海拔高度對會理烤煙品質及代謝組學的影響

王文輝,袁文彬,李謹成,楊天旭,邵蘭軍,謝丹鳳,王 維

(1.華南農(nóng)業(yè)大學, 廣州 510640;2.廣東中煙工業(yè)有限責任公司,廣州 510610)

【研究意義】烤煙化學成分是品種遺傳、生態(tài)環(huán)境和栽培因素共同作用的結果[1-2],而海拔高度又是影響生態(tài)環(huán)境的重要因子之一[3-4]。由于海拔高度的變化會導致光照強度、有效積溫、空氣濕度和降雨量等因子顯著變化,從而對煙株的生長發(fā)育產(chǎn)生影響,進而影響烤煙的品質。在一定區(qū)域范圍內,海拔高度與土壤理化性質相比,前者對烤煙常規(guī)化學成分和吃味的影響程度遠大于后者[5-9]。同時,煙葉的代謝產(chǎn)物與烤煙的風格特征也有著密切關系[10]。因此,明確不同海拔高度烤煙的常規(guī)化學成分、感官質量和代謝物的差異以及它們之間的關系對產(chǎn)區(qū)布局有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前,關于海拔高度對煙葉化學成分和吃香味的影響已有相應研究。王正旭等[7]對玉溪煙區(qū)海拔高度與烤煙化學成分的研究表明,隨海拔升高,烤煙中部葉總氮含量升高,煙堿含量下降,總糖和還原糖含量則呈先增后減趨勢。王育軍等[11]研究表明,海拔高度與烤煙總糖含量呈顯著正相關,與總氮和鉀含量呈顯著負相關。Li等[10]認為煙葉代謝物表達水平與地理條件有密切關系。楊虹琦等[12]報道了烤煙胡蘿卜素含量隨海拔升高而升高的趨勢,張志逢等[13]研究結果表明優(yōu)質煙葉中含有大量類胡蘿卜素降解產(chǎn)物。在烤煙吃香味方面,前人研究一般認為隨著海拔增加,烤煙的香型風格會更趨近于清甜香型[10, 14-15]?！颈狙芯壳腥朦c】會理煙區(qū)是涼山州烤煙主產(chǎn)區(qū)之一,光資源豐富,降水充沛,其生態(tài)環(huán)境造就了該煙區(qū)烤煙清香型風格突出、配伍性強的特點[16]。會理煙區(qū)常年煙葉收購量在3.0×107～3.5×107kg,但由于會理煙區(qū)海拔跨度較大,垂直氣候明顯,導致不同海拔區(qū)域的烤煙質量和風格存在較大差異。目前關于海拔高度與烤煙常規(guī)化學成分含量和感官質量的研究較多,但對不同海拔高度的烤煙代謝組學研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究從烤煙化學成分、感官質量和代謝組學方面入手,分析了海拔高度與烤煙質量、風格和代謝物質的關系,為進一步促進產(chǎn)區(qū)合理布局和工業(yè)企業(yè)對產(chǎn)區(qū)煙葉原料的精準使用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2020年在會理縣境內,依據(jù)當?shù)氐匦蔚孛?沿同一坡向,選取有代表性的植煙自然村作為取樣點進行取樣。取樣品種均為當?shù)刂髟云贩N云煙87,等級為中桔三(C3F),每份煙樣3 kg,植煙土壤均為紫色土,各取樣點煙葉生產(chǎn)管理措施均參照涼山彝族自治州優(yōu)質煙葉生產(chǎn)技術標準執(zhí)行。取樣信息見表1,取樣海拔1554～2248 m,將所有樣本分成3個海拔區(qū)間,平均海拔分別為1709.39、1894.14和2140.00 m,以Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別代表上述海拔高度。

表1 烤煙取樣信息

1.2 測定指標及方法

1.2.1 常規(guī)化學成分測定 總糖和還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定[17];總氮、煙堿、鉀、氯和石油醚提取物含量分別按照標準YC/T 161—2002、YC/T 34—1996、YC/T 173—2003、YC/T 153—2001和YC/T 176—2003進行測定。并用推算法得出氮堿比、糖堿比、鉀氯比及兩糖比。

1.2.2 感官質量評價 感官和外觀質量評價工作均由廣東中煙工業(yè)有限責任公司技術中心組織技術人員進行。將所取煙樣按照標準GB/T 16447—2004平衡水分,然后依據(jù)標準GB/T 2635—1992進行外觀質量評價,之后將煙樣切絲并制成單料卷煙,用于感官質量評價,各感官質量評價指標滿分均為9分。

