平貝母多糖的提取工藝及其體外抗氧化活性研究

劉佳維，張雪茹，羅付禹，王宣，才玉婷

牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（牡丹江 157011）

平貝母為百合科貝母屬多年生草本平貝母（Fritillaria ussuriensisMaxim）的干燥莖[1]，亦稱平貝，為我國(guó)東北珍貴藥用植物之一，發(fā)展歷史和使用歷史較長(zhǎng)，在臨床應(yīng)用和藥材市場(chǎng)中占有重要位置。平貝母記載始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，將其列為中品，具有化痰止咳、清熱潤(rùn)肺之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明平貝母具有平喘、鎮(zhèn)咳祛痰[2]、抗炎[3]、抗氧化等多方面生物活性[4-5]。平貝母中含有皂苷類、生物堿類[6-7]、多糖類[8]、核苷類等有效化學(xué)成分。已報(bào)道關(guān)于平貝母中多糖的研究甚少。

天然的抗氧化劑具有安全、易獲取、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，因此從藥食同源的植物中提取抗氧化劑成為研究熱點(diǎn)。試驗(yàn)以平貝母為原料，采用響應(yīng)面法對(duì)平貝母多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，平貝母多糖體外抗氧化活性通過(guò)其對(duì)DPPH自由基的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)，以期為平貝母資源的深層次開(kāi)發(fā)與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平貝母（購(gòu)自吉林省吉林市）。

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，國(guó)藥集團(tuán)工業(yè)股份有限公司）；維生素C（VC，陜西京西藥業(yè)有限公司）；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（博睿糖生物科技有限公司）；苯酚、無(wú)水乙醇、正丁醇、氯仿、濃硫酸（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

HN-1000CT恒溫超聲波提取機(jī)（上海汗諾儀器有限公司）；723型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；RE-529旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海予華儀器有限公司）；L-550臺(tái)式低速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；BS 110S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3 平貝母多糖的制備

平貝母粉碎后，過(guò)篩（0.180 mm，即80目）。圓底燒瓶?jī)?nèi)加入平貝母和無(wú)水乙醇（1∶5 g/mL），加熱回流2 h，過(guò)濾，重復(fù)2次。脫脂后的平貝母過(guò)濾烘干，待用。平貝母采用超聲輔助法提取，重復(fù)2次，濾液合并后濃縮至適當(dāng)體積，用無(wú)水乙醇調(diào)整乙醇體積分?jǐn)?shù)至80%，靜置過(guò)夜（4 ℃），離心。沉淀復(fù)溶后按1/4的比例加入Sevage試劑，磁力攪拌30 min（4 000 r/min），離心20 min，取上層清液重復(fù)操作。多糖溶液放入3 500 Da的透析袋中透析48 h，冷凍干燥得到平貝母多糖[9]。

1.4 平貝母多糖提取率的測(cè)定

多糖含量采用苯酚-硫酸法[10]測(cè)定，獲得回歸方程y=2.39x-0.011 1，R2=0.999 1。根據(jù)式（1）計(jì)算平貝母多糖提取率。

式中：C為多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；D為溶液稀釋倍數(shù)；V為多糖溶液體積，mL；m為平貝母質(zhì)量，mg。

1.5 單因素試驗(yàn)

精確稱取2.0 g平貝母干粉，在固定超聲功率50 W、超聲時(shí)間20 min、料液比1∶30 g/mL、提取溫度40 ℃條件下，考察料液比（1∶20，1∶25，1∶30，1∶35和1∶40 g/mL）、超聲功率（30，40，50，60和70 W）、超聲時(shí)間（10，15，20，25和30 min）和提取溫度（25，30，35，40和45 ℃）對(duì)平貝母多糖提取率的影響[11-12]。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

平貝母多糖提取工藝采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化[13-14]，以料液比（A）、超聲功率（B）、超聲時(shí)間（C）、提取溫度（D）為考察參數(shù)，多糖提取率為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.7 紫外吸收光譜分析

配制平貝母多糖（0.1 mg/mL）溶液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

1.8 單糖組成分析

1.8.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制16種10 mg/mL單糖的儲(chǔ)備液。

