雌馬酚對非酒精性脂肪性肝細胞模型的氧化應(yīng)激作用研究*

崔涵強,倪向敏,張貴明,徐 喆,李 碩,王 建

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院營養(yǎng)科,重慶 400037)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化,晚期可發(fā)展為肝癌,現(xiàn)已成世界范圍內(nèi)慢性肝病的重要病因之一。我國NAFLD發(fā)病率呈上升趨勢,NAFLD已成為一項重大的公共衛(wèi)生問題[1-2]。NAFLD發(fā)病機制復(fù)雜,氧化應(yīng)激是NAFLD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[3]。因此,緩解肝臟的氧化應(yīng)激反應(yīng),可為防治NAFLD帶來新思路。核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。Nrf2是調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子,被激活后可以從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核中,促進其下游的抗氧化基因血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)、醌氧化還原酶(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)等表達,發(fā)揮抗氧化效應(yīng)[4]。有研究表明,Nrf2在被敲除后可加速肥胖和NAFLD發(fā)病[5],Nrf2信號通路的激活通過改善氧化應(yīng)激對NAFLD發(fā)揮保護作用[6-7]。

雌馬酚(Equol,Eq)是大豆異黃酮類物質(zhì)在體內(nèi)的一種特定代謝產(chǎn)物,具有較強的抗氧化作用[8-9],但Eq能否通過調(diào)節(jié)Nrf2信號通路緩解NAFLD尚不清楚。本研究旨在通過體外NAFLD模型探討Eq能否緩解氧化應(yīng)激及改善NAFLD,并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

BRL3A細胞、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清購于武漢普諾賽生命科技有限公司;Eq購于大賽璐藥物手性技術(shù)有限公司;油酸鈉(NaOL)購于西安鯤創(chuàng)科技發(fā)展有限公司;尼羅紅脂肪熒光染色液購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司;放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)檢測試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒、超敏增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;甘油三脂(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所;細胞核蛋白抽提試劑盒、總RNA提取試劑盒、HO-1抗體、NQO1抗體、LaminB1抗體、GAPDH抗體、過氧化物酶耦聯(lián)的二抗、引物購于生工生物工程(上海)股份有限公司;Nrf2抗體、SYBR Green Fast qPCR Mix試劑盒購于武漢愛博泰克生物科技有限公司;全波長多功能酶標儀購于美國THERMO公司;倒置熒光顯微鏡購于日本奧林巴斯公司;超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)FluorQuant AC600購于美國ACURONBIO公司;CFX connect聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀購于美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

BRL3A細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。根據(jù)細胞生長情況,每2～3天更換培養(yǎng)液,當細胞生長密度到80%～90%時,用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞并按1∶3傳代。

1.2.2細胞活力檢測

以2.0×104個/孔細胞量接種于96孔板中,待細胞貼壁后,將NaOL和Eq以濃度梯度分組給藥,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,根據(jù)CCK-8試劑盒說明書測定細胞活力。

1.2.3細胞干預(yù)與分組

將BRL3A細胞接種于6孔板中,2×105個細胞/孔,分為正常對照組(Con,正常培養(yǎng)基培養(yǎng))、模型組(Mod,0.48 mmol/L的NaOL造模),以及Eq低、中、高劑量干預(yù)組(Eq-L、Eq-M、Eq-H,分別采用0.1、1.0、10.0 μmol/L的Eq干預(yù)24 h)。細胞貼壁后采用無胎牛血清的培養(yǎng)基饑餓8 h后進行相應(yīng)干預(yù)。

1.2.4細胞TG、TC含量測定

干預(yù)結(jié)束后,收集細胞于EP管中,加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS),超聲裂解細胞后取細胞勻漿進行測定。具體操作步驟按測定試劑盒說明書進行。

1.2.5尼羅紅染色

干預(yù)結(jié)束后,去除培養(yǎng)基,采用4%多聚甲醛固定10 min,蒸餾水漂洗3次,尼羅紅染色工作液染色10 min,PBS清洗兩次,于倒置熒光顯微鏡(激發(fā)光492～577 nm)觀察細胞脂質(zhì)蓄積情況,采用Image J軟件進行熒光強度分析。

如表5所示，統(tǒng)計1990-2018年刊載情報信息機構(gòu)知識服務(wù)研究成果的文獻刊物來源，排在第1位的刊物是《圖書情報工作》，文獻數(shù)量為24篇，《情報理論與實踐》位列第2位，文獻數(shù)量為11篇，《情報雜志》和《情報探索》排在第3位和第4位，刊載的文獻數(shù)量分別為8篇和7篇列出了刊載知識服務(wù)文獻數(shù)量最多的前十位來源期刊。這些刊物對于我國普及知識服務(wù)理論知識，推廣各單位的工作實踐成果和經(jīng)驗發(fā)揮了重要的作用，也是從業(yè)工作者獲取相關(guān)信息的重要渠道。

