白屈菜堿調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路對腎癌增殖機制的影響

潘世杰 蔣俊玲 趙俊峰 周磊 王交托

(1河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州 450000;2河南省中醫(yī)院泌尿外科)

腎癌是腎實質(zhì)內(nèi)小管上皮惡變,研究指出2021年新增約7.6萬例腎癌,因其死亡者約1.4萬〔1〕;國內(nèi)學者研究預測2025年腎癌死亡率將較2019年增加7.74%〔2〕。半數(shù)以上無癥狀腎癌(偶發(fā)性腎癌)確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移,根治性腎切除術(shù)(RN)及輔助療法效果欠佳,其5年生存率無法超越10%〔3〕。白屈菜是白屈菜屬(隸屬于罌粟科植物)干燥全草的總稱,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其有效成分白屈菜堿可抑制許多癌細胞增殖,如乳腺癌(MCF-7細胞)、膠質(zhì)母細胞瘤及人口腔上皮樣癌(KB細胞)等,且有研究證實,該中藥單體也有助于逆轉(zhuǎn)多重耐藥(MDR)的乳癌細胞作用〔4～7〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smad信號通路對腎癌進展有不可估量的作用,但白屈菜堿基于TGF-β1/Smad通路對腎癌的影響機制尚不明確。本實驗旨在探究中藥白屈菜堿調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路干預腎癌荷瘤小鼠的機制。

1 材料與方法

1.1實驗細胞及動物 小鼠腎癌細胞,購于BNCC公司;SPF級BALB/c雄性4～8周齡小鼠,體質(zhì)量18～20 g,購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場,許可證號:SCXK(豫)2019-0002。

1.2實驗試劑 白屈菜堿購于MedChemExpress公司;培養(yǎng)基(RPMI1640)、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)、胎牛血清(FBS)和磷酸鹽緩沖液(PBS)等購自以色列BI公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒,購自碧云天(Beyotime)生物技術(shù)有限公司;青-鏈霉素混合液(PS)、二甲基亞砜(DMSO)和RIPA裂解液及ECL顯影液購自索萊寶公司;Smad3蛋白購自美國CST公司;Smad7蛋白購自Thermo Fisher公司;Bcl-2、Bax、Caspase-3及二抗均購自Rockland公司;內(nèi)參蛋白GAPDH購自武漢三鷹有限公司。

1.3培養(yǎng)Renca細胞 取腎癌Renca細胞進行解凍及復蘇,后放于完全培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng),達80%～90%飽和度時用胰蛋白酶消化離心,配制1×107個/ml Renca細胞懸液,置于盛有冰塊的泡沫箱備用。

1.4構(gòu)建腎癌荷瘤小鼠 待新購買的小鼠在IVC籠盒系統(tǒng)適應性生存1 w后,在每只小鼠右前肢腋窩處皮下注射0.15 ml充分混勻的腎癌Renca細胞懸液。

1.5分組及給藥 種植癌細胞后,隨機分為對照組(模型組)和實驗組(白屈菜堿組),每組8只,觀察瘤塊的生長情況,種植癌細胞約2 w,觀察造模成功。實驗組給20 mg/kg白屈菜堿溶液灌胃;對照組按照相同劑量給生理鹽水進行灌胃;給藥 14 d,藥物干預期間每間隔2 d用游標卡尺測量腎癌荷瘤小鼠瘤塊長徑和短徑,電子天平測量腎癌荷瘤小鼠體質(zhì)量。藥物干預結(jié)束后麻醉小鼠,仔細剝離腎癌荷瘤小鼠皮下的種植瘤塊,將各瘤塊分兩半,分別用液氮冷凍保存和4%多聚甲醛固定。抑瘤率=〔(對照組瘤塊重量-實驗組瘤塊重量)/對照組瘤塊重量〕×100%。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組腎癌荷瘤小鼠瘤塊組織病理改變 (1)將腎癌荷瘤小鼠腫瘤切成合適大小放于組織包埋盒中標記;(2)將瘤塊脫水→浸蠟→石蠟包埋→瘤塊組織病理切片→切片攤片→烘烤組織切片→脫蠟水化、蘇木素染色→分色→伊紅染色→脫水透明→封片及圖像采集。

