基于miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)探討miR-34a-5p靶向Hh通路對(duì)LX2細(xì)胞增殖的影響

任真，馬燕花，王莉，王愛娣，趙秀萍

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 1. 信息工程學(xué)院信息工程教研室； 2. 第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室，蘭州 730000）

肝纖維化是多種病因?qū)е碌穆愿闻K疾病，其發(fā)生機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，核心環(huán)節(jié)為異?；罨母涡菭罴?xì)胞 （hepatic stellate cell，HSC）［1］。刺猬 （hedgehog，Hh） 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)肝臟的生長(zhǎng)和修復(fù)中起關(guān)鍵作用，研究［2］表明Hh信號(hào)通路與HSC活化密切相關(guān)，其在肝纖維化中表達(dá)普遍上調(diào)，是肝纖維化發(fā)展的決定因素之一。微RNA （microRNA，miRNA） 通過靶向Hh信號(hào)通路參與肝纖維化過程和HSC活化［3］。已有研究［4］證明miR-34a可通過靶向長(zhǎng)鏈脂酰CoA合成酶1 （long-chain acyl-CoA synthetase 1，ACSL1） 在HSC表型調(diào)控中發(fā)揮促肝纖維化功能，參與肝纖維化進(jìn)程。研究［5］表明在相關(guān)酒精誘導(dǎo)的肝纖維化和肝細(xì)胞凋亡中miR-34a-5p表達(dá)增加。本課題組前期通過生物信息學(xué)方法篩選人肝星狀LX2細(xì)胞中差異表達(dá)miRNA靶向Hh信號(hào)通路相關(guān)靶基因，構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，獲得核心miRNA （miR-34a-5p）。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過表達(dá)miR-34a-5p，探討其對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 誘導(dǎo)LX2活化的影響，同時(shí)運(yùn)用Hh信號(hào)通路抑制劑環(huán)靶明脂進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步探討miR-34a-5p的靶向調(diào)控作用，為肝纖維化的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥品與試劑

人肝星狀LX2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)北納創(chuàng)聯(lián)公司。環(huán)靶明脂 （4449-51-8） 購(gòu)自美國(guó)MCE公司；凋亡試劑盒FITC-PI （40302ES60） 、Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit （gDNAdigester plus） （11121ES60） 均購(gòu)自中國(guó)Yeasen公司；引物購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；RNAiso plus 購(gòu)自日本TaKaRa公司；兔來源一抗腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因 1 （glioma related oncogene homology 1，Gli1） 、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 （α-smooth muscle actin，α-SMA） 購(gòu)自中國(guó)華安公司；兔來源一抗腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因 2 （glioma related oncogene homology-2，Gli2） 、Ⅰ型膠原 （type Ⅰ collagen，Col-Ⅰ） 以及小鼠來源一抗聲波刺猬 （sonic hedgehog，Shh） 均購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；兔來源內(nèi)參一抗β肌動(dòng)蛋白 （beta-actin，β-actin） 購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；辣根過氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP） 標(biāo)記山羊抗兔二抗IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗IgG、CCK-8 試劑盒 （C0093） 均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司。Lipofectamine2000［11668-019 （lot：2125329）］購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 主要儀器

多功能熒光酶標(biāo)儀 （Varioskan LUX） 購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司，流式細(xì)胞儀 （CytoFLEX） 購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，AB Step One plus Real Time PCR System 購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems AB公司，凝膠成像儀穩(wěn)壓DNA電泳儀購(gòu)于美國(guó)Tianneng公司，GDS8000 凝膠掃描系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司，Trans-Blot 轉(zhuǎn)膜裝置購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。倒置熒光顯微鏡 （ECLIPSE Ti-s） 購(gòu)自日本Nikon公司。

