毛酸漿果渣黃色素的提取、穩(wěn)定性及抗氧化性研究

李向榮，潘宇，丁一鳴，劉鑫，黃玉舟 ，王晶晶*

1. 錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121000）；2. 遼寧智慧安鮮物聯(lián)網(wǎng)科技有限公司（沈陽 110000）；3. 遼寧通正檢測有限公司（沈陽 110000）

毛酸漿（Physalis pubescenceL.），又名洋菇娘，是酸漿屬的1年生草本植物，成熟后為顏色金黃的小漿果。其因味道酸甜可口，富含多種營養(yǎng)成分為人們所喜愛。研究表明，毛酸漿具有抗菌、抗氧化、去熱降火、清肺消腫等多種健康益處[1]。由于毛酸漿屬于季節(jié)性水果，受到時(shí)間和儲運(yùn)的限制，鮮果產(chǎn)業(yè)鏈效益不高。近年來，國內(nèi)學(xué)者對毛酸漿的深加工技術(shù)進(jìn)行研究，包括飲料、果醬、罐頭、果脯、果醋等[2]。然而，由此產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物和廢物卻未得到開發(fā)利用，嚴(yán)重影響產(chǎn)業(yè)鏈的完整性。毛酸漿果實(shí)出汁率可達(dá)60%以上，果渣產(chǎn)出率接近30%。有報(bào)道顯示[3]，毛酸漿果和宿萼中含大量黃色素，其主要成分為類胡蘿卜素。但關(guān)于毛酸漿色素的研究顯示，提取方法單一，工藝優(yōu)化參數(shù)不夠，色素的穩(wěn)定性和抗氧化性等功能性評價(jià)關(guān)鍵數(shù)據(jù)不足，缺乏轉(zhuǎn)化為工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)研究。關(guān)于毛酸漿果渣綜合利用開發(fā)的研究尚未見諸報(bào)道。

天然色素因來源廣泛，安全性高，具有多種生物活性[4-6]，而成為近年來的研究熱點(diǎn)。天然色素提取方法主要有水浴提取法[7]、超臨界流體萃取法[8]、酶法[9]和微波萃取法[10]。已報(bào)道的毛酸漿色素提取方法為傳統(tǒng)的熱法浸提，其操作過程復(fù)雜，效率低下，能耗大。許多研究表明，超聲波輔助提取法是一種高效、低耗能、易于工業(yè)化生產(chǎn)的提取方法[11]，已被運(yùn)用于花青素、酚類及類黃酮的提取加工[12-14]。試驗(yàn)對超聲波輔助提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)的研究，分析所得的毛酸漿果渣色素的穩(wěn)定性和抗氧化活性，為毛酸漿果渣色素的綜合開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛酸漿（市售）；無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（AR分析純，天津市天力試劑有限公司）；β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥98%，索萊寶生物有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-5100B型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；GTSONIC-P型超聲器（廣東固特超聲股份有限公司）；HR/T20MM型立式冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；SHA-B型水浴恒溫振蕩器（金壇市科析儀器有限公司）；K2025型高效液相色譜儀（山東悟空儀器有限公司）；Readmax 1900型光吸收波長酶標(biāo)儀（上海閃譜科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

取新鮮毛酸漿果實(shí)，榨汁后取果渣，在50 ℃干燥箱中干燥3 h，取出果渣，經(jīng)粉碎后得毛酸漿果渣粉，于4 ℃密封避光保存。

1.3.2 毛酸漿果渣色素提取溶劑的選擇

準(zhǔn)確稱取0.5 g毛酸漿果渣粉，分別加入5 mL的60%丙酮、丙酮、乙醇、乙酸乙酯和石油醚溶劑，于50 ℃恒溫振蕩浸提2 h，按4 500 r/min離心15 min，取上清液，對比觀察色素溶出效果。

1.3.3 毛酸漿果渣色素最大吸收波長的掃描

采用1.3.2小節(jié)中色素溶出效果最好的溶劑為提取溶劑，在350～600 nm范圍內(nèi)對提取溶液進(jìn)行波長掃描，確定毛酸漿果渣色素的最大吸收波長。

1.3.4 毛酸漿果渣色素提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)1.3.2和1.3.3小節(jié)的結(jié)果，以丙酮為溶劑，采用超聲波輔助溶劑法進(jìn)行提取，高速離心后取上清液，以吸光度（A）作為提取效果評價(jià)指標(biāo)，分別探究超聲時(shí)間（10，15，20，25和30 min）、超聲功率（60，120，180，240和300 W）、超聲溫度（20，30，40，50和60 ℃）和料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25 g/mL）對毛酸漿果渣色素提取效果的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

1.3.5 毛酸漿果渣黃色素中類胡蘿卜素的檢測

采用優(yōu)化后的工藝提取毛酸漿果渣黃色素，以β-胡蘿卜素為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)胡利強(qiáng)等[15]方法，采用高效液相色譜法對果渣色素中的類胡蘿卜素含量進(jìn)行檢測。稱取20 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用二氯甲烷溶解，配制質(zhì)量濃度梯度分別為0.5，1.0，2.0，4.0和8.0 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=136.6x-22.811，R2=0.991 2。

