黃連解毒湯通過促進(jìn)自噬減輕膿毒癥大鼠心肌損傷

江桂通 王 臘 田維毅*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550000；2.貴州省岑鞏縣人民醫(yī)院，貴州 岑鞏 556000

迄今為止，膿毒癥仍是一個(gè)世界公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率及病死率雙高仍困擾著全球的醫(yī)務(wù)工作者[1]。膿毒癥病理過程異常復(fù)雜，目前仍尚未完全闡明，涉及炎癥的失控、機(jī)體免疫系統(tǒng)抑制及凝血功能障礙等多個(gè)方面[2]。膿毒癥誘導(dǎo)宿主多器官功能障礙綜合征與其高死亡率息息相關(guān)，其中心臟功能障礙是關(guān)鍵[3]。膿毒癥誘導(dǎo)的心肌病其特征包括心肌細(xì)胞死亡以及過度炎癥反應(yīng)等。自噬(Autophagy)作為細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制[4]，在應(yīng)激條件下，Beclin-1復(fù)合物與唯一具有跨膜結(jié)構(gòu)的自噬核心調(diào)控蛋白(ATG9)調(diào)控自噬泡的形成與自噬膜延伸的過程[5-6]，將受損的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體，底物蛋白P62也隨之降解，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，促使細(xì)胞存活。自噬泡的形成到自噬體與溶酶體相結(jié)合，涉及到LC3-I/LC3-II的比率及P62蛋白的表達(dá)水平，這是評估自噬活化程度的主要方式[7]。目前公認(rèn)自噬作為細(xì)胞適應(yīng)機(jī)制能減輕細(xì)胞損傷和凋亡，膿毒癥中自噬的維持可能有助于減輕膿毒癥引起的器官損傷[8]。因此，探索自噬現(xiàn)象對炎癥性疾病的治療具有重大的意義[9]。

膿毒癥在中醫(yī)學(xué)古籍中雖沒有具體的病名記載，但根據(jù)其發(fā)病的主癥，歸納其病因、病機(jī)，可歸屬于“熱毒”“溫毒”一類[10]。熱毒貫穿于膿毒癥發(fā)病之始終為基礎(chǔ)，清熱解毒是膿毒癥治療的核心環(huán)節(jié)，并在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著決定作用[10-12]。黃連解毒湯始載于唐代王燾《外臺秘要》一書中，由黃連、梔子、黃芩及黃柏組成，具有瀉火解毒之功效，為清熱解毒的代表方之一。課題組前期研究[13]發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯含藥血清能顯著降低脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的膿毒癥細(xì)胞模型炎癥因子(TNF-α、IL-6)表達(dá)水平，誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin-1的表達(dá)[14]，為本研究提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑及儀器 35只SPF級SD雄性大鼠，體重在150～180 g之間，購買于湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院，許可證號SYXK(黔)2018-0001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分籠飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)東垣樓。本實(shí)驗(yàn)由貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作及過程嚴(yán)格執(zhí)行倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。Affinity抗體江蘇常州艾菲爾生物科技(LC3、Beclin-1、P62)，兔源，貨號分別為[AF5402，AF5128，AF5384]。3-18K型低溫離心機(jī)(德國Sigma公司)；Bio-Rad蛋白凝膠電泳儀、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 藥材與制備水煎劑 按王燾《外臺秘要》黃連解毒湯原方比例配伍(黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g)，購自北京同仁堂貴陽店。按課題組常規(guī)方法制備水煎劑，加熱濃縮至含生藥濃度為1 g/mL存放4 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 35只SPF級SD雄性大鼠隨機(jī)分組。①Sham組(n=7)；②CLP組(n=7)；③HLJDD+CLP(HLJDD)組(n=7)；④HLJDD+Rap+CLP(H+RAP)組(n=7)；⑤HLJDD+3-MA+CLP(H+3MA)組(n=7)。在CLP手術(shù)前1周，給予HLJDD：灌胃給藥3.5g·kg-1·d-1藥液灌胃，1 mL/100 g體重，每天1次，持續(xù)7d[15]。Sham組及CLP組給予同等體積的生理鹽水灌胃。雷帕霉素、3-甲基腺苷溶于二甲亞砜，在CLP手術(shù)后1 h內(nèi)腹腔注射。在Sham、CLP和HLJDD組腹腔注射相同體積的生理鹽水。雷帕霉素(RAP，3 mg/kg，MedChemExpress，新澤西，美國)、3-甲基腺嘌呤(3-MA，30 mg/kg，MedChemExpress，新澤西，美國)、二甲亞砜(DMSO，Sigma-Aldrich，美國)。

