牛蒡多糖酶法提取工藝及其體外抗氧化活性

陳飛 ，丁朋，丁利，付婷偉，陳安徽，邵穎*

1. 徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院（徐州 221111）；2. 江蘇諾普樂生物科技有限公司（徐州 221116）；3. 徐州天益食品科技研究院有限公司（徐州 210009）

牛蒡，菊科牛蒡?qū)俨荼局参?，俗稱“東洋參”“大力子”“牛鞭菜”，是具有較高營養(yǎng)價值的藥食用食材，享有“蔬菜之王”的美譽[1-2]。牛蒡根中富含膳食纖維、胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、鈣、鐵等營養(yǎng)成分，及多糖、多酚、黃酮等生物活性因子，具有抗菌、降糖降脂、抗突變、利尿、促膽汁分泌等功效，可用于治療風(fēng)濕、痛風(fēng)等血液性疾病及皮膚炎癥[3-5]。牛蒡根因豐富的營養(yǎng)價值及多效的生理活性而越來越受到關(guān)注，作為在我國具有較高產(chǎn)量的蔬菜，牛蒡顯現(xiàn)出巨大的開發(fā)利用潛力，其食用、保健、藥用等方面的系統(tǒng)研究也逐漸成為研究熱點[6-7]。

牛蒡多糖是牛蒡根中主要的生物活性成分，在抗氧化、防衰老、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、降血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等方面均有一定功效[8-10]，其常用提取方法包括熱水浸提法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酸堿浸提法和酶解法[11]。酶解法的高效、溫和、節(jié)能、不易破壞活性物質(zhì)等優(yōu)點使其在蛋白質(zhì)、多肽、多糖等活性物質(zhì)的提取中被廣泛使用[12-13]。試驗優(yōu)化牛蒡根多糖的酶法提取工藝并探討牛蒡根多糖的體外抗氧化活性，為牛蒡的精深加工開拓路徑，同時為牛蒡多糖的產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮帶皮牛蒡干燥切片[天益食品（徐州）有限公司]；纖維素酶（10萬 U/g，食品級）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；DPPH試劑（美國Sigma公司）；菲咯嗪（Ferrozine，分析純，上海市源葉生物科技有限公司）；濃硫酸（分析純，上海華科試劑有限公司）；氯化亞鐵（分析純，廣東光華化學(xué)廠）；氯仿、正丁醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；30%過氧化氫（H2O2，Aladdin公司）。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見光分光光度計（UV2802PC，上海精密儀器儀表有限公司）；高速離心機（TUMEN TL-15，江蘇圖門離心機廠）；電子天平（梅特勒AE200，上海分析儀器廠）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-ⅢS，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R501，上海申勝生物技術(shù)有限公司）；真空冷凍干燥機（LGJ-10，上海比朗儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛蒡多糖提取率的測定

1.3.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取100 mg高溫烘干至無水恒重的葡萄糖于100 mL容量瓶中，配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繼而用蒸餾水分別配成0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12和0.14 mg/mL的葡萄糖溶液。分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于刻度試管中，分別加入1 mL 6%苯酚溶液，并迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min，搖勻后室溫下靜置20 min，用蒸餾水替代葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液做空白對照。測定各溶液在波長490 nm條件下的吸光度，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，曲線回歸方程為y=6.926 4x+0.156，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4，樣品質(zhì)量濃度在0.02～0.14 mg/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.1.2 牛蒡多糖提取率的測定

將牛蒡干切片研磨過0.850 mm孔徑（20目）篩。牛蒡粉采用酶解、離心、醇沉、離心、復(fù)溶、去蛋白、醇沉、離心、冷凍干燥的流程獲取牛蒡粗多糖。準(zhǔn)確稱取50 mg牛蒡粗多糖，準(zhǔn)確定容至500 mL容量瓶。取1 mL粗多糖溶液于試管中，加入1 mL的6%苯酚，迅速加入5 mL濃硫酸，靜置10 min后搖勻。將試管于40 ℃恒溫水浴鍋中水浴保溫15 min，然后測定溶液于490 nm波長處的吸光度。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，將測定出的溶液吸光度代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖的質(zhì)量濃度，并按照式（1）計算多糖的提取率。

式中：W為牛蒡粉質(zhì)量，g；C為牛蒡多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為牛蒡多糖溶液體積，mL；F為測定用牛蒡多糖溶液的稀釋倍數(shù)；0.9為葡萄糖換算成多糖的校正系數(shù)。