1.3.6 毛酸漿果渣黃色素穩(wěn)定性評價(jià)

以色素保存率為評價(jià)指標(biāo)，分別檢測溫度（30，40，50，60和70 ℃，保溫1 h）、pH（pH 4，6，8，10和12，室溫放置3 h）和光照條件對毛酸漿果渣黃色素穩(wěn)定性的影響。光照試驗(yàn)中，以暗室、室內(nèi)、室外分別等替避光、自然光和強(qiáng)光（模擬高強(qiáng)度紫外線照射）的處理?xiàng)l件，放置5 d。色素保存率按式（1）計(jì)算[16]。

式中：S為色素保存率，%；A0為初始吸光度；AX為經(jīng)處理后測得吸光度。

1.3.7 毛酸漿果渣黃色素抗氧化評價(jià)[17-19]

以VC為陽性對照品，分別考察不同濃度毛酸漿果渣黃色素對DPPH·和ABTS·的清除活性。DPPH·自由基清除率按式（2）計(jì)算，ABTS·自由基清除率按式（3）計(jì)算。

式中：A1為樣品待測液和配制的DPPH溶液對應(yīng)測得的吸光度；A2為樣品待測液和無水乙醇對應(yīng)測定的吸光度；A0為DPPH-乙醇溶液和溶解樣品的試液測定的吸光度。

式中：A0為ABTS的吸光度；A1為樣品待測液和ABTS對應(yīng)測定的吸光度；

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取毛酸漿果渣色素的效果

由圖1可知，丙酮提取毛酸漿果渣色素的溶出效果最佳。丙酮在色素提取方面應(yīng)用廣泛，如蠶沙中葉黃素和β-胡蘿卜素的提取[20]，酸漿宿萼和紅雪茶中類胡蘿卜素的提取[21-22]等。研究表明，丙酮被廣泛用于提取類胡蘿卜色素。由于前期報(bào)道中提示[3]，毛酸漿果富含類胡蘿卜色素，因此，在后續(xù)研究中，采用丙酮作為毛酸漿色素的提取溶劑。

2.2 最大吸收波長的確定

圖2顯示，毛酸漿果渣黃色素的最大吸收波長為450 nm。

圖2 毛酸漿果渣色素波長掃描圖

2.3 毛酸漿果渣黃色素提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲時(shí)間對果渣黃色素溶出的影響

由圖3可見，提取時(shí)間25 min時(shí)吸光度最大，超過25 min后，吸光度顯著下降。這可能由于提取時(shí)間過長導(dǎo)致色素分子的部分化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，破壞色素小分子的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。超聲時(shí)間25 min時(shí)色素小分子的運(yùn)動速度加快增強(qiáng)介質(zhì)的穿透力，加速色素的溶出。

圖3 超聲時(shí)間對果渣色素吸光度的影響

2.3.2 超聲功率對果渣黃色素溶出的影響

由圖4可知，超聲功率180 W時(shí)，果渣色素的提取效果最佳。超聲波工作時(shí)會產(chǎn)生一定的熱能和機(jī)械效應(yīng)，會對植物的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)造成影響，產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)過小時(shí)，果渣植物細(xì)胞沒有完全破碎，其色素釋放不完全；隨著功率增大，其帶動的空化效應(yīng)和波動效應(yīng)對包裹目標(biāo)物的植物細(xì)胞壁破壞強(qiáng)烈，色素更易析出。

圖4 超聲功率對果渣色素吸光度的影響

2.3.3 超聲溫度對果渣黃色素溶出的影響

由圖5可見，超聲溫度50 ℃時(shí)，提取色素的效果最好。分析可知，毛酸漿果渣色素的吸光度隨著超聲溫度的上升而加大，溫度從40 ℃上升到50 ℃時(shí)，吸光度變化顯著。溫度繼續(xù)增加，色素吸光度變化不顯著。綜合考慮，將超聲溫度設(shè)為50 ℃。

圖5 超聲溫度對果渣色素吸光度的影響

2.3.4 料液比對果渣黃色素溶出的影響

由圖6可知，料液比1∶15 g/mL時(shí)，吸光度達(dá)到峰值。隨著溶劑量的增大，吸光度的變化趨勢呈先上升后下降。當(dāng)溶劑量在體系中存在較少時(shí)，果渣色素不能充分溶出到提取劑中；隨著濃度差減小，沒有足夠的動能傳播介質(zhì)，色素不能充分溶出釋放；隨著溶劑量的增大，果渣中的色素溶出逐漸增多且達(dá)到相對飽和的臨界狀態(tài)，提取效果最好。繼續(xù)增大溶劑量，物料被過分稀釋，導(dǎo)致吸光度降低，則達(dá)不到理想的提取效果。