1.7Western印跡法檢測瘤塊 TGF-β1/Smad 通路相關(guān)及增殖相關(guān)蛋白表達情況 (1)在配制好的蛋白裂解液中加入腎癌荷瘤小鼠的瘤塊組織進行蛋白提取;(2)采用BCA 法進行蛋白定量;(3)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行蛋白電泳;(4)將目的蛋白采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜;(5)采用濃度5%脫脂奶粉進行蛋白封閉;(6)進行封閉后的蛋白條帶進行目的蛋白條帶片段剪裁,將相應目的條帶加入 Smad3、Smad7、Bax、Bcl-2、Caspase-3及GAPDH一抗后進行孵育,4 ℃搖床下過夜;(7)TBST洗滌目的條帶后放置于二抗中進行1 h孵育二抗;(8)ECL顯色;(9)采用ImageLab軟件進行目的蛋白的定量分析,檢測條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1繪制腎癌荷瘤小鼠時間-體積曲線圖及計算白屈菜堿的抑瘤率 建造腎癌荷瘤小鼠模型過程中,瘤塊種植成功率為93.75%;在藥物干預模型小鼠期間,腎癌荷瘤小鼠無死亡,即100.00%存活率,表明中藥白屈菜堿給藥劑量對腎癌荷瘤小鼠未發(fā)生短期或明顯毒理作用,或在該劑量濃度作用下,小鼠耐受力尚可調(diào)節(jié);白屈菜堿對腎癌荷瘤小鼠瘤塊的抑瘤率為43.20%,可見中藥白屈菜堿對腎癌荷瘤小鼠的瘤塊增殖具有一定抑制效果。且根據(jù)白屈菜堿干預期間,各組腎癌荷瘤小鼠的腫瘤體積長勢可見,在白屈菜堿對腎癌荷瘤小鼠干預第13天后,白屈菜堿組瘤塊體積較對照組明顯升高(P<0.05),見表1。

表1 藥物不同時間兩組瘤塊體積比較

2.2HE染色檢測兩組腎癌荷瘤小鼠腫瘤組織鏡下病理改變 對照組腫瘤組織周邊可見有一圈腫瘤假性包膜包裹,且可見該種植瘤的瘤塊組織內(nèi)有壞死(干酪樣)區(qū)域、呈無規(guī)則性片狀分布。兩組腫瘤組織中形成許多新生血管,且腫瘤細胞呈異型性,細胞核呈病理性核分裂象,見圖1。

圖1 兩組腫瘤組織切片病理改變(HE染色)

2.3兩組瘤塊中TGF-β1/Smad通路相關(guān)及增殖相關(guān)蛋白表達比較 干預2 w,白屈菜堿組Smad3、Bcl-2蛋白表達較對照組顯著下調(diào),Smad7、Bax、Caspase-3蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05),見表2、圖2。