1.3.2 牛蒡多糖提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 酶解時間對牛蒡多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份牛蒡粉，按照1∶20（g/mL）的比例加入蒸餾水，根據(jù)牛蒡粉質(zhì)量加入0.4%的10萬 U/g纖維素酶，并于40 ℃恒溫水浴鍋中酶解40，60，80，100和120 min。獲得的酶解液于沸水浴中滅酶處理并冷卻后在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液。將加入95%乙醇且終濃度達到80%的上清液在4 ℃條件下靜置10 h。在4 000 r/min條件下離心10 min后收集沉淀，沉淀冷凍干燥后復(fù)溶，加入除蛋白試劑（V正丁醇∶V氯仿=1∶4），使其最終濃度達到25%，充分振蕩1 h左右，在4 000 r/min條件下離心10 min，收集水層。再次加入95%乙醇使其終濃度達到80%，并在4 ℃條件下靜置10 h，在4 000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀，沉淀冷凍干燥后測定多糖提取率。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

1.3.2.2 料液比對牛蒡多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份牛蒡粉，分別按照料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）的比例加入蒸餾水，根據(jù)牛蒡粉質(zhì)量加入0.4%的10萬 U/g的纖維素酶并于40 ℃恒溫水浴鍋中酶解80 min。獲得的酶解液于沸水浴中滅酶處理并冷卻后在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液。后續(xù)提取及測定流程同1.3.2.1的方法。

1.3.2.3 加酶量對牛蒡多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份牛蒡粉，按照1∶20（g/mL）料液比加入蒸餾水，根據(jù)牛蒡粉質(zhì)量分別加入0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%的10萬 U/g的纖維素酶并于40 ℃恒溫水浴鍋中酶解80 min。獲得的酶解液于沸水浴中滅酶處理并冷卻后在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液。后續(xù)提取及測定流程同1.3.2.1的方法。

1.3.2.4 酶解溫度對牛蒡多糖提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份牛蒡粉，按照1∶20（g/mL）料液比加入蒸餾水，根據(jù)牛蒡粉質(zhì)量加入0.4%的10萬 U/g的纖維素酶并分別于30，40，50，60和70 ℃恒溫水浴鍋中酶解80 min。獲得的酶解液于沸水浴中滅酶處理并冷卻后在4 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液。后續(xù)提取及測定流程同1.3.2.1的方法。

1.3.2.5 牛蒡多糖提取工藝優(yōu)化

采用正交試驗法優(yōu)化牛蒡多糖提取工藝。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以酶解時間（min）、料液比（g/mL）、加酶量（%）和酶解溫度（℃）為因素，采用正交設(shè)計軟件設(shè)計四因素三水平的正交試驗方案L9(34)以確定多糖的最佳提取條件。試驗因素與水平表如表1所示。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.3 牛蒡多糖體外抗氧化活性測定

1.3.3.1 還原力的測定

將凍干的牛蒡粗多糖配制成梯度濃度的多糖溶液（0.2～1.4 mg/mL），取2 mL各濃度的多糖溶液，加入2 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液，加入2 mL 1%（W/W）鐵氰化鉀溶液，振蕩搖勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫20 min后加入2 mL 10%（W/W）三氯乙酸溶液，混勻后以3 000 r/min離心10 min。離心后吸取2 mL的上清液，加2 mL去離子水和0.4 mL 0.1%（W/W）FeCl3溶液，振蕩搖勻后在50 ℃水浴條件下保溫10 min，體系溶液的顏色由黃色變成藍(lán)色時，測定溶液于波長700 nm處的吸光度A700nm?？瞻讓φ沼谜麴s水代替樣品，以稀釋至不同質(zhì)量濃度（0.02～0.1 g/L）的VC作為陽性對照。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力測定

將牛蒡粗多糖配制成梯度濃度（0.2～1.4 mg/mL）的溶液。準(zhǔn)確量取1.5 mL各濃度多糖溶液，加入1.5 mL含0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇，充分混勻后在室溫下避光靜置30 min，于波長517 nm處測定溶液吸光度。以稀釋至不同質(zhì)量濃度（0.01～0.5 g/L）的VC作陽性對照。DPPH自由基清除率按照式（2）計算。

式中：Ac為對照組吸光度，即1.5 mL蒸餾水+1.5 mL含 DPPH的95%乙醇；Ai為樣品組吸光度，即1.5 mL多糖溶液+1.5 mL含DPPH的95%乙醇；Aj為空白組吸光度，即1.5 mL多糖溶液+1.5 mL 95%乙醇。

