人參屬6種藥材的抗炎作用及其對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

姜世丹,李璐茜,潘 俊,唐美玲,朱澤嬌,胡 瑜,李益盛,曲 媛

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,昆明 650500;2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,昆明 650221)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株

SPF級(jí)昆明小鼠,體重18～22 g,雌雄均勻,于湖南長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2014-0011]采購(gòu)。小鼠巨噬細(xì)胞株 RAW264.7 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司;脂多糖(LPS)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;NF-κB、p-NF-κB、IκB-α、β-actin抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司;TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;ECL顯影試劑盒和NO試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。其他所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

人參、三七、西洋參、珠子參、竹節(jié)參及屏邊三七于2017年10月分別采集或購(gòu)買于黑龍江撫松市、云南省文山市、美國(guó)威斯康星州、云南省麗江市、四川省樂(lè)山市及云南省屏邊縣,經(jīng)昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院崔秀明研究員鑒定,分別為五加科人參屬人參(PanaxginsengC.A.Meyer)的干燥主根、三七(PanaxnotoginsengF.H.Chen)的干燥主根、西洋參(PanaxquinquefoliusL.)的干燥主根、珠子參[PanaxjaplcusC.A.Mey.var.major (Burk.) C.Y.Wu et K.M Feng]的干燥主根及根莖、竹節(jié)參(PanaxjaponicusC.A.Mey)的干燥主根及根莖、屏邊三七(PanaxstipuleanatusH.T.Tsai et K.M.Feng)的干燥主根及根莖。

1.2 儀器

UPT-I-20T超純水器(成都超純科技有限公司);BL10-250A超聲清洗機(jī)(上海比朗有限公司);AX124ZH型電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司);TD25-WS 臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。SW-CJ-ZFD型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(天美科學(xué)儀器有限公司);倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);YXQ-LS-100SII滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);全血儀(泰安市康宇醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 提取物制備

將人參、三七、珠子參、竹節(jié)參、西洋參及屏邊三七藥材分別粉碎,過(guò)60目篩。稱取6種人參屬藥材粉末各10 g置于錐形瓶,加入100 mL 70%甲醇,室溫下超聲提取30 min,離心靜置取上清,藥渣重復(fù)提取2次,合并提取液,減壓濃縮分別得到人參、三七、珠子參、竹節(jié)參、西洋參及屏邊三七提取物[23]。

1.4 體外抗炎活性研究

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞用DMEM高糖完全培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 將RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種至96孔板中,100 μL/well,設(shè)置空白組(培養(yǎng)基)、對(duì)照組(細(xì)胞+培養(yǎng)基)、LPS組(0.1 g/mL)、6種人參屬藥材提取物組(0.02、0.20 mg/mL),復(fù)孔每組3個(gè),進(jìn)行藥物處理12 h后棄去培養(yǎng)基,CCK-8溶液10 μL/孔,培養(yǎng)箱反應(yīng)1 h,酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(450 nm)(A)值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=[(A試驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)]×100

(1)

Griess法測(cè)定一氧化氮(NO)含量:RAW264.7細(xì)胞懸液按照1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板,不同濃度(0.02、0.20 mg/mL)的6種人參屬提取物處理2 h后,加入LPS孵育12 h,設(shè)置對(duì)照組(細(xì)胞+培養(yǎng)基)、LPS組、L-單甲基-精氨酸(L-NMMA)組、LPS+6種人參屬藥材提取物組,每組3個(gè)復(fù)孔,按照Griess試劑盒操作步驟測(cè)定NO含量。

ELISA法測(cè)定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量:試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理同NO含量測(cè)定方法。用ELISA法檢測(cè)6種人參屬藥材提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響[24]。

1.5 體內(nèi)抗炎活性研究

1.5.1 6種人參屬藥材提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響試驗(yàn) 取昆明種小鼠150只,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。隨機(jī)分15組,每組10只,即對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性組(醋酸地塞米松,10 mg/kg);6種人參屬藥材提取物低、高劑量組(200、400 mg/kg)。每日灌胃給藥1次,連續(xù)給藥14 d,正常對(duì)照組和模型組給予相應(yīng)體積生理鹽水。末次給藥0.5 h后,除空白組外,其他組使用30 μL二甲苯涂抹小鼠右耳致炎,造成急性耳腫脹模型。1 h后采用頸部脫臼法處死小鼠。沿耳廓將小鼠兩耳分別剪下,使用打孔器在兩耳相同的位置打下圓耳片,精密稱重(mg),計(jì)算小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率。

腫脹度(mg)=致炎后右耳片質(zhì)量(mg)-左耳片質(zhì)量(mg)

(2)

抑制率(%)=(模型組耳腫脹度-給藥組耳腫脹度)/模型組耳腫脹度×100

(3)

1.5.2 蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察小鼠右耳組織病理學(xué)變化試驗(yàn) 采用HE染色觀察,取小鼠右耳組織于10%中性甲醛中固定,經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色,在光鏡下觀察耳病理組織學(xué)改變。

