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    三文魚刺身中菌落總數(shù)不確定度評(píng)定

    2023-08-18 09:02:46寧禮信周敏黎子林蘇水嬌高志城張任廣
    食品工業(yè) 2023年8期
    關(guān)鍵詞:三文魚總數(shù)無(wú)菌

    寧禮信,周敏,黎子林,蘇水嬌,高志城,張任廣

    1. 廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心),廣東省化學(xué)測(cè)量與應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省原位電離質(zhì)譜分析工程技術(shù)研究中心(廣州 510070);2. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院粵港澳大灣區(qū)研究院(中山 528437)

    食品安全是一直以來(lái)備受關(guān)注的話題[3],菌落總數(shù)又是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生狀況的一項(xiàng)重要指標(biāo)[4-5],因此對(duì)食品中菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)量不確定度的評(píng)價(jià)[6-10]非常必要。國(guó)際上對(duì)各種食品中菌落總數(shù)不確定度的測(cè)量都有豐富經(jīng)驗(yàn),但對(duì)生食水產(chǎn)品中菌落總數(shù)不確定度的評(píng)定研究較少,試驗(yàn)依據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[1]檢測(cè)三文魚刺身樣品的菌落總數(shù),按照J(rèn)JF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[2]規(guī)范分析檢測(cè)結(jié)果不確定度的來(lái)源并建立數(shù)學(xué)模型,分別對(duì)引入的不確定度分量進(jìn)行評(píng)定,以合成計(jì)算的方法評(píng)定菌落總數(shù)的不確定度[11-13],通過(guò)有效評(píng)定菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果的不確定度,進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和可靠性。

    1 材料與檢測(cè)方法

    1.1 測(cè)試樣品

    研究測(cè)量不確定度評(píng)定實(shí)例為單一樣品的重復(fù)測(cè)量,測(cè)試樣品為三文魚刺身。即食生制動(dòng)物性水產(chǎn)品的微生物限量應(yīng)符合GB 10136—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性水產(chǎn)制品》[14],該標(biāo)準(zhǔn)采取的是三級(jí)采樣方案,其菌落總數(shù)的限值為n=5,c=2,m=5×104CFU/g,M=105CFU/g,即:在5個(gè)樣品中,允許全部樣品中相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值≤5×104CFU/g;允許有≤2個(gè)樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值在5×104CFU/g和5×105CFU/g之間;不允許有樣品相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值大于105CFU/g。根據(jù)已有檢測(cè)經(jīng)驗(yàn),三文魚菌落總數(shù)的稀釋度確定為10-1,10-2和10-3這3個(gè)稀釋度。

    1.2 材料與設(shè)備

    平板計(jì)數(shù)瓊脂(250 g,北京陸橋技術(shù)股份有限公司);電子天平(T1000Y,常熟市雙杰測(cè)試儀器廠);萬(wàn)級(jí)潔凈實(shí)驗(yàn)室;高壓蒸汽滅菌器(HVA-110,日本Hirayama公司);潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);生化培養(yǎng)箱(1400型,新西蘭 Contherm Scientific Ltd.)。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 檢測(cè)依據(jù)

    菌落總數(shù)測(cè)定根據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[1]。

    1.3.2 檢測(cè)過(guò)程

    以無(wú)菌操作將25 g檢樣生食水產(chǎn)品(三文魚刺身)放于盛有225 mL滅菌生理鹽水無(wú)菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1~2 min,制成1∶10的均勻稀釋液。用1 mL無(wú)菌吸管吸取1 mL 的1∶10樣品勻液,沿管壁緩慢注入含有9 mL稀釋液的無(wú)菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管,混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。另取1 mL滅菌吸管,按上述操作方法,制備10倍遞增稀釋勻液,如此每遞增稀釋1次,即換用1支1 mL滅菌吸管。根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì),選擇3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液,在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí),吸取1 mL樣品勻液于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做2個(gè)平皿。同時(shí),分別吸取1 mL空白稀釋液加入2個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)做空白對(duì)照。樣品勻液移入培養(yǎng)皿后,應(yīng)及時(shí)將冷卻至48 ℃平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿15~20 mL,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后,將平板翻轉(zhuǎn),置30±1 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72±3 h。記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。

    1.3.3 菌落計(jì)數(shù)

    選取菌落數(shù)在30~300 CFU、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板作為菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù),大于300 CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用2個(gè)平板平均數(shù)。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí),則不宜采用,而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù),若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平板內(nèi)上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線鏈狀生長(zhǎng)時(shí),則應(yīng)將每條鏈作為1個(gè)菌落計(jì)數(shù)。

    1.3.4 數(shù)學(xué)模型

    當(dāng)只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落在計(jì)數(shù)范圍內(nèi),按式(1)計(jì)算。當(dāng)有2個(gè)連續(xù)的稀釋度平板上的菌落在計(jì)數(shù)范圍內(nèi),則按式(2)計(jì)算。

