臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體通過自噬對腎小管上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用研究*

雷 艷,詹世淮,楊 蘭,王佳偉,王水良,趙 猛,張勝行△

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院:1.福建省干細(xì)胞臨床應(yīng)用中心;2.福建省適配體技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,福州 351100)

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived exosomes,hUC-MSCs-Exo)可以轉(zhuǎn)運(yùn)核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì),參與細(xì)胞間的信息交流,具有與MSCs相似的組織損傷修復(fù)和再生功能[1-2]。急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是一種以腎功能減退為特征的癥候群,缺氧、腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury,IRI)、腎毒性和炎癥等均可導(dǎo)致AKI[3-4]。已有研究表明,MSCs-Exo種攜帶的miRNA和蛋白能減輕腎臟缺血再灌注損傷,減少細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,從而修復(fù)腎損傷[5];Exo中含有與血管生成(血管內(nèi)皮生長因子、促血管新生蛋白因子)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號相關(guān)的營養(yǎng)蛋白分子而促進(jìn)腎臟再生[6-7]。MSCs-Exo可以通過調(diào)節(jié)ATL16L增強(qiáng)細(xì)胞自噬,預(yù)防順鉑藥物所致的AKI[8]。盡管MSCs-Exo顯示出腎臟保護(hù)作用,但MSCs-Exo對腎小管上皮細(xì)胞(human renal tubular epithelial cells,HKC)的作用機(jī)制仍不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑

衣霉素(tunicamycin,TM)購于瑞士Enzo Life Sciences公司。DMEM DF12、DMEM低糖培養(yǎng)基均購于美國Hyclone公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、抗體PARP、LC3B、Atg5、Beclin1、β-actin、兔免疫球蛋白G(IgG)、鼠IgG均購于美國Cell Signaling Technology公司。流式抗體CD63、CD9、CD81,碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染料,FITC Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒購于美國Biolenged公司;PierceTMBCA蛋白定量試劑盒購于美國Thermo公司。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)蛋白顯色液購于德國Advansta公司。CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購于印度MedChem公司。ExoQuick-TC試劑盒購于美國SBI公司。

1.1.2細(xì)胞

293T細(xì)胞和HKC購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;hUC-MSC由福建省干細(xì)胞應(yīng)用工程技術(shù)研究中心提供,取P3代細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

HKC培養(yǎng)于10% FBS的高糖培養(yǎng)基中,細(xì)胞均置于含體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中。hUC-MSCs培養(yǎng)于含10% FBS的低糖培養(yǎng)基中。

1.2.2CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性

HKC胰酶消化后鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞,5 000個/孔接種于96孔板,次日含0.5% FBS DMEM高糖培養(yǎng)基將TM稀釋成不同濃度(0、1、2、4 μg/mL)100 μL每孔,24 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液,將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2 h,將96孔板置于酶標(biāo)儀上,測定450 nm處吸光度值,以Con組為100%,則細(xì)胞存活率=(試驗(yàn)組吸光度值/Con組吸光度值)×100%。

1.2.3Exo的鑒定

提取的40 μL Exo與5 μL硫酸鹽微珠室溫共孵育15 min,加入100 μmol/L的牛血清清蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶液5 μL,室溫孵育15 min。加入1 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)孵育75 min,580 r/min離心5 min,去上清液。將Exo微珠的結(jié)合體中加入1 mL 100 mmol/L的甘氨酸溶液室溫孵育30 min,經(jīng)離心PBS洗滌2次后,重懸在350 μL PBS中,每管50 μL分裝于流式管中,加入CD9、CD63、CD81的一抗(1∶200)避光孵育45 min,離心重懸后立即通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.2.4實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測mRNA的表達(dá)

收集TM處理的細(xì)胞,TRIzol法提取細(xì)胞總RNA,取各樣本1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為內(nèi)參,檢測LC3B、Atg5、Beclin1基因mRNA的表達(dá),各基因的引物序列見表1。qPCR體系為:SYBR 5 μL,引物5 μmol/L 0.5 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 3.5 μL,PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性10 min,94 ℃變性15 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30次循環(huán)。mRNA的表達(dá)以2-ΔΔCT方式計(jì)算。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測蛋白表達(dá)

收集不同處理組的蛋白樣品,經(jīng)BCA法蛋白定量后,取30 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。室溫下4% BSA搖床上封閉1 h后,與1∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min/3次,加入不同比例稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,經(jīng)TBST、PBS各洗膜5 min/3次后,加入ECL發(fā)光液暗室曝光,最后使用Bio-Rad公司的Quantity One軟件測得各條帶的灰度值(3次結(jié)果的平均值)與內(nèi)參β-actin進(jìn)行校正和結(jié)果分析。