1.3 miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于本課題組前期通過高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，獲得LX2細(xì)胞與Hh信號(hào)通路相交差異表達(dá)miRNA，并進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測(cè)和差異miRNA靶基因京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 和基因本體（Gene Ontology，GO） 富集分析［6］。通過TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù) （https：//www.targetscan.org/vert_72/） 查詢Hh信號(hào)通路相對(duì)應(yīng)的靶基因，并將靶基因?qū)雜tring數(shù)據(jù)庫(kù) （https：//cn.string-db.org/） 構(gòu)建靶蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) （protein-protein interaction networks，PPI）。將PPI導(dǎo)入Cytoscape 3.9.2，并通過cytoHubba插件中的 MNC 和Degree 算法篩選核心基因，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊蠛Y選出核心miRNA和核心靶基因。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將LX2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，2～3 d換液1次，細(xì)胞80%融合度時(shí)傳代，按照1 ∶3傳代比例進(jìn)行，于37 ℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染：取正常培養(yǎng)的細(xì)胞，消化后用完全培養(yǎng)基重懸，接種于10 cm2皿中，待細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時(shí)利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察miR-34a-5p熒光表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRTPCR） 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、TGF-β1誘導(dǎo)組、miR-34a-5p過表達(dá)組、mimic-NC組和環(huán)靶明脂組。除正常對(duì)照組，其余各組加入終濃度為5 ng/mL的TGF-β1處理細(xì)胞24 h，環(huán)靶明脂組加入終濃度為10 μmol/L的環(huán)靶明脂；miR-34a-5p過表達(dá)組和mimic-NC組分別加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)染6 h后，更換完全培養(yǎng)基。各組細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d。

1.4.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-34a-5p和Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ、α-SMAmRNA表達(dá)水平：TRIzol法從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度。使用Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit （gDNA digester plus） 試劑盒，將大約5 μL的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用Hieff UNICON?Universal Blue Q-PCR SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行Q-PCR。反應(yīng)體系 （10 μL）為SYBR Green Master Mix 5 μL，上下游引物 （各10 μmol/L） 0.4/0.4 μL，cDNA 1 μL，DEPC處理水加至10 mL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性反應(yīng)2 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-34a-5p和Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ、α-SMAmRNA的相對(duì)表達(dá)量，以U6用于miRNA的標(biāo)準(zhǔn)化，而GAPDH用于Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ、α-SMA基因的標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物信息中心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI） 所公布的基因登錄號(hào)設(shè)計(jì)內(nèi)參和目的基因引物，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4.4 CCK-8檢測(cè)miR-34a-5p對(duì)LX2細(xì)胞增殖的影響：各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度 （optical density，OD） 值。設(shè)置空白孔。

1.4.5 Anexin V/PI檢測(cè)miR-34a-5p對(duì)LX2細(xì)胞凋亡的影響：收集培養(yǎng)3 d后的各組細(xì)胞，PBS溶液洗滌，胰酶消化，離心，棄上清，收集細(xì)胞，加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min。1 000g離心5 min，棄上清，加入 190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.4.6 Western blotting檢測(cè)各組Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ和α-SMA蛋白表達(dá)：使用裂解液的RIPA從LX2細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)蛋白濃度，以40 μg/20 μL對(duì)蛋白樣品進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，轉(zhuǎn)膜1.5 h。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后，將膜與一抗 （1 ∶1 000） 在4 ℃下孵育過夜12 h，用TBST溶液洗滌一抗5 min，重復(fù)3次，然后將膜與適當(dāng)?shù)亩梗? ∶1 000） 在室溫下孵育1 h，用TBST溶液洗滌二抗5 min，重復(fù)4次，最后將ECL曝光液按ECL A液 （魯米諾）∶ECL B液 （過氧化氫） 1 ∶1混勻后均勻覆蓋在整片膜上，反應(yīng)2 min放入曝光儀曝光檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示；組間比較采用單因素方差分析 （oneway AN0VA），方差齊者 （P＞ 0.05） 采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，方差不齊者 （P＜ 0.05） 釆用Welch 校正法，組間比較用Dunnett’s T3 法，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及核心網(wǎng)絡(luò)分析

共獲得22個(gè)關(guān)鍵靶基因 （圖1）。網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)為22，邊數(shù)為81，平均節(jié)點(diǎn)度為7.36，平均局部聚類系數(shù)為0.704?；趍iRNA 與 mRNA 的調(diào)控關(guān)系將各基因?qū)隒ytoscape 3.9.2 中構(gòu)建miRNA -mRNA 互作網(wǎng)絡(luò)圖和候選靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。通過綜合評(píng)價(jià)篩選出3個(gè)核心miRNA和5個(gè)核心基因，分別為hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-222-3p、CSNK1G1、CDON、SPOP、LRP2和ARRB1，見表2。