    式中:N為檢測(cè)樣品中的菌落總數(shù);∑C為平板菌落總數(shù)的和,CFU/g;n1為低稀釋倍數(shù)平板個(gè)數(shù);n2為高稀釋倍數(shù)平板計(jì)數(shù);d為稀釋因子(第一稀釋度)。

    2 測(cè)量不確定度評(píng)定

    菌落總數(shù)不確定度測(cè)量除各種系統(tǒng)因素的影響外,還包括隨機(jī)因素的影響[15]。主要對(duì)樣品制備過(guò)程中引入的不確定度及重復(fù)測(cè)量時(shí)引入的不確定度進(jìn)行分析。

    2.1 樣品制備過(guò)程中引入的不確定度—

    2.1.1 天平引入的不確定度

    試驗(yàn)所使用的天平最大稱量為1 000 g,檢定分度值為1 g,實(shí)際分度值為0.1 g,根據(jù)JJG 1036—2008《中華人民共和國(guó)計(jì)量檢定規(guī)程:電子天平》[16]規(guī)定,此類天平在0~500 g稱量范圍時(shí)的允許誤差為±0.5 g,按矩形分布,,天平稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

    2.1.2 量筒引入的不確定度

    試驗(yàn)所使用量筒為250 mL,根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[17]規(guī)定250 mL量筒容量允許誤差為±2.0 mL,根據(jù)CNAS-GL006:2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[18],按三角分布處理,即,量筒引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel(量筒)=。

    2.1.3 樣品稀釋過(guò)程引入的不確定度

    樣品稀釋時(shí)使用1 mL和10 mL這2種移液槍,用1 mL移液槍吸取1 mL的不同稀釋度溶液,用9 mL移液槍吸取9mL無(wú)菌生理鹽水,按照J(rèn)JG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[19],量取1 mL和9 mL液體時(shí),容量允許誤差分別是±1.0%和±0.6%,取矩形分布,,移液槍引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。試驗(yàn)取3個(gè)連續(xù)稀釋度(10-1,10-2和10-3),樣品稀釋過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.012 1。

    2.2 重復(fù)測(cè)量時(shí)引入的不確定度

    同一樣品重復(fù)測(cè)量10次,取其平均值作為測(cè)量結(jié)果,見(jiàn)表1。

    表1 10次重復(fù)測(cè)量的平皿計(jì)數(shù)結(jié)果

    結(jié)果數(shù)據(jù)發(fā)散性大,用常規(guī)的直接根據(jù)平均值得到標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法顯得有些不合理。通常的做法是取對(duì)數(shù)以后再用常規(guī)的貝塞爾方法進(jìn)行計(jì)算。

    表2 單一樣品重復(fù)測(cè)量的計(jì)算過(guò)程

    2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度

    2.4 僅考慮重復(fù)測(cè)量引入的不確定度

    平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為μc(lgx)=Urel(菌落)=0.134 6。95%置信概率下包含因子k取2,其擴(kuò)展不確定度為U=k×μc(lgx)=2×0.134 6=0.27。取反對(duì)數(shù),由lgx坐標(biāo)回到x坐標(biāo)。由于lgx與x之間的非線性關(guān)系,不能直接求擴(kuò)展不確定度U的反對(duì)數(shù),只能給出微生物含量的可能區(qū)間。因此確定lgx的取值范圍lgx=4.16±0.27,或?qū)懗?.89≤lgx≤4.43。取反對(duì)數(shù)后,仍可得7.8×103CFU/g≤x≤2.7×104CFU/g。

    2.5 不確定度報(bào)告

    按照GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[1]規(guī)定的檢測(cè)程序進(jìn)行,被測(cè)樣品微生物菌落總數(shù)(10次測(cè)量平均值)在7.8×103~2.7×104CFU/g之間。

    3 結(jié)論

    菌落總數(shù)是食品微生物檢驗(yàn)的常規(guī)項(xiàng)目之一,不同產(chǎn)品有不同的菌落總數(shù)限量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)結(jié)果處于臨界值時(shí),取值區(qū)間就顯得尤為重要[20]。由于菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果的數(shù)據(jù)發(fā)散性較大,不符合正態(tài)分布,不適用于直接計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差,因此需取其對(duì)數(shù)后進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,利用貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度,最終合成菌落總數(shù)測(cè)定的不確定度,以進(jìn)一步減少各方面引入的誤差,使檢測(cè)結(jié)果更加接近真值[21]。從研究結(jié)果看,重復(fù)測(cè)量結(jié)果中最大值和最小值相差約4倍,發(fā)散較大,與其相比,其他不確定因素都可以忽略,因此僅考慮由測(cè)量結(jié)果發(fā)散引入的不確定度即可。應(yīng)用不確定度分析和評(píng)定能夠更加了解動(dòng)物性水產(chǎn)制品菌落總數(shù)測(cè)定過(guò)程中的誤差來(lái)源,減少測(cè)試人員在試驗(yàn)過(guò)程中由于操作不當(dāng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的影響,在結(jié)果處于超標(biāo)臨界值時(shí)發(fā)揮一定的判定作用,確保檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性、科學(xué)性和客觀性。

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