1.2.6流式細(xì)胞分選技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting,FACS)檢測細(xì)胞凋亡

HKC經(jīng)胰酶消化后收集細(xì)胞沉淀,預(yù)冷的PBS洗滌兩次,加入試劑盒中的結(jié)合液100 μL重懸,每管各加入5 μL FITC Annexin Ⅴ避光染色15 min后,再加入5 μL PI染色5 min,最后每管加入400 μL結(jié)合液重懸后即可上機(jī)檢測。

1.2.7細(xì)胞免疫熒光檢測

HKC經(jīng)各組處理,4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS洗滌3次,加入抗體稀釋液封閉2 h,按1∶200比例加LC3B的一抗4 ℃孵育過夜,含0.1% Triton X-100的PBS洗滌3次后加入二抗,避光孵育1 h,PBS洗滌后,1 mg/mL DAPI染色5 min,熒光顯微鏡拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TM誘導(dǎo)HKC凋亡情況

1、2、4 μg/mL TM處理的細(xì)胞存活率分別為52.9%、46.2%、35.9%,且與Con組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),TM能明顯抑制細(xì)胞增殖(圖1A)。凋亡蛋白PARP的表達(dá)呈濃度依賴性的上調(diào)(圖1B)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,1、2、4 μg/mL TM處理的細(xì)胞凋亡率分別為(18.56±1.88)%、(22.80±1.37)%和(28.55±2.71)%,與Con組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1C。

A:不同濃度TM對細(xì)胞增殖活性的影響;B:Western blotting檢測細(xì)胞凋亡蛋白PARP;C:PI單染檢測細(xì)胞凋亡;*:P<0.05,與Con組比較。

2.2 TM誘導(dǎo)HKC自噬情況

1、2、4 μg/mL TM處理后均會促進(jìn)自噬標(biāo)志性蛋白LC3B表達(dá),且自噬相關(guān)蛋白Atg5和Beclin1的表達(dá)也明顯上調(diào)(圖2A)。與Con組比較,1 μg/mL TM處理(TM組)自噬基因LC3B的表達(dá)上調(diào)6.08倍,Atg5的表達(dá)上調(diào)5.25倍,Beclin1的表達(dá)上調(diào)12.62倍(圖2B),TM誘導(dǎo)HKC自噬信號通路被激活。

A:TM誘導(dǎo)HKC發(fā)生自噬;B:自噬基因LC3B、Beclin1和Atg5表達(dá)水平;**:P<0.05,與Con組比較。

2.3 hUC-MSCs-Exo的分離與鑒定情況

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,hUC-MSCs-Exo中CD9(81.0%)、CD63(86.6%)和CD81(82.4%)陽性標(biāo)志物均陽性表達(dá),陽性表達(dá)率為81.0%、86.6%、82.4%(圖3A)。hUC-MSCs-Exo經(jīng)NTA粒徑分析,大小約為100 nm(圖3B)。

A:FACS鑒定Exo標(biāo)志分子CD63、CD9、CD81結(jié)果;B:hUC-MSCs-Exo NTA粒徑分析。

2.4 hUC-MSCs-Exo促進(jìn)HKC自噬情況

與TM組(1 μg/mL TM處理)比較,該過程中加入75、100、150、200 μg/mL Exo能促進(jìn)細(xì)胞增殖活性,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4A。FACS檢測TM組LC3B細(xì)胞陽性的表達(dá)率為(14.83±2.87)%,TM+Exo組(150 μg/mL Exo處理)LC3B細(xì)胞陽性的表達(dá)率為(25.28±1.03)%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4B、4C。細(xì)胞免疫熒光分析的結(jié)果顯示,與TM組比較,TM+Exo組LC3B的熒光陽性細(xì)胞明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4D。

A:CCK-8檢測Exo對細(xì)胞增殖活性的影響;B、C:FACS檢測LC3B的表達(dá);D:熒光顯微鏡檢測細(xì)胞自噬分子LC3B的熒光強(qiáng)度(200×)。D中,a:Con組DAPI細(xì)胞核染色;b:Con組LC3B免疫熒光染色;c:a、b圖的疊加;d:TM組DAPI細(xì)胞核染色;e:TM組LC3B免疫熒光染色;f:d、e圖的疊加;g:TM+Exo組DAPI細(xì)胞核染色;h:TM+Exo組LC3B免疫熒光染色;i:g、h圖的疊加。*:P<0.05,與TM組比較。