1.4 建立膿毒癥大鼠模型 盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)[16](CLP)建立膿毒癥動物模型。大致步驟如下：腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后固定，腹中線1.5 cm切口暴露盲腸，絲線結(jié)扎于回盲瓣的四分之一處，用20號針頭進(jìn)行兩次盲腸穿刺擠出糞便后擦拭，將暴露的盲腸放回腹腔，用無菌的6.0手術(shù)縫線將腹壁分層縫合。術(shù)后，用3 mL預(yù)熱的無菌鹽水皮下注射進(jìn)行液體復(fù)蘇，自由飲食、活動。對Sham組大鼠進(jìn)行同樣的操作但盲腸無結(jié)節(jié)及穿孔。

1.5 大鼠模型血常規(guī)檢測 術(shù)后3 d仍存活的大鼠，麻醉后采血經(jīng)獸用全自動血液細(xì)胞分析儀檢測，選取指標(biāo)有白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)；中性粒細(xì)胞數(shù)目(Gran)；中性粒細(xì)胞百分比(Gran%)。

1.6 HE染色觀察心臟組織病理變化 將心臟組織用甲醛固定，石蠟包埋，切成5 μm厚片。切片在二甲苯中孵育5 min。然后，將樣品依次在100%，95%，80%，75%乙醇梯度孵育；蒸餾水沖洗2 min，切片用蘇木精染色5 min，再漂洗，在伊紅溶液中孵育2 min。最后，切片脫水，密封，并在顯微鏡下檢查。

1.7 蛋白印跡法檢測心臟組織中自噬蛋白LC3、Beclin-1、P62表達(dá)水平 提取大鼠心臟組織總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。用兔來源的單克隆抗體(LC3 1∶1000、Beclin-1 1∶1 000、P62 1∶1000)在4 ℃孵育過夜。搖床TBST洗膜15 min/次，共3次，然后將PVDF膜與鼠源抗兔二級單克隆抗體(1∶2000)在37 ℃孵育1h。同樣方法洗滌后，配置ECL顯影液顯影，曝光采集條帶圖象保存，以GAPDH為內(nèi)參，Image Lab軟件分析各目的蛋白條帶的灰度值。

1.8 檢測大鼠心臟組織中ATG9 mRNA的表達(dá)水平 采用Q-PCR法檢測大鼠心臟組織中ATG9 m RNA的表達(dá)差異。稱取各組大鼠心臟組織研磨，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。按照試劑盒說明進(jìn)行操，引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，以GAPDH為內(nèi)參(F5’ACAGCAACAGGGTGGTGGAC3’;R5’TTTGAGGGTGCAGCGAACTT3’)檢測各組大鼠心臟中ATG9 mRNA(F5’TTACTGTGGAGGTCGTCGGTGTGGG3’;R5’ GGATGTGAAAAGGGCATTCTCTGGG3’)。以2-ΔΔCt計(jì)算目的m RNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 觀察黃連解毒湯對膿毒癥大鼠心臟病理情況 HE染色結(jié)果顯示：Sham組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，排列整齊，染色均勻。CLP組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂可見炎性細(xì)胞浸潤，染色加深，部分心肌細(xì)胞腫脹明顯并有壞死。HLJDD組與CLP組相比較，心肌肌纖維排列相對規(guī)則，心肌間間隙變小，炎癥細(xì)胞浸潤減弱。H+RAP組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)邊界較HLJDD組明顯改善，而H+3MA組則心肌細(xì)胞排列紊亂、壞死程度增加。如圖1所示。

圖1 各組大鼠心臟組織病理圖(HE染色，×200)

2.2 黃連解毒湯對膿毒癥大鼠血常規(guī)的影響 與Sham組相比，CLP組大鼠全血中(WBC、Gran#、Gran%)均明顯上調(diào)(P<0.05)。與CLP組相比，HLJDD組大鼠的(WBC、Gran#、Gran%)均明顯下調(diào)，H+RAP組指標(biāo)進(jìn)一步下降，而H+3MA組則呈現(xiàn)相反的趨勢(P<0.05)。見表1。

表1 黃連解毒湯對膿毒大鼠血常規(guī)的影響

2.3 黃連解毒湯對自噬相關(guān)蛋白(LC-3、Beclin-1、P62)的影響 與Sham組比較，CLP組大鼠心臟組織中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)顯著降低，P62蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與CLP組比較，HLJDD組大鼠心臟組織中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，P62蛋白表達(dá)明顯降低，H+RAP組的LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)則顯著上調(diào)，P62蛋白表達(dá)顯著降低。而H+3MA組則呈現(xiàn)相反的趨勢，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)則顯著降低，P62蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見表2和如圖2所示。