1.3.3.3 超氧陰離子清除能力測定

量取6 mL pH 8的Tris-HCl緩沖液，在25 ℃水浴條件下預(yù)熱20 min，加入1 mL配制好的不同梯度濃度的多糖溶液和1 mL 6 mmoL/L的鄰苯三酚溶液并充分混勻，混合液在40 ℃水浴條件下保溫10 min，加入1 mL濃鹽酸終止反應(yīng)。測定溶液于波長325 nm處吸光度。以蒸餾水代替多糖溶液作為空白組。O2-清除率按式（3）計算。

式中：Aj為空白組吸光度，即未加多糖樣品的溶液吸光度；Ai為樣品組吸光度，即加入多糖樣品的溶液吸光度。

1.3.3.4 羥自由基清除能力測定

采用鄰二氮菲比色法測定。損傷組：量取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液，加入1 mL 0.2 mol/L pH 7.40的磷酸鹽緩沖液，加入0.5 mL去離子水，振蕩混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L的FeSO4，混勻后加入0.5 mL 0.01%（V/V）的H2O2，在37 ℃條件下水浴保溫60 min，測定波長536 nm處的吸光度，記為A損。未損傷組：以0.5 mL的去離子水代替損傷管中的H2O2重復(fù)上述操作步驟，測定的吸光度記為A未損。樣品組：量取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液，加入1 mL 0.2 mol/L pH 7.40的磷酸鹽緩沖液，加入0.5 mL去離子水，振蕩混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L的FeSO4，充分混勻后加入0.5 mL 0.01%（V/V）的H2O2，在37 ℃條件下水浴保溫60 min，測定波長536 nm處的吸光度，記為A樣。

樣品參比溶液：取1 mL 0.2 mol/L pH 7.40的磷酸鹽緩沖液，加入0.5 mL多糖溶液，混合后加入1.5 mL去離子水，測定波長536 nm處的吸光度，記為A參?？瞻讌⒈热芤海喝? mL 0.2 mol/L pH 7.40的磷酸鹽緩沖液，加入2 mL去離子水，作為空白管，用于調(diào)零，其在536 nm波長處的吸光度記為A空。羥基自由基清除率按式（4）計算。

式中：A樣為樣品組吸光度；A參為樣品參比溶液吸光度；A損為損傷組吸光度；A未損為未損傷組吸光度；A空為空白對照組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理。試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡多糖提取工藝優(yōu)化

2.1.1 酶解時間對多糖提取的影響

采用1.2.3.1的方法探討酶解時間對牛蒡多糖提取的影響，試驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解時間對牛蒡多糖提取的影響

酶解時間會對牛蒡多糖的提取產(chǎn)生顯著的影響。酶解時間在40～120 min范圍內(nèi)，多糖提取率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，酶解時間80 min時，牛蒡多糖提取率達到最大19.78%±0.63%，顯著高于其他條件下的提取率（P＜0.5）。這可能是因為80 min時酶解反應(yīng)和浸提效果達到最佳狀態(tài)，而超過80 min酶解體系中纖維素酶的活性受到影響而導(dǎo)致多糖提取率下降。

2.1.2 料液比對多糖提取的影響

提取料液比對牛蒡多糖提取率的影響如圖3所示。提取料液比對多糖提取率的影響較明顯。隨著提取溶劑的增加，多糖提取率先上升后降低，料液比1∶20（g/mL）時提取率最高，達到20.49%±0.46%，顯著高于其他料液比條件的多糖提取率（P＜0.05）。因此多糖提取的最優(yōu)料液比為1∶20（g/mL）。

圖3 料液比對牛蒡多糖提取的影響

2.1.3 加酶量對多糖提取的影響

加酶量對牛蒡多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。纖維素酶添加劑量在0.2%～1.0%范圍內(nèi)，牛蒡多糖的提取率呈先升高后降低的變化趨勢。酶添加劑量0.4%時，多糖提取率最高，為20.12%±0.35%，繼續(xù)增加纖維素酶的使用劑量反而會降低多糖的提取率。因此適宜的牛蒡多糖提取的酶的最佳添加劑量為0.4%。

圖4 加酶量對牛蒡多糖提取的影響

2.1.4 酶解溫度對多糖提取的影響

酶解溫度對牛蒡多糖提取的影響結(jié)果如圖5所示。在30～70 ℃的溫度范圍內(nèi)，起初隨著酶解溫度的升高，牛蒡多糖提取率顯著提高，在40 ℃時提取率為21.67%±0.81%，達到最高，隨著酶解溫度繼續(xù)升高，多糖提取率顯著下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因應(yīng)該與溫度對酶影響特點有關(guān)，40 ℃應(yīng)該是酶的最適酶解溫度，溫度超過60 ℃后，酶會隨著溫度的升高而逐漸失活，酶解能力也會隨之顯著下降。