1.2.3 代謝組測定 由于海拔高度臨近的樣本間海拔無明顯界限,若直接對各樣本進行代謝組測定,可能導致樣本組間變異度不高,組內不聚集,分析效果差?；诖?在每個海拔區(qū)間各取等量煙末充分混合,對混合樣進行非靶向代謝物質測定。稱取約1.0 g煙末混合樣本,6個重復,將其轉移至20 mL頂空進樣瓶中,在60 ℃恒溫條件下,震蕩15 min,震蕩速度為450 r/min(5 s開,2 s關),50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭插入樣品頂空部分,頂空萃取60 min,于250 ℃下解析5 min,然后進行GC-MS分離鑒定。色譜條件:DB-WAX毛細管柱,載氣為高純氦氣,恒流流速1.0 mL/min,進樣口溫度260 ℃,不分流進樣,溶劑延遲1.5 min,程序升溫:40 °C保持3 min,以5 °C/min升至220 °C,保持5 min。質譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230 ℃,四級桿溫度150 ℃,電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式(SCAN),質量掃描范圍:20～650 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)運用Excel 2016進行初步處理,通過Sminc 14.1對代謝組數(shù)據(jù)建模,用SPSS 26和Origin 2021對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 海拔高度對烤煙常規(guī)化學成分的影響

由表2可知,烤煙總糖、還原糖和石油醚提取物含量隨海拔升高而升高,煙堿和總氮含量則與之相反。對于各海拔間的化學成分協(xié)調性而言,僅糖堿比指標的差異達顯著水平,表現(xiàn)為隨海拔升高,糖堿比增大。

表2 海拔高度對烤煙常規(guī)化學成分的影響

2.2 海拔高度對烤煙感官質量的影響

如圖1所示,在質量指標方面,隨著植煙海拔的升高,顯著改善了烤煙的香氣質、增加了香氣量,雜氣也有所減輕。對于烤煙風格特色及香韻指標而言,低海拔的烤煙清甜香和青香香韻強度較弱;高海拔的烤煙清甜香型風格更突顯,但勁頭顯著減小。

圖1 海拔高度對烤煙感官質量的影響Fig.1 Effect of altitude on the sensory quality of flue-cured tobacco

2.3 海拔高度與烤煙化學成分和感官質量指標的相關性

由表3可知,糖堿比的相關系數(shù)絕對值最大,說明其與海拔的相關性最強;總糖、還原糖和糖堿比均與海拔高度極顯著相關,呈強正相關;清甜香型風格彰顯度與海拔高度極顯著相關,呈中等程度正相關,煙堿和總氮則與之相反;石油醚提取物、香氣質、香氣量、雜氣、清甜香香韻強度和勁頭雖然均與海拔高度呈顯著或極顯著相關,但相關系數(shù)絕對值較小,相關性較弱。

表3 烤煙質量指標與海拔高度的相關性

2.4 海拔高度導致烤煙代謝組學的差異

2.4.1 代謝物的PCA及OPLS-DA分析 為進一步研究各海拔烤煙在代謝水平是否存在差異,對不同植煙海拔的烤煙進行GC-MS分析,共定性得到626個代謝物。主成分分析(PCA)是一種無監(jiān)督的分析方法[18],因其無外加人為因素干擾,得到的PCA模型能夠反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài), 通過對各樣本數(shù)據(jù)進行PCA分析,可以判斷樣本組間與組內的變異程度大小[19],因此選擇PCA對代謝組學數(shù)據(jù)進行初步觀測。如圖2所示,樣本被明顯分成3組,不同海拔的樣本組間分離,組內聚集,表明樣本組內差異較小,而組間差異較大,說明海拔高度對烤煙代謝物的影響較大,實驗重復性好。

圖2 PCA得分Fig.2 PCA score

正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)是一種有監(jiān)督的分析方法,采用正交信號校正原理建立代謝物表達量與樣本類別之間的關系模型[19]。如圖3所示,各分組樣本完全分離,進一步說明不同海拔高度的烤煙代謝物存在較大差異。在OPLS-DA置換檢驗圖中(圖4),200次隨機分組Q2點均低于最右側原始分組的Q2點,且Q2回歸線的截距為-0.708,小于0,表明模型未過擬合,結果可靠。

圖3 OPLS-DA得分Fig.3 OPLS-DA score

圖4 OPLS-DA 200次置換檢驗Fig.4 OPLS-DA 200 permutations test

2.4.2 差異代謝物分析 VIP值為OPLS-DA第一主成分變量的重要性投影。OPLS-DA載荷圖展示各代謝物與主成分之間的相關關系,代謝物散點越偏移原點,說明該代謝物對原變量的解釋貢獻度越大[10]。以VIP值大于1且離原點距離大于0.9為篩選條件,在圖5-a載荷圖中標記滿足篩選條件的28種差異代謝物。如圖5-b所示,新植二烯和煙堿VIP值為11.75和10.55,明顯高于其余差異代謝物,其中新植二烯的表達量隨著海拔升高而顯著增加,煙堿則與之相反。