1.2.6細胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標測定

測定細胞內(nèi)ROS水平時,去除培養(yǎng)基,采用PBS漂洗3次,加入含有10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針無胎牛血清培養(yǎng)基,37 ℃孵育30 min。采用無胎牛血清培養(yǎng)基洗滌2次并收集細胞,熒光酶標儀檢測熒光值,激發(fā)光為488 nm,發(fā)射光為535 nm。測定細胞內(nèi)SOD、MDA、CAT水平時,在干預(yù)結(jié)束后將細胞收集于EP管中,加入PBS,超聲裂解細胞,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清液測定SOD、MDA、CAT水平,具體操作步驟按測定試劑盒說明書進行。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測

干預(yù)結(jié)束后將細胞收集至EP管中,加入含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液,采用超聲裂解細胞,然后以4 ℃、12 000 r/min離心10 min,提取細胞總蛋白。根據(jù)試劑盒說明書提取細胞核蛋白。各組取等量蛋白樣品,采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,電泳結(jié)束進行轉(zhuǎn)膜、封閉,一抗4 ℃孵育過夜,洗滌后加入二抗,室溫孵育1 h,充分洗滌。最后采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行蛋白顯影,采用Image J軟件進行灰度值分析。

1.2.8qPCR檢測

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的NaOL和Eq對細胞活力的影響

與Con組比較,當NaOL濃度到達0.72 mmol/L時,細胞活力明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與Con組比較,當Eq濃度達到100 μmol/L時,細胞活力明顯受到抑制(P<0.05),見圖1。

A:不同NaOL濃度對細胞活力的影響;B:不同Eq濃度對細胞活力的影響;a:P<0.05,與Con組比較。

2.2 各組細胞內(nèi)脂質(zhì)水平比較

與Con組比較,Mod組細胞內(nèi)TG、TC水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與Mod組比較,Eq干預(yù)各組細胞內(nèi)TG、TC水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng),見圖2。與Con組比較,Mod組細胞內(nèi)紅色熒光較強;與Mod組比較,Eq干預(yù)各組細胞內(nèi)紅色熒光強度較弱,隨著Eq濃度的增高,細胞內(nèi)熒光強度逐步減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

A:各組TG水平;B:各組TC水平;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Mod組比較。

A:Con組細胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況;B:Mod組細胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況;C:Eq-L組細胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況;D:Eq-M組細胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況;E:Eq-H組細胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況;F:各組熒光強度分析;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Mod組比較。

2.3 各組細胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標的比較

與Con組比較,Mod組細胞內(nèi)ROS水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與Mod組比較,Eq干預(yù)各組細胞內(nèi)ROS水平逐漸降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),并呈現(xiàn)出一定劑量效應(yīng),見圖4A。與Con組比較,Mod組細胞內(nèi)的MDA水平明顯升高,SOD、CAT水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與Mod組比較,Eq干預(yù)各組細胞內(nèi)SOD、CAT水平升高,Eq-M、Eq-H組細胞內(nèi)MDA水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4B～D。

A:各組ROS水平;B:各組SOD水平;C:各組MDA水平;D:各組CAT水平;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Mod組比較。

2.4 各組細胞Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平

與Con組比較,Mod組Nrf2(nucleus)、HO-1、NQO1表達水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與Mod組比較,Eq干預(yù)各組Nrf2(nucleus)、HO-1、NQO1表達水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且Eq隨濃度的增高呈逐步上升趨勢,見圖5。

A:Western blotting結(jié)果;B:Nrf2蛋白分析結(jié)果;C:HO-1蛋白分析結(jié)果;D:NQO1蛋白分析結(jié)果;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Mod組比較。

2.5 各組細胞Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達水平

與Con組比較,Mod組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表達水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與Mod組比較,Eq干預(yù)各組Nrf2和HO-1 mRNA表達水平明顯上調(diào),Eq-M、Eq-H組NQO1 mRNA表達水平明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

A:Nrf2 mRNA相對表達量;B:HO-1 mRNA相對表達量;C:NQO1 mRNA相對表達量;a:P<0.05,與Con組比較;b:P<0.05,與Mod組比較。