圖5 酶解溫度對牛蒡多糖提取的影響

2.1.5 牛蒡多糖提取正交試驗

在料液比、加酶量、酶解溫度、酶解時間的單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計以牛蒡多糖提取率為指標(biāo)的正交試驗。試驗結(jié)果及正交分析表如表2和表3所示。

表2 正交試驗表

表3 方差分析表

由表2的結(jié)果可知，影響牛蒡多糖提取率的因素次序為A＞D＞B＞C，即料液比＞酶解時間＞加酶量＞酶解溫度，最佳的提取組合為A3B2C2D3，即料液比1∶20（g/mL）、酶解時間80 min、加酶量0.4%、酶解溫度40 ℃。方差分析表顯示影響因素料液比、酶解時間和加酶量對牛蒡多糖提取率的影響均達到極顯著水平（P＜0.01）。在最優(yōu)組合下進行驗證試驗，牛蒡多糖提取率達到39.55%±1.32%，顯著高于正交試驗結(jié)果最大值36.17%±0.91%（P＜0.05）。因此，牛蒡多糖的最佳提取工藝為料液比1∶20（g/mL）、酶解時間80 min、加酶量0.4%、酶解溫度40 ℃。

2.2 牛蒡多糖體外抗氧化活性

2.2.1 牛蒡多糖還原力的測定

牛蒡多糖還原能力的結(jié)果如圖6所示。牛蒡多糖在0.2～1.4 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，多糖還原力隨著多糖濃度的提高而逐漸增加，多糖質(zhì)量濃度1.4 mg/mL時，吸光度為0.84，且還原力與多糖濃度間呈現(xiàn)一定正相關(guān)性。說明牛蒡多糖具有還原能力。

圖6 牛蒡多糖的還原力

2.2.2 牛蒡多糖DPPH自由基清除活性

以VC為陽性對照測定牛蒡多糖對DPPH自由基清除活性的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 牛蒡多糖對DPPH自由基清除率的影響

牛蒡多糖對DPPH自由基具有明顯的清除作用。多糖質(zhì)量濃度在0～1.4 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH自由清除率隨著牛蒡多糖質(zhì)量濃度的提高而上升。多糖質(zhì)量濃度1.4 mg/mL時，自由基清除率達到66.86%，且清除率曲線的走勢總體呈現(xiàn)上升趨勢。

2.2.3 牛蒡多糖對超氧陰離子的清除活性

牛蒡多糖對超氧陰離子清除率的影響結(jié)果如圖8所示。所示。牛蒡多糖質(zhì)量濃度在0.2～1.4 mg/mL 范圍內(nèi)，隨著牛蒡多糖濃度的提高，其對超氧陰離子的清除率隨之增強，說明牛蒡多糖具有一定的超氧陰離子清除能力。從曲線趨勢還可看出，牛蒡多糖的超氧陰離子清除率與多糖濃度間還呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)關(guān)系，經(jīng)分析計算牛蒡多糖對超氧陰離子的IC50為1.09 mg/mL。

圖8 牛蒡多糖對超氧陰離子清除率的影響

2.2.4 牛蒡多糖對羥自由基的清除能力

牛蒡多糖對羥自由基清除率的影響結(jié)果如圖9所示。牛蒡多糖質(zhì)量濃度在0.2～1.4 mg/mL范圍內(nèi)，牛蒡多糖對羥自由基清除率隨著多糖濃度的提高而增加，且二者之間還呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。說明牛蒡多糖具有羥自由基清除活性，牛蒡多糖對羥自由基的IC50為0.79 mg/mL。

圖9 牛蒡多糖對羥自由基清除率的影響

3 結(jié)論

以牛蒡多糖提取率為指標(biāo)，采用正交試驗法優(yōu)化牛蒡多糖的纖維素酶酶法提取工藝，確定牛蒡多糖的酶法提取最佳工藝：料液比1∶20（g/mL）、酶解時間80 min、纖維素酶添加量0.4%、酶解溫度40 ℃。在此工藝下，牛蒡多糖提取率達39.55%±1.32%。對提取到的牛蒡多糖進行抗氧化活性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛蒡多糖具有顯著的抗氧化活性。牛蒡多糖質(zhì)量濃度1.4 mg/mL時，還原力測定中A700nm達到0.84，多糖對DPPH自由基、超氧陰離子及羥基自由基的清除率分別達到66.86%±1.26%，64.23%±2.05%和71.94%±2.18%，經(jīng)統(tǒng)計分析其對超氧陰離子及羥基自由基半抑制濃度IC50分別為1.09和0.79 mg/mL。說明牛蒡多糖具有較好的體外抗氧化活性，值得對其進行挖掘應(yīng)用。