1.5.3 Western blot法檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞以3×106個(gè)/well的密度接種至6孔板進(jìn)行培養(yǎng)。處理結(jié)束后。用細(xì)胞刮收集細(xì)胞,加入50 μL細(xì)胞裂解液裂解30 min以提取細(xì)胞中的蛋白。將提取的總蛋白進(jìn)行BCA蛋白定量,定量后根據(jù)結(jié)果將蛋白濃度調(diào)節(jié)至相同含量制備上樣蛋白。然后使用SDS-PAGE分離蛋白,將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h,再用TBST緩沖液清洗PVDF膜,然后以β-actin作為內(nèi)參,IκB-α、NF-κB和p-NF-κB在4 ℃孵育過(guò)夜。HPR偶聯(lián)抗體在37 ℃下孵育1 h。最后,采用增強(qiáng)的ECL溶液顯示蛋白條帶并記錄圖像,使用Image J軟件對(duì)收集到的蛋白圖像進(jìn)行處理,定量分析蛋白表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果以Mean ± SD差表示,采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥材的化學(xué)成分比較

人參屬藥材主要包括人參、西洋參、三七、珠子參、竹節(jié)參、屏邊三七等,各種藥材的外觀形態(tài)差異較大,如圖1所示。人參、西洋參和三七的主要成分是原人參二醇型和原人參三醇型四環(huán)三萜皂苷;珠子參和竹節(jié)參含有四環(huán)三萜和五環(huán)三萜皂苷;而屏邊三七僅含有五環(huán)三萜皂苷,如表1所示。人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd為人參和西洋參的主要成分;三七皂苷R1、人參皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rd為三七的主要成分;人參皂苷Rb1、人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa是珠子參和竹節(jié)參的主要成分;屏邊三七R1和R2是屏邊三七的主要成分。人參皂苷在人參屬藥材中的含量有所不同,其中原人參二醇型人參皂苷Rb1的含量,西洋參>三七>人參>竹節(jié)參>珠子參;原人參三醇型人參皂苷Rg1的含量,三七>人參>竹節(jié)參>西洋參>珠子參。

表1 6種藥材中主要成分及其含量分析

a:屏邊三七;b:三七;c:珠子參;d:人參;e:西洋參;f:竹節(jié)參。a: P.stipuleanatus; b: P.notoginseng; c: P.japlcus; d: P.ginseng; e: P.quinquefolius; f: P.japonicus.圖1 藥材樣品的外觀Fig.1 Appearance of six samples

2.2 藥材提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

試驗(yàn)采用CCK-8法測(cè)定了6種人參屬藥材提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。如圖2所示,6種人參屬藥材提取物在0.02、0.20 mg/mL濃度下的細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.5)。

2.3 藥材提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

如圖3所示,與對(duì)照組相比,LPS組RAW264.7細(xì)胞分泌的NO含量顯著增加(P<0.001)。與LPS組相比,當(dāng)給藥濃度為0.02 mg/mL時(shí),NO合成酶抑制劑L-單甲基-精氨酸(L-NMMA)組、給藥屏邊三七組、珠子參組、人參組可顯著抑制NO的釋放量(P<0.05或P<0.01或P<0.001),而三七組、西洋參組、竹節(jié)參組與之相比則無(wú)顯著差異。與LPS組比較,當(dāng)濃度為0.20 mg/mL時(shí),6種人參屬藥材提取物對(duì)NO的釋放均有顯著抑制作用(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。表明,6種人參屬藥材提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的釋放均有抑制作用,抑制效果:屏邊三七>人參>珠子參>西洋參>竹節(jié)參>三七。

與對(duì)照組比較,△△△表示 P<0.001;與模型組比較:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。下同。Compared with the control group, △△△represents P < 0.001.Compared with model group, * represents P<0.05, ** represents P<0.01, and *** represents P<0.001.The same as below.圖3 不同處理細(xì)胞NO釋放量 Fig.3 NO release from cells under different treatments

2.4 藥材提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中TNF-α分泌量的影響

如圖4所示,與對(duì)照組相比,LPS組可顯著增加RAW264.7細(xì)胞分泌的TNF-α含量(P<0.01)。當(dāng)給藥濃度為0.02、0.20 mg/mL時(shí),6種人參屬藥材提取物與LPS組相比均可顯著降低RAW264.7細(xì)胞分泌的TNF-α含量(P<0.01,P<0.001)。

圖4 不同處理細(xì)胞的TNF-α分泌量Fig.4 TNF-α secretion of cells under different treatments

2.5 藥材提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

如表2所示,與模型組相比,陽(yáng)性組(地塞米松)可以顯著抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹,抑制率為63.33%(P<0.001)。與模型組相比,6種人參屬藥材提取物(400 mg/kg)對(duì)二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹均有抑制作用,其中屏邊三七組、三七組、西洋參組及竹節(jié)參組的抑制率強(qiáng)于陽(yáng)性組,分別為91.11%、68.89%、82.22%、64.44%。結(jié)果顯示,6種人參屬藥材提取物對(duì)二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹具有抑制作用且呈劑量依賴性,其抑制作用強(qiáng)弱為:屏邊三七>西洋參>三七>竹節(jié)參>人參>珠子參。