圖1 差異miRNA預(yù)測(cè)靶基因Fig.1 Target genes predicted using differential miRNAs

圖2 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及候選靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 miRNA-mRNA regulatory networks and candidate target gene PPI network

表2 核心miRNA和核心基因篩選Tab.2 Core miRNA and core gene screening

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-34a-5p過表達(dá)對(duì)LX2細(xì)胞增殖的影響

2.2.1 LX2細(xì)胞miR-34a-5p mimic化學(xué)轉(zhuǎn)染的熒光表達(dá)及Q-PCR驗(yàn)證：運(yùn)用化學(xué)合成的方法構(gòu)建miR-34a-5p mimic和miR mimic NC，合成時(shí)連接一個(gè)FAM熒光基團(tuán)，用來在熒光倒置顯微鏡下觀察miRNA mimic/NC 的轉(zhuǎn)染效果。LX-2細(xì)胞化學(xué)轉(zhuǎn)染48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光表達(dá)顯著，提示轉(zhuǎn)染成功。qRTPCR檢測(cè)結(jié)果也顯示，與正常對(duì)照組 （1.00±0.00）比較，TGF-β1誘導(dǎo)組miR-34a-5p的表達(dá)水平 （5.50±0.12） 顯著升高 （P＜ 0.01）。與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，TGF-β1+miR-34a-5p過表達(dá)組miR-34a-5p的表達(dá)水平 （9.35±0.19） 顯著升高 （P＜ 0.01），而TGF-β1+mimic-NC組miR-34a-5p的表達(dá)水平 （5.52±0.12） 無(wú)明顯變化 （P＞ 0.05），見圖3。

圖3 LX2細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光圖 ×100Fig.3 Transfection fluorescence of LX2 cells ×100

2.2.2 各組細(xì)胞活力測(cè)定：與正常對(duì)照組 （100.00%±0.00%） 比較，TGF-β1誘導(dǎo)組 （113.94%±6.15%） 細(xì)胞活力增高 （P＜ 0.01）。與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，miR-34a-5p過表達(dá)組 （130.26%±5.70%） 細(xì)胞活力增高（P＜ 0.01），環(huán)靶明脂組 （81.19%±4.77%） 細(xì)胞活力下降 （P＜ 0.01），mimic-NC組 （116.58%±6.77%） 細(xì)胞活力無(wú)明顯變化 （P＞ 0.05）。

2.2.3 各組細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果：與正常對(duì)照組（2.96%±0.53%） 比較，TGF-β1誘導(dǎo)組 （3.50%±0.51%）細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化 （P＞ 0.05）。與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，miR-34a-5p過表達(dá)組 （2.49%±0.16%） 細(xì)胞凋亡率下降 （P＜ 0.05）；環(huán)靶明脂組 （10.58%±0.89%）細(xì)胞凋亡率顯著增高 （P＜ 0.01），見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率Fig.4 Cell apoptosis rate in each group determined using flow cytometry

2.2.4 各組細(xì)胞Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ、α-SMAmRNA的表達(dá)水平：與正常對(duì)照組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ及α-SMAmRNA表達(dá)水平均增高 （P＜ 0.01）。與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，環(huán)靶明脂組Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ及α-SMAmRNA表達(dá)水平均下降 （P＜ 0.01）；miR-34a-5p過表達(dá)組Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ及α-SMAmRNA表達(dá)水平均增高 （P＜ 0.01）；mimic-NC組除ShhmRNA表達(dá)水平增高外 （P＜ 0.05），其余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞ 0.05），見圖5。

圖5 各組細(xì)胞Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ及α-SMA的mRNA表達(dá)Fig.5 mRNA expression of Shh，Gli1，Gli2，Col-Ⅰ，and α-SMA in each group

2.2.5 各組細(xì)胞Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ、α-SMA的蛋白表達(dá)量：與正常對(duì)照組相比，TGF-β1誘導(dǎo)組Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ及α-SMA蛋白表達(dá)水平均增高 （P＜0.01）。與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，環(huán)靶明脂組Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ及α-SMA蛋白表達(dá)水平均下降 （P＜ 0.01）；miR-34a-5p過表達(dá)組除Shh蛋白表達(dá)無(wú)變化外，Gli1、Gli2、Col-Ⅰ及α-SMA蛋白表達(dá)水平均增高 （P＜ 0.05）；mimic-NC組各指標(biāo)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖6。