圖5 OPLS-DA載荷圖及差異代謝物VIP值Fig.5 OPLS-DA loading plot and VIP values of differential metabolites

從代謝物聚類結果(圖6)看,各海拔烤煙的代謝物相對含量有較大差異。在歐式平方距離4處,可將所有差異代謝物分為3類,包含煙堿及與煙堿合成密切相關的煙酸和麥斯明在內的第一類代謝物在低海拔地區(qū)烤煙中的相對含量最高,這些代謝物中包括氮雜環(huán)類物質3種,酮類2種,烴類1種;第二類代謝物在中海拔地區(qū)的烤煙中相對含量較高,其中酸類物質5種,酮類和酯類物質各1種;第三類以醇類和酮類物質居多,共包含15種代謝物,在高海拔地區(qū)的烤煙中相對含量最高,其中包含醇類物質6種,酮類4種,酯類2種,烴類、醛類和氮雜環(huán)類各1種。在這些物質中,新植二烯、二氫大馬酮、大馬酮、β-紫羅蘭酮和二氫獼猴桃內脂均屬于質體色素降解產(chǎn)物,苯甲醇和苯乙醇屬于苯丙氨酸降解產(chǎn)物。

圖6 差異代謝物聚類熱圖Fig.6 Cluster heatmap of different metabolites

2.4.3 代謝物的代謝途徑和富集分析 如圖7-a所示,28個差異代謝物被注釋到碳水化合物代謝、氨基酸代謝、萜類和聚酮化合物代謝、能量代謝、輔因子和維生素代謝和其它次生代謝物生物合成6條B級代謝通路,其中被標注到碳水化合物代謝和氨基酸代謝中的C級代謝通路較多,共15條。圖7-b顯示被注釋到的20條C級代謝通路富集情況,其中丙酮酸代謝富集了3個代謝物,且通路差異最顯著;丁酸代謝、煙堿和煙酰胺代謝、乙醛酸和二羧酸代謝和托烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成分別富集了2個代謝物,其余代謝通路均分別富集到1個代謝物。功能注釋和富集分析結果表明,海拔高度的變化主要影響煙葉的碳水化合物代謝和氨基酸代謝,其中對碳水化合物代謝中的丙酮酸、丁酸、乙醛酸和二羧酸等代謝C級通路影響最顯著。

圖7 差異代謝物的KEGG代謝通路和富集Fig.7 KEGG metabolic pathway and enrichment of different metabolites

3 討 論

不同海拔高度造就了不同的生態(tài)環(huán)境,進而造成烤煙化學成分的差異[7]。本研究對不同海拔高度烤煙的化學成分進行分析,結果表明,較高的植煙海拔更有利于烤煙總糖和還原糖的積累,煙堿和總氮則與之相反,導致烤煙的糖堿比隨海拔升高而顯著上升。但王彪等[20]研究發(fā)現(xiàn),海拔高度與烤煙的還原糖含量呈負相關,與煙堿含量呈正相關,與本研究結果相反,這可能是由于研究的海拔區(qū)間不一致所致。由于會理煙區(qū)海拔落差大,高海拔地區(qū)太陽輻射強度高、氣溫較低且晝夜溫差較大,有利于糖類的合成和積累,同時較低溫度也可能導致煙堿合成酶活性下降,降低了煙堿合成速度,從而使得高海拔地區(qū)的烤煙呈現(xiàn)出高糖堿比的特征,而糖堿比與清甜香型風格彰顯度呈顯著正相關[21-22],因此較高糖堿比可能是會理高海拔地區(qū)烤煙清甜香型風格更突出的原因之一。劉浩等[23]研究顯示,紅壤土速效鉀及烤煙鉀含量與海拔高度呈極顯著正相關,但本研究結果顯示鉀含量與海拔高度相關性不大,這可能是因為紫色土速效鉀含量隨海拔高度的變化規(guī)律與紅壤土不盡相同導致。王正旭等[7]研究表明,烤煙氯含量受海拔高度的影響不大,這與本研究一致。