圖6 料液比對果渣色素吸光度的影響

2.4 毛酸漿果渣黃色素的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

毛酸漿果渣黃色素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。色素吸光度（A）與各項(xiàng)因素建立的回歸方程為吸光度（A）=0.82+0.034A+0.042B+0.040C-0.025D-0.023AB+0.056AC+4.25×10-3AD-0.065BC+2×10-3BD-3×10-3CD-0.1A2-0.13B2-0.13C2-0.097D2。對回歸模型進(jìn)行系列方差分析，其結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析

由表3可以看出，所建立的回歸模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，變異系數(shù)5.26%＜10%，說明非試驗(yàn)因素對色素吸光度的結(jié)果影響不大，模型具有較好的穩(wěn)定性。模型相關(guān)系數(shù)R2為0.953 3，說明模型跟實(shí)際測試的結(jié)果擬合度較好。A（超聲功率）、B（料液比）、C（超聲溫度）和D（超聲時(shí)間）均顯著影響色素溶出效果，影響大小順序?yàn)榱弦罕龋境暅囟龋境暪β剩境晻r(shí)間。而且，超聲功率和超聲溫度，以及料液比和超聲溫度具有極顯著的交互影響作用。

如圖7～圖12所示，試驗(yàn)的響應(yīng)值（吸光度A）受超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率和料液比交互影響的三維立體圖，反映4種因素對吸光度（A）的影響程度及影響趨勢的不同。采用響應(yīng)面法優(yōu)化分析得到的毛酸漿果渣色素的最佳提取條件為超聲溫度51.73 ℃、超聲時(shí)間24.36 min、超聲功率191.85 W、料液比1∶15.52 g/mL，理論吸光度為0.831?？紤]到實(shí)際操作的方便性及可能存在誤差，設(shè)置超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間25 min、超聲功率180 W、料液比1∶15 g/mL。此時(shí)，果渣黃色素提取液吸光度為0.841±0.015，與理論值相差不大，說明經(jīng)響應(yīng)面法得到的優(yōu)化結(jié)果可靠。

圖7 液料比與超聲功率的交互作用

圖8 超聲溫度與超聲功率交互作用

圖9 超聲時(shí)間與超聲功率的交互作用

圖10 超聲溫度與液料比的交互作用

圖11 超聲時(shí)間與液料比的交互作用

圖12 超聲時(shí)間與超聲溫度的交互作用

2.5 毛酸漿果渣黃色素中的類胡蘿卜素含量

如圖13所示，所得毛酸漿果渣色素中類胡蘿卜素含量為3.947±0.135 mg/100 g DW。Hempel等[3]報(bào)道，毛酸漿果中含有1.28～1.38 mg/100 g FW的類胡蘿卜素，試驗(yàn)采用超聲波法獲得的色素中類胡蘿卜素含量高于該含量，可見毛酸漿果渣是適合提取色素的原料。

圖13 毛酸漿果渣黃色素中類胡蘿卜素的檢測色譜圖

2.6 毛酸漿果渣黃色素的穩(wěn)定性分析

由圖14和圖15可知，溫度、pH和不同光照條件對毛酸漿果渣黃色素的穩(wěn)定性有不同程度影響。隨著溫度的升高，色素保存率有下降趨勢，在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，保存率可達(dá)90%以上，說明其具備一定的熱穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明，毛酸漿果渣色素在酸性條件下無法保持穩(wěn)定的存在狀態(tài)。因果渣色素在酸性作用下催化，其環(huán)氧化合物會重新排列，導(dǎo)致色素降解。pH接近中性時(shí)，色素有較好的穩(wěn)定性。在堿性條件下，色素保存率下降。光照是影響色素穩(wěn)定性的重要因素，毛酸漿果渣黃色素保存效果是避光＞自然光＞強(qiáng)光，且在高強(qiáng)度紫外線照射下，色素易分解。分析因其中蘊(yùn)含的類胡蘿卜素吸收過多的紫外線且完全暴露在陽光的照射條件下，不光導(dǎo)致溶液溫度的升高，且強(qiáng)紫外線會破壞連接穩(wěn)定的化學(xué)鍵，使色素分子結(jié)構(gòu)發(fā)生空間旋轉(zhuǎn)異構(gòu)，使顏色發(fā)生變化。所以，在色素儲存和應(yīng)用中應(yīng)避免陽光直射及紫外線照射，以求保持其良好的色澤。

圖14 溫度和pH對果渣黃色素的影響

圖15 光照對果渣黃色素的影響

2.7 毛酸漿果渣黃色素抗氧化活性

由圖16可知，毛酸漿果渣黃色素具有一定清除DPPH和ABTS自由基的能力，且具有濃度依賴性關(guān)系，隨著濃度的增大，清除率逐漸增加。

圖16 DPPH和ABTS自由基清除效果圖

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，毛酸漿果渣黃色素中富含類胡蘿卜素，采用優(yōu)化后工藝參數(shù)，即料液比1∶15 g/mL，超聲功率180 W，50 ℃下超聲提取25 min，所得果渣黃色素中類胡蘿卜素含量為3.947±0.135 mg/100 mg。該色素具有較好的抗氧化活性，適宜在60 ℃以下，pH中性環(huán)境下避光保存。試驗(yàn)為毛酸漿果渣的綜合利用開發(fā)提供參考。