3 討 論

隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變,以及影像診斷技術(shù)的發(fā)展,NAFLD的發(fā)病率日益增高。目前,尚無特異性治療NAFLD的藥物,控制飲食和改善生活方式是NAFLD防治的基礎(chǔ),但多數(shù)人難以長期堅持[10]。研究表明,食用大豆食品對NAFLD具有保護作用,這種有益作用可能歸因于其代謝產(chǎn)生的大豆異黃酮[11]。Eq是大豆異黃酮在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物,在動脈粥樣硬化、癌癥、圍絕經(jīng)期癥狀和骨質(zhì)疏松等方面具有保護效應(yīng)[12]。據(jù)報道,Eq可以減輕多種細胞和組織中的氧化應(yīng)激和細胞損傷[13-14],而且它在所有已知的異黃酮類中具有較強的抗氧化活性[15]。氧化應(yīng)激反應(yīng)對NAFLD的發(fā)展具有促進作用,Nrf2與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān),但是目前還沒有研究報道Eq是否可以調(diào)控Nrf2信號通路及對NAFLD發(fā)揮保護作用。本研究通過BRL3A細胞建立體外NAFLD模型,研究Eq對細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的作用和機制。

本研究發(fā)現(xiàn),Mod組細胞內(nèi)TG、TC、ROS、MAD水平升高,SOD、CAT水平降低,Nrf2信號通路相關(guān)蛋白和mRNA表達降低,表明體外NAFLD氧化應(yīng)激細胞模型建立成功。Eq干預(yù)后可見細胞內(nèi)脂滴明顯減少,TG、TC水平降低,提示Eq對NAFLD具有保護作用。ROS可誘導(dǎo)多種炎癥細胞因子表達,促進氧化應(yīng)激,形成炎癥-壞死循環(huán),加重肝組織損傷[16]。SOD和CAT是細胞內(nèi)重要的抗氧化酶,能夠有效清除自由基及ROS,抑制過氧化反應(yīng),發(fā)揮保護作用。MDA為自由基參與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的毒性物質(zhì),其表達過多可嚴重破壞細胞膜結(jié)構(gòu),引起細胞腫脹、壞死,加重細胞損傷[17]。本研究結(jié)果表明,Eq可以降低細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和MDA水平,提高抗氧化酶SOD和CAT活性,且隨著Eq濃度增高,細胞抗氧化能力不斷增強。GOU等[18]的研究表明,Eq可通過降低MDA和增加SOD、CAT表達,抑制脂多糖誘導(dǎo)的細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng);CHOI等[19]研究發(fā)現(xiàn),Eq可以提高HepG2細胞內(nèi)SOD、CAT水平,發(fā)揮抗氧化作用。這與本研究結(jié)果一致,提示Eq可通過抗氧化作用,減輕NAFLD體外模型中氧化應(yīng)激的進展,發(fā)揮肝保護作用。

Nrf2通路是機體抵御氧化應(yīng)激的重要信號通路。在生理條件下,Nrf2主要存在與細胞質(zhì)中,在受到親電體或氧化應(yīng)激刺激后,Nrf2轉(zhuǎn)移到細胞核,促進下游抗氧化反應(yīng)原件和各種抗氧化酶的表達[20]。HO-1可以通過催化血紅素降解為膽綠素Ⅸα、一氧化碳和鐵,調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng),還具有抗炎和抗細胞凋亡作用[21];NQO1可以催化內(nèi)源和外源苯醌化合物及其衍生物的電子還原,同時具有抗炎與抗腫瘤作用[22]。ZHANG等[23]研究發(fā)現(xiàn),Eq可上調(diào)Nrf2在小鼠主動脈組織和人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的表達,發(fā)揮抗氧化和抗動脈粥樣硬化作用;WIDYARINI等[24]研究發(fā)現(xiàn),Eq可以通過上調(diào)HO-1表達,呈劑量依賴地抑制紫外線誘導(dǎo)小鼠皮膚中的脂質(zhì)過氧化。本研究結(jié)果顯示,Mod組細胞中的Nrf2、HO-1和NQO1蛋白和mRNA表達均下降,推測為氧化應(yīng)激條件下細胞損傷,蛋白合成受到抑制,Eq可以上調(diào)上述Nrf2及其下游蛋白表達和mRNA合成,提示Eq是通過激活Nrf2信號通路發(fā)揮其抗氧化作用。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),大豆異黃酮類物質(zhì)Eq對體外NAFLD細胞具有保護作用,可以減輕脂質(zhì)累積,并通過激活Nrf2信號通路,抵抗細胞內(nèi)氧化應(yīng)激,這對異黃酮類物質(zhì)在肥胖人群中的應(yīng)用和膳食指導(dǎo)有重要意義。本研究仍值得改進,Eq是通過何種分子信號介導(dǎo)激活Nrf2通路產(chǎn)生影響仍不清楚,Eq的保護作用仍需在體內(nèi)和人群試驗中得到進一步驗證。