2.5 hUC-MSCs-Exo抑制TM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

與TM組比較,TM+Exo組凋亡蛋白PARP的表達(dá)下調(diào),見圖5A。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,TM組的細(xì)胞凋亡率為(11.37±1.70)%,高于TM+Exo組的(7.72±0.38)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5B。

A:Western blotting檢測凋亡蛋白PARP;B:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

3 討 論

目前,研究人員已經(jīng)提出了多種AKI的發(fā)病機(jī)制,包括腎單位數(shù)量減少、血流量減少和缺氧引起的內(nèi)皮損傷、表觀遺傳學(xué)改變、腎臟毒性、腎小管細(xì)胞周期阻滯或炎癥等[9]。雖然AKI的發(fā)病機(jī)制不盡相同,但最終都以腎小管細(xì)胞損傷(凋亡、壞死)造成不可逆轉(zhuǎn)的腎功能損傷為主要病變特征,尤其是腎小管細(xì)胞凋亡在AKI的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[10]。本研究中,1、2、4 μg/mL TM處理HKC 24 h后均能抑制細(xì)胞增殖活性,并呈水平依賴性;流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果也表明TM能誘導(dǎo)HKC凋亡。

研究報(bào)道,MSCs-細(xì)胞外囊泡通過傳遞miRNAs分子誘導(dǎo)ERK1/2表達(dá)增強(qiáng),促進(jìn)近端HKC的存活[11]。hUC-MSCs-Exo通過傳遞營養(yǎng)因子14-3-3ζ,與自噬誘導(dǎo)所必需的蛋白質(zhì)ATG-16L相互作用,促進(jìn)HKC自噬,誘導(dǎo)細(xì)胞存活,從而介導(dǎo)抗順鉑誘導(dǎo)的AKI,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并減少炎癥反應(yīng),能促進(jìn)腎功能恢復(fù)[12]。本研究表明,hUC-MSCs-Exo與TM共處理能明顯增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性,誘導(dǎo)HKC自噬標(biāo)志分子LC3B、Atg5、Beclin1的表達(dá)上調(diào);細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果均表明,hUC-MSCs-Exo促進(jìn)了自噬標(biāo)志蛋白LC3B的表達(dá)明顯上調(diào),表明hUC-MSCs-Exo能激活自噬信號通路。

MSCs-Exo在治療AKI方面起重要作用,促進(jìn)了“無細(xì)胞療法”的發(fā)展[13]。MSCs-細(xì)胞外囊可以通過抑制氧化、凋亡和炎癥及調(diào)節(jié)血管生成、細(xì)胞周期、再生、自噬和增殖來緩解AKI[14-15]。研究表明,hUC-MSCs-Exo通過抑制MAPK/ERK信號通路的激活,從而抑制HKC凋亡[16]。hUC-MSCs-Exo通過上調(diào)miR-146b水平,從而抑制核因子κB活性和減輕炎癥反應(yīng),明顯降低膿毒癥相關(guān)AKI小鼠的血清肌酐和血尿素氮,抑制腎小管細(xì)胞凋亡,提示hUC-MSCs-Exo可能是減少膿毒癥相關(guān)AKI的一種全新治療藥物[17]。干細(xì)胞分泌的胞外小泡攜帶miRNA并輸送到腎細(xì)胞中,對AKI模型發(fā)揮抗炎、抗凋亡和抗纖維化作用[18]。研究發(fā)現(xiàn),hUC-MSCs-Exo通過攜帶miR-21,抑制p38 MAPK信號通路,減輕胰島內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而保護(hù)胰島內(nèi)皮細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]。本研究中,hUC-MSCs-Exo處理HKC后凋亡率由(11.37±1.70)%下降到(7.72±0.38)%,表明hUC-MSCs-Exo能通過增強(qiáng)細(xì)胞自噬而減緩TM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。干細(xì)胞釋放的Exo中包含與自噬調(diào)控密切相關(guān)的多種miRNA,如miR-181-5p、miR-29、miR-30d-5p、miR-221/222等[20-21]。

綜上所述,MSCs-Exo通過誘導(dǎo)HKC自噬上調(diào)而抑制細(xì)胞凋亡,但目前關(guān)于自噬與AKI的研究尚屬起步階段,Exo中誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵信號通路尚未闡明,探究Exo中的分子對自噬的靶向調(diào)控將是接下來的研究重點(diǎn)。