圖6 各組細(xì)胞Shh、Gli1、Gli2、Col-Ⅰ及α-SMA 的蛋白表達(dá)Fig.6 Protein expression of Shh，Gli1，Gli2，Col-Ⅰ，and α-SMA in each group

3 討論

肝纖維化是各種病因引起的慢性肝損傷的重要病理過程，未經(jīng)干預(yù)可逐漸進(jìn)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌，甚至肝衰竭。HSC在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展和逆轉(zhuǎn)過程中起至關(guān)重要的作用。當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，HSC活化，生成大量細(xì)胞外基質(zhì) （extracellular matrix，ECM），促進(jìn)纖維化的發(fā)生。已有研究［7］證實(shí)肝纖維化是可逆性過程，阻斷HSC活化是防治肝纖維化的重要途徑。

研究［2］表明miRNA參與HSC的激活，在肝臟脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、代謝性炎癥、慢性肝損傷、再生和纖維化等病理過程中發(fā)揮重要作用。miRNA可通過調(diào)節(jié)Hh信號(hào)通路相關(guān)蛋白，參與肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。各種引起慢性肝損傷的病因可激活Hh信號(hào)通路，從而引起HSC活化［8］?；罨腍SC可以表達(dá)Hh通路Shh、Patch、Smo和Gli等多重組分，使Hh信號(hào)通路持續(xù)處于一種激活狀態(tài)，兩者相互作用，激活效應(yīng)不斷放大，最終促進(jìn)了肝纖維化的進(jìn)程［9］。

人類miR-34a基因位于染色體長(zhǎng)臂3區(qū)6帶 （1p36），miR-34a在腦、心肌、肝臟、肺、前列腺等部位廣泛表達(dá)，可產(chǎn)生miR-34a-5p和miR-34a-3p 2條miRNA，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、腫瘤分化、凋亡、黏附、轉(zhuǎn)移等過程。miR-34a-5p與肝臟疾病及其相關(guān)纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。周興蓓［11］從慢性乙肝相關(guān)肝纖維化患者血清中篩選出差異表達(dá)miR-34a-5p。CALVOPINA等 ［12］在囊性纖維化相關(guān)性肝病中鑒定了一個(gè)獨(dú)特的循環(huán)miRNA譜，miR-34a-5p有可能準(zhǔn)確區(qū)分囊性纖維化兒童的肝病和纖維化嚴(yán)重程度。江波濤等［13］通過生物信息學(xué)方法及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-34a-5p在糖尿病肝病病變過程中表達(dá)上調(diào)。HARRISON等［14］通過1項(xiàng)基于血液的生物標(biāo)志物組的診斷方法，將miR-34a-5p作為非酒精性脂肪性肝炎 （nonalcoholic steatohepatitis，NASH） 相關(guān)生物標(biāo)志物中4個(gè)獨(dú)立的標(biāo)志之一，為在代謝危險(xiǎn)因素和疑似疾病的患者中無(wú)創(chuàng)性地排除或排除處于危險(xiǎn)的NASH提供了有效途徑，有可能大大減少疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)較低患者不必要的肝活檢。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)活化的LX2細(xì)胞中miR-34a-5p的表達(dá)水平顯著高于正常人HSC。Hh信號(hào)通路特異性Smo抑制劑可使LX2細(xì)胞增值活力顯著降低，凋亡率顯著增加，HSC活化標(biāo)志蛋白α-SMA和Col-Ⅰ表達(dá)均下調(diào)，Hh信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白Shh、Gli1、Gli2表達(dá)均下調(diào)，而miR-34a-5p過表達(dá)可上調(diào)LX2細(xì)胞中Gli1和Gli2蛋白表達(dá)水平，且細(xì)胞增殖活力顯著升高，凋亡率顯著降低。

綜上所述，miR-34a-5p可上調(diào)Hh信號(hào)通路相關(guān)蛋白Gli的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)LX2細(xì)胞的增殖與活化。后續(xù)研究將建立肝纖維化大鼠模型，進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果，為深入了解肝纖維化發(fā)病機(jī)制及治療提供新思路。