表2 6種提取物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

2.6 藥材提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹耳組織病理結(jié)構(gòu)改變的影響

從圖5中耳組織HE染色結(jié)果可以看出,與對(duì)照組相比,模型組小鼠耳組織出現(xiàn)明顯真皮結(jié)締組織水腫,間隙增加及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。陽(yáng)性組耳組織結(jié)構(gòu)基本完整,水腫反應(yīng)較模型組減輕。6種人參屬藥材提取物組較模型組水腫反應(yīng)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少;屏邊三七組較其他給藥組水腫反應(yīng)和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最輕,與陽(yáng)性組相近。

a:L-NMMA為陽(yáng)性對(duì)照(20 mg/mL)。a: L-NMMA is the positive control (20 mg/mL). 圖6 不同處理細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路上相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.6 Expression of related proteins on signal pathway of NF-κB in cells under different treatments

2.7 藥材提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路上相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示,與對(duì)照組相比,LPS模型組p-NF-κB、IκBα蛋白表達(dá)升高,而NF-κB蛋白表達(dá)變化不大。與LPS組比較,屏邊三七組和竹節(jié)參組能顯著抑制p-NF-κB、IκBα蛋白表達(dá);珠子參組和竹節(jié)參組能顯著抑制NF-κB蛋白表達(dá)。

3 討 論

炎癥是多種細(xì)胞因子與趨化因子參與的動(dòng)態(tài)發(fā)生過(guò)程,同時(shí)也伴隨一系列基礎(chǔ)的生理與病理過(guò)程。巨噬細(xì)胞是主要的炎性細(xì)胞,RAW264.7細(xì)胞是單核巨噬細(xì)胞的種類之一,是機(jī)體免疫過(guò)程中的重要角色,尤其是受到脂多糖(LPS)等刺激后導(dǎo)致體內(nèi)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,機(jī)體啟動(dòng)抵御機(jī)制從而抑制炎癥的繼續(xù)發(fā)生[25]。NF-κB是參與多種炎癥性疾病免疫反應(yīng)介質(zhì)和關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,在產(chǎn)生促炎因子包括NO、前列腺素E2(PEG2)、白細(xì)胞介素(IL)-6、TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(INOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)中起關(guān)鍵作用[26]。因此,針對(duì)性抑制NF-κB的活化對(duì)于開發(fā)有效的炎癥治療方法十分重要。

本研究采用不同劑量的6種人參屬藥材提取物處理RAW264.7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在0.02、0.20 mg/mL時(shí),均對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯抑制作用。單核巨噬細(xì)胞在LPS刺激下,在炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生過(guò)量的炎癥介質(zhì),如NO和TNF-α。過(guò)度的炎癥使身體過(guò)度暴露于炎癥介質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞壞死、組織損傷和變性,從而加重炎癥[27]。6種人參屬藥材提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的釋放均有抑制作用,其中屏邊三七>人參>珠子參>西洋參>竹節(jié)參>三七。采用ELISA法檢測(cè)LPS和6種人參屬藥材提取物共同處理24 h后RAW264.7細(xì)胞中TNF-α分泌,發(fā)現(xiàn)6種人參屬藥材提取物與LPS組相比均可顯著降低RAW264.7細(xì)胞分泌的TNF-α含量。NF-κB是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,外界LPS刺激后,IκB產(chǎn)生磷酸化反應(yīng)并降解,導(dǎo)致NF-κB、IκB發(fā)生解離并轉(zhuǎn)移至核內(nèi),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子表達(dá)及炎癥反應(yīng)[28]。采用Western blot法對(duì)此通路相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)屏邊三七組和竹節(jié)參組能顯著下調(diào)p-NF-κB、IκBα蛋白表達(dá),表明屏邊三七和竹節(jié)參可通過(guò)抑制p-NF-κB、IκBα蛋白,從而減少NF-κB核轉(zhuǎn)位。同時(shí),本研究采用二甲苯所致小鼠耳腫脹炎癥模型評(píng)價(jià)6種人參屬藥材提取物的體內(nèi)抗炎活性,結(jié)果表明6種人參屬藥材提取物對(duì)小鼠耳腫脹具有劑量依賴性抑制作用,明顯減少耳組織真皮結(jié)締組織水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),其中屏邊三七抗炎效果最好。這一結(jié)果可能是由于人參屬藥材中的共有成分人參皂苷直接抑制皮膚組織中活化的巨噬細(xì)胞[29]。

4 結(jié) 論

6種人參屬藥材提取物不同程度地減少炎性介質(zhì)NO的釋放,抑制促炎因子TNF-α的釋放,抑制p-NF-κB、IκBα蛋白的表達(dá),減少NF-κB的活化,從而達(dá)到抗炎效果。