GC-MS是分離和測定代謝物的常用方法,Li等[10, 24-25]研究發(fā)現(xiàn),地理環(huán)境的差異會造成氣候因素顯著變化,諸如酚類、有機酸類、糖類和氨基酸等煙葉代謝物表達水平與氣候因素的關系非常密切。本研究通過對不同海拔的烤煙進行GC-MS分析,共定性到626種代謝物,最后篩選出對模型貢獻率較大的差異代謝物28種,其中以酮類、酸類和醇類最為豐富,屬于烴類的新植二烯在差異代謝物中相對含量最高,這一點與已有報道一致[22, 26]。本研究表明,低海拔地區(qū)烤煙的差異代謝物中煙堿及與其關系密切的煙酸、麥斯明相對含量最高。由于煙酸和煙酰胺代謝途徑中,煙酸是煙堿合成的上游化合物,較高的煙酸含量促進了煙堿的合成,而高煙堿含量又為麥斯明的生成提供更多底物,這可能是低海拔地區(qū)烤煙煙堿、煙酸和麥斯明相對含量較高的原因。史宏志等[15]認為降煙堿在煙葉調制過程中容易轉化為麥斯明及吡啶化合物等不利成分,影響煙葉的香味品質,同時較高的煙堿含量也不利于烤煙清甜香型風格的形成[10]。本研究結果顯示,中海拔地區(qū)烤煙相對含量較高的物質以酸類為主。由于烤煙中的揮發(fā)性有機酸本身就帶有一定的芳香氣味,如己酸、異戊酸有奶香味,壬酸有脂蠟香味等[15],因此揮發(fā)性有機酸在烤煙抽吸過程中可直接進入煙氣,對煙氣香味有明顯的影響[27],但史宏志等[28]認為烤煙的有機酸含量過高可能使得煙氣在吸食過程中對喉嚨產(chǎn)生辛辣灼燒感。高海拔地區(qū)烤煙以醇類和酮類相對含量最高,其中新植二烯、二氫大馬酮、大馬酮、β-紫羅蘭酮和二氫獼猴桃內脂均屬于質體色素降解產(chǎn)物。類胡蘿卜素降解產(chǎn)生的香氣物質域值低、香氣質較好,對烤煙香氣貢獻率較大,如大馬酮可顯著提高煙氣香氣質量、增加清香香味,β-紫羅蘭酮有果香香味等[15, 29];葉綠素降解產(chǎn)物新植二烯本身就具有清香氣味,且刺激性小,具有醇和煙氣和減小刺激性的作用[15]。由于類胡蘿卜素具有重要的光保護生物功能,抑制多種活性氧的形成[30],而高海拔地區(qū)光輻射強度高且溫度低,質體色素降解速率較低,因此該地區(qū)的煙葉可能擁有更多的類胡蘿卜素和葉綠素含量[31],為煙葉在成熟和調制過程產(chǎn)生更多質體色素降解產(chǎn)物提供了物質基礎,這可能是高海拔地區(qū)烤煙類胡蘿卜素降解產(chǎn)物較豐富的重要原因。本研究的代謝通路功能注釋和富集分析表明,海拔高度主要影響煙葉的碳水化合物代謝和氨基酸代謝。Hu等[32]研究發(fā)現(xiàn)低溫下碳水化合物代謝和氨基酸代謝對煙草細胞環(huán)境的建立起重要作用。高海拔地區(qū)氣溫較低,植物細胞中氨基酸生物合成水平的提高與增強抗逆境能力相關[33],碳水化合物代謝又為氨基酸代謝提供大量能量,這可能是植煙海拔發(fā)生變化后,碳水化合物代謝和氨基酸代謝變化最明顯的原因。

烤煙的感官質量評價結果顯示,隨著海拔升高,烤煙的香氣質改善、香氣量增加、雜氣增加、清甜香型風格更典型,但勁頭有所降低。高海拔地區(qū)的烤煙煙堿含量低、糖堿比相對較高,同時醇類和一些質體色素降解產(chǎn)物表達水平較高,改善了揮發(fā)性代謝物之間的協(xié)調性,從而導致高海拔地區(qū)烤煙吃香味更好,并強化了其清甜香型風格。

4 結 論

對于常規(guī)化學成分而言,隨著海拔升高,烤煙總糖和還原糖含量顯著增加,煙堿和總氮含量顯著下降,導致糖堿比增大。GC-MS分析結果顯示,低海拔地區(qū)烤煙的煙堿和與其關系密切的煙酸、麥斯明表達量較高;中海拔地區(qū)烤煙的有機酸類物質含量最豐富;高海拔地區(qū)烤煙的醇類和一些質體色素降解產(chǎn)物表達水平最高。代謝通路功能注釋和富集分析表明,海拔高度主要影響煙葉的碳水化合物代謝和氨基酸代謝。煙樣的感官質量評價結果表明,相較于中低海拔,高海拔地區(qū)的烤煙香氣質有所改善、香氣量增多、雜氣減輕且清甜香型風格更突出。適當提高會理煙區(qū)植煙海拔有利于提升產(chǎn)區(qū)烤煙的質量和強化其清甜香型風格。