圖2 兩組TGF-β1/Smad通路相關(guān)及增殖相關(guān)蛋白表達

表2 兩組瘤塊蛋白表達比較

3 討 論

腎癌的隱匿性發(fā)病導致其無法早診斷、早治療,臨床及實驗經(jīng)驗可知RN對于晚期腎癌已無濟于事,靶向及免疫治療等現(xiàn)代醫(yī)療手段均存在免疫耐受等缺陷,約80%腎癌患者達不到治愈水平〔8〕。研究表明,一些中醫(yī)藥可通過調(diào)控基因或相關(guān)通路蛋白等來誘導、阻礙癌細胞的周期進展等,從而控制癌癥惡化進程。中藥白屈菜歸腎、肺、心經(jīng),性涼、味苦、有小毒,該藥對于身體疼痛能夠較好緩解、對抗炎癥反應及對一些癌癥進展有一定抑制療效,其主要成分包括生物堿類(白屈菜堿、小檗堿、血根堿、白屈菜紅堿、黃連堿、四氫黃連堿及原阿片堿等)及非生物堿(白屈菜酸及白屈菜醇等)〔9,10〕,有助于加速尿液及水分排出、解全身毒素、止咳及全身鎮(zhèn)痛等,在臨床實踐中,醫(yī)生可通過用此藥來治療腹水及全身或局部水腫患者、緩解胃部疼痛感、胃潰瘍及腹痛等癥狀。白屈菜堿是一種異喹啉生物堿,具有抗腫瘤、抗炎癥等特性。Jang等〔11〕研究發(fā)現(xiàn),白屈菜堿可通過GADD45a-p53誘導胰腺癌細胞的凋亡程序;Xie等〔12〕發(fā)現(xiàn),白屈菜堿可調(diào)控EGFR-AMPK 通路的選擇性,在一定程度上阻礙那些因為服用吉非替尼(Gefitinib)治療而產(chǎn)生耐藥的非小細胞肺癌(NSCLC)患者的癌細胞惡化;也有研究表明白屈菜堿可增強樂伐替尼對肝癌細胞的抗腫瘤作用〔13〕。由于腎癌發(fā)病機制目前尚不明確,有很多病因病機假說,其中,TGF-β1/Smad通路在腎癌發(fā)展中發(fā)揮多重效應,在多種癌癥及炎癥研究中均有對TGF-β1/Smad信號通路的探討,該通路在癌癥早期抑制癌細胞增殖侵襲,癌癥后期反而促進癌細胞進一步惡化。Zhu等〔14〕發(fā)現(xiàn),CD82/KAI1(一種轉(zhuǎn)移抑制因子)能夠通過抑制TGF-β1/Smad信號調(diào)節(jié),在腎癌的加速惡化進程中發(fā)揮不可替代作用;Yu等〔15〕發(fā)現(xiàn)CD151(作為4跨膜超家族的重要成員之一,能夠把整合素接受到的各種生物信號轉(zhuǎn)導細胞內(nèi),是一種十分重要的細胞結(jié)構(gòu)基礎)通過激活TGF-β1/Smad信號促進腎癌細胞的轉(zhuǎn)移;張苗等〔16〕研究發(fā)現(xiàn),通過下調(diào)一種肽基-脯氨酰順反異構(gòu)酶能夠抑制腎癌細胞增殖、遷移和侵襲且可在一定程度影響TGF-β1/Smad通路活化情況,這種被調(diào)節(jié)的物質(zhì)便是FK506結(jié)合蛋白(FKBP)11。

TGF-β1是一種多肽蛋白,研究證實其具有高度多效性及多種生物學的功能,且作為啟動TGF-β1/Smad信號通路的一個初始決定性因子,該因子異常表達時與TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體結(jié)合并激活后可磷酸化下游受體Smad蛋白(Smad3蛋白為主),將Smad3轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi),將上游信號從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核,與細胞核內(nèi)的相關(guān)目的基因結(jié)合后,有效誘導發(fā)揮促癌效應,且誘導細胞外基質(zhì)合成及促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等,且降低Smad3蛋白表達水平也可抑制癌細胞遷移〔17〕。Smad7是TGF-β1/Smad通路中的受體抑制型因子(I-Smad),可與活化后TGF-β Ⅰ型受體結(jié)合以阻斷Smad3磷酸化,達到負反饋調(diào)節(jié)作用;另一方面,Smad7可進入細胞質(zhì)與Smad3競爭性結(jié)合,拮抗 Smad3與TGF-β受體結(jié)合,從而有效阻斷Smad3在TGF-β1/Smad通路中的傳導作用;且Smad泛素化調(diào)節(jié)因子(Smurf)2能選擇性泛素化降解掉Smad7,影響Smad7基因及蛋白表達水平進而調(diào)控癌癥進展〔18〕。另有研究發(fā)現(xiàn),磷酸化(p)-Smad3 會抑制Smad7的轉(zhuǎn)錄,而Smad7與TGF-β Ⅰ型受體結(jié)合又會抑制p-Smad2和p-Smad3的表達〔19〕。另外,促凋亡Bax及抗凋亡Bcl-2通過線粒體途徑調(diào)節(jié)激活下游信號因子,誘導下游Caspase家族,在一系列效應因子共同作用下發(fā)生級聯(lián)效應,進一步誘導癌細胞的凋亡程序發(fā)生。本研究結(jié)果表明白屈菜堿對腎癌荷瘤小鼠的瘤塊增殖抑制作用可能是通過調(diào)控Smad3和Smad7蛋白表達水平實現(xiàn)的,但仍需深入研究Smad7對Smad3抑制作用及Smad3如何調(diào)控其他下游細胞因子限制腎癌惡變。

綜上,中藥白屈菜堿對腎癌荷瘤小鼠的瘤塊增殖具有抑制作用,該機制可能與TGF-β1/Smad信號通路中因子狀態(tài)相關(guān),Smad3蛋白表達下調(diào)、Smad7蛋白表達上調(diào),為白屈菜堿應用于臨床以延長腎癌患者生存率提供研究依據(jù)。