表2 黃連解毒湯對膿毒癥大鼠自噬相關(guān)蛋白的影響

圖2 各組大鼠心臟組織自噬相關(guān)蛋白電泳圖

2.4 黃連解毒湯對膿毒癥大鼠自噬基因ATG9 m RNA的影響 與Sham組比較，CLP組大鼠心臟組織中自噬基因ATG9 m RNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與CLP組比較，HLJDD組大鼠的表達(dá)明顯上調(diào)，H+RAP組的進(jìn)一步上調(diào)。而H+3MA組則呈現(xiàn)相反的趨勢，ATG9 m RNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 膿毒癥大鼠心肌組織自噬基因ATG9 m RNA的表達(dá)

3 討論

膿毒癥是一種由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，其中誘發(fā)的心肌病治療耗資頗大且療效欠佳，目前其病死率仍居高不下[17]。臨床研究[18]發(fā)現(xiàn)，罹患膿毒癥患者的死亡超過70%是由器官衰竭引起的，其中超過50%表現(xiàn)出心肌功能障礙。膿毒癥期間不受控制的炎癥因子直接抑制心臟，是誘發(fā)心肌病的主要機(jī)制，伴隨著嚴(yán)重的心臟功能障礙對患者造成致命打擊[19]。巨噬細(xì)胞作為人體中最主要的免疫細(xì)胞，在膿毒癥期間被過度激活并釋放出大量炎性因子 (IL-1、IL-6、TNF-α)。在團(tuán)隊(duì)前期研究[13]發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯能顯著地提高CLP誘導(dǎo)的膿毒癥動物模型生存率、降低炎癥因子(TNF-α、IL-6)，表現(xiàn)出明顯的抗炎作用。這些研究結(jié)果與黃鑫等[20]和李翀等[21]的研究結(jié)果相符。白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞是機(jī)體抵御微生物侵襲的第一道防線，是免疫防御以及解決過度炎癥所必需的，可以評估膿毒癥病程嚴(yán)重狀態(tài)的指標(biāo)[22-23]。此次實(shí)驗(yàn)筆者采用血常規(guī)檢測大鼠全血中感染指標(biāo)，證實(shí)了黃連解毒湯減輕膿毒癥大鼠的感染的顯著作用(表1)。在細(xì)胞和分子水平上，炎癥和細(xì)胞的凋亡被認(rèn)為是膿毒癥心功能障礙的關(guān)鍵病理生理學(xué)現(xiàn)象[24]。筆者在光鏡下觀察膿毒癥大鼠心臟HE病理切片。結(jié)果顯示：黃連解毒湯能減輕膿毒癥大鼠心臟組織局部炎癥，減輕心肌細(xì)胞的損傷情況。細(xì)胞自噬可以降解受損蛋白質(zhì)以維持正常功能的途徑[25]。但在心血管疾病中，特別是膿毒癥誘導(dǎo)的急性心肌損傷中，自噬的作用機(jī)制尚不明確。有研究[26]發(fā)現(xiàn)，小干擾RNA(siRNA)沉默自噬基因ATG5和3-甲基腺嘌呤抑制自噬，增加了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。然而，糾正自噬受損，改善舒張期充盈增加心臟收縮力，減少心肌細(xì)胞凋亡[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯促進(jìn)了膿毒癥大鼠心臟自噬通量的增加，從血常規(guī)結(jié)果及觀察心臟病理切片，自噬的增加進(jìn)一步減輕了膿毒癥大鼠的心肌損傷程度，而自噬受阻則加重其損傷程度(圖2、表2、表3)，這些結(jié)果與WU等[29]的研究相符。

膿毒癥臨床證候復(fù)雜多變，主次真?zhèn)巫兓喽?。治病必求本，辨證必求因。《素問·至真要大論》指出“必伏其所主，而先其所因”。熱毒貫穿于膿毒癥之始終，并在疾病的發(fā)生發(fā)展起主導(dǎo)作用。清·汪讱庵曰：“毒者，即火邪之盛也?！秉S連解毒湯是清熱解毒治法代表方劑之一，方中黃連為君清中焦之火；黃芩為臣輔以清上焦之火；黃柏佐助清下焦；梔子通瀉三焦，引熱下行，從小腸膀胱而出；四藥合力，三焦兼顧。

綜述所述，本研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯有減輕膿毒癥大鼠炎癥水平及心臟組織的損傷作用，可能是通過增加自噬的途徑。然而，黃連解毒湯對于自噬具體的調(diào)控機(jī)制尚且不清楚，有待于后續(xù)的研究。