyawali Y, Zhang W, Chao S, Xu S, Cai X. Delimitation of wheatdeletion and development of-specific DNA markers., 2019, 132: 195-204.

[20] Xing L, Hu P, Liu J, Witek K, Zhou S, Xu J, Zhou W, Gao L, Huang Z, Zhang R, Wang X, Chen P, Wang H, Jones J D G, Karafiatova M, Vrana J, Bartos J, Dolezel J, Tian Y, Wu Y, Cao A.fromencodes a CC-NBS-LRR protein conferring powdery mildew resistance in wheat., 2018, 11: 874–878.

[21] Ye X, Li J, Cheng Y, Yao F, Long L, Wang Y, Wu Y, Li J, Wang J, Jiang Q, Kang H, Li W, Qi P, Lan X, Ma J, Liu Y, Jiang Y, Wei Y, Chen X, Liu C, Zheng Y, Chen G. Genome-wide association study reveals new loci for yield-related traits in Sichuan wheat germplasm under stripe rust stress., 2019, 20: 640.

[22] 范超蘭. 小麥基因?qū)Σ糠滞慈旧w重組的影響. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文, 四川成都, 2022. pp 29–33. Fan C L. The Effects of WheatGenes on Homoeologous Chromosome Recombination. PhD Dissertation of Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan, China, 2022. pp 29–33 (in Chinese with English abstract).

[23] Zhao L, Ning S, Yu J, Hao M, Zhang L, Yuan Z, Zheng Y, Liu D. Cytological identification of anchromosome carrying stripe rust resistance in wheat., 2016, 66: 522–529.

[24] International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). Shifting the limits in wheat research and breeding using a fully annotated reference genome., 2018, 361: eaar7191.

[25] He H, Zhu S, Zhao R, Jiang Z, Ji Y, Ji J, Qiu D, Li H, Bie T., encoding a typical CC-NBS-LRR protein, confers broad- spectrum resistance to wheat powdery mildew disease., 2018, 11: 879–882.

[26] Riley R, Chapman V. Genetic control of the cytologically diploid behaviour of hexaploid wheat., 1958, 182: 713–715.

[27] Martín A C, Borrill P, Higgins J, Alabdullah A, Ramírez- González R H, Swarbreck D, Uauy C, Shaw P, Moore G. Genome- wide transcription during early wheat meiosis is independent of synapsis, ploidy level, and thelocus., 2018, 9: 1791.

[28] Fan C, Hao M, Jia Z, Neri C, Chen X, Chen W, Liu D, Lukaszewski A J. Some characteristics of crossing over in induced recombination between chromosomes of wheat and rye., 2021, 105: 1665–1676.

[29] Li Y, Li Q, Lan J, Tang H, Qi P, Ma J, Wang J, Chen G, Pu Z, Li W, Li Z, Harwood W, Lan X, Deng M, Wei Y, Zheng Y, Jiang Q. Transfer of thegene of ‘Chinese Spring’ into a common wheat cultivar with excellent traits., 2020, 48: 283–291.

[30] Türk?si E, Ivanizs L, Farkas A, Gaál E, Kruppa K, Kovács P, Szakács é, Sz?ke-Pázsi K, Said M, Cápal P, Griffiths S, Dole?el J, Molnár I. Transfer of thedeletion chromosome 5B from Chinese Spring wheat into a winter wheat line and induction of chromosome rearrangements in wheat-hybrids., 2022 13: 875676.

[31] Hao M, Zhang L, Zhao L, Dai S, Li A, Yang W, Xie D, Li Q, Ning S, Yan Z, Wu B, Lan X, Yuan Z, Huang L, Wang J, Zheng K, Chen W, Yu M, Chen X, Chen M, Wei Y, Zhang H, Kishii M, Hawkesford M J, Mao L, Zheng Y, Liu D. A breeding strategy targeting the secondary gene pool of bread wheat: introgression from a synthetic hexaploid wheat., 2019, 132: 2285–2294.

[32] 李慶成, 黃磊, 李亞洲, 范超蘭, 謝蝶, 趙來賓, 張舒潔, 陳雪姣, 甯順腙, 袁中偉, 張連全, 劉登才, 郝明. 6RS/6AL易位染色體的遺傳穩(wěn)定性及其在配子中的傳遞. 作物學(xué)報, 2020, 46: 513–519. Li Q C, Huang L, Li Y Z, Fan C L, Xie D, Zhao L B, Zhang S J, Chen X J, Ning S Z, Yuan Z W, Zhang L Q, Liu D C, Hao M. Genetic stability of 6RS/6AL translocation chromosome and its transmission through gametes., 2020, 46: 513–519 (in Chinese with English abstract).

Creation and analysis of secondary translocation harbouring gene

ZHANG Lan-Yue1,**, LUO Jiang-Tao2,**, FAN Chao-Lan1, LI Ya-Zhou1, JIANG Bo1, CHEN Xue1, CHEN Xue-Jiao1, YUAN Zhong-Wei1, NING Shun-Zong1, ZHANG Lian-Quan3, LIU Deng-Cai3,*, and HAO Ming1,*

1Triticeae Research Institute, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, Sichuan, China;2Crop Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Science, Jinjiang 610066, Sichuan, China;3State Key Laboratory of Crop Gene Exploration and Utilization in Southwest China, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, Sichuan, China

Wheat-6VS.6AL translocation harbouring the genehas made a great contribution to powdery mildew resistance breeding in China.Based on the data of 55K SNP chip, 25 (15.4%) out of 162 Sichuan wheat varieties contained the translocation. In this study, recombination point and haplotype analysis on the 25 varieties showed that it was centric translocation. Combined with the pedigree information, 92R178 was the original donor of the 6VS.6AL translocation in these varieties. 6AS-6VS-6AS.6AL secondary recombinant containingwas generated by using primary recombinants 6VS-6AS.6AL and 6AS-6VS.6AL as the cross parents, which both formed by the induction of. The secondary recombinant had a much smaller 6VS chromatin than the primary recombinants. Based on the Chinese Spring reference genome, thecrossover points of the secondary recombinant were located within 53.1–53.8 Mb and 90.7–92.2 Mb of chromosome 6A, with a 6VS fragment sizeabout 36.9–39.1 Mb. Molecular cytological identification also detected the extensive recombinantsamong wheat endogenoushomoeologs induced by, which was not only disadvantagefor genetic stabilization of wheat-alien recombinants but also for wheat breeding. A proposed solution to reduce endogenous recombinants was to preservethemutant line in a heterozygouscondition and reduce the selfing times during the development of-mediated wheat-alien recombination. In breeding, it is necessary to eliminate endogenous recombinants as soon as possible.

wheat;; powdery mildew; 6VS.6AL translocation;gene; small fragment translocation line

10.3724/SP.J.1006.2023.21082

本研究由四川省科學(xué)技術(shù)項目(2022ZDZX0014, 2022NSFSC1696)和國家自然科學(xué)基金項目(31971884, 32172020)資助。

This study was supported by the Sichuan Science and Technology Program (2022ZDZX0014, 2022NSFSC1696) and the National Natural Science Foundation of China (31971884, 32172020).

郝明, E-mail: haomingluo@foxmail.com; 劉登才, E-mail: dcliu7@sicau.edu.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this study)

張藍(lán)月, E-mail: 569395258@qq.com; 羅江陶, E-mail: jtluohao@163.com

2022-12-12;

2023-02-21;

2023-03-06.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20230306.0853.004.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).