1.8.2 樣品準(zhǔn)備

精密稱取5 mg樣品置于安瓿瓶中，加入2 mL 3 mol/L TFA，于120 ℃水解3 h。準(zhǔn)確吸取酸水解溶液轉(zhuǎn)移至管中氮吹吹干，加入5 mL水渦旋混勻，吸取50 μL加入950 μL去離子水，按12 000 r/min離心5 min。取上清進(jìn)IC分析。

1.8.3 色譜條件

色譜柱Dionex CarbopacTM PA20（3 mm×150 mm）；流動(dòng)相A為H2O，流動(dòng)相B為15 mmol/L NaOH，流動(dòng)相C為15 mmol/L NaOH-100 mmol/L NaOAC；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)器為電化學(xué)檢測(cè)器。

1.9 紅外光譜分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]方法，精密稱取1 mg平貝母多糖，與100 mg KBr晶體充分研磨，均勻混合后壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.10 DPPH自由基的清除作用測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]的方法，稍作改動(dòng)。配制VC和平貝母多糖溶液（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0和4.0 mg/mL），分別取2 mL于試管中，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混勻，避光反應(yīng)（30 min），測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度，3次重復(fù)試驗(yàn)。以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，VC為陽(yáng)性對(duì)照，平貝母多糖對(duì)DPPH自由基的清除率用式（2）計(jì)算。

式中：A0為無(wú)水乙醇+DPPH的吸光度；A1為多糖+DPPH的吸光度；A2為多糖+無(wú)水乙醇的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

由圖1可知，料液比中液體占比由1∶20 g/mL增加至1∶30 g/mL后，多糖提取率也逐漸提高。多糖提取率在料液比1∶30 g/mL時(shí)最大，為8.31%。料液比中液體占比繼續(xù)升高增至1∶40 g/mL時(shí)，多糖提取率則降低。其主要原因是料液比中液體占比過(guò)小時(shí)多糖無(wú)法完全滲入溶劑而使得提取率偏低，料液比中液體占比過(guò)大時(shí)多糖會(huì)和其他可溶性組分相結(jié)合而造成提取率降低[17]。所以選取料液比1∶25～1∶35 g/mL用于優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

2.1.2 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

如圖2所示，超聲功率由30 W增加到50 W時(shí)，多糖提取率逐漸增大。超聲功率50 W時(shí)，平貝母多糖提取率達(dá)到最大值8.59%。超聲功率大于50 W后，多糖提取率則緩慢降低，這可能是因?yàn)榭昭ㄐ?yīng)導(dǎo)致溶劑中的氣泡數(shù)增多，導(dǎo)致超聲能量向介質(zhì)傳播的效率降低[18]。因此選取超聲功率40～60 W用于優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖3可知，超聲時(shí)間10～30 min時(shí)，多糖提取率先升高后逐漸下降，超聲時(shí)間15 min時(shí)達(dá)到最大值9.67%，可能是超聲10～15 min內(nèi)對(duì)平貝母破壞作用較強(qiáng)，因此多糖提取率較高。超聲時(shí)間繼續(xù)增加后，平貝母多糖提取率緩慢下降，可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，多糖結(jié)構(gòu)被破壞[19-20]。因此選取超聲時(shí)間10～20 min用于優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

如圖4所示，提取溫度25～45 ℃區(qū)間內(nèi)，多糖提取率先升高然后逐漸降低，35 ℃時(shí)，平貝母多糖提取率達(dá)到最高（10.02%）。因此選取提取溫度30～40 ℃用于優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。在Design-Expert軟件分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。得到二次多項(xiàng)回歸方程：多糖提取率（Y）=9.678-0.210 833A+0.085B+0.032 5C-0.091 666 7D+1.332 5AB+1.512 5AC+0.077 5AD-0.407 5BC+0.135BD+0.727 5CD-1.289A2-1.332 75B2-1.299C2-0.812 75D2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3可得，該模型F=85.46，P＜0.000 1，表明模型極顯著。試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，響應(yīng)面回歸模型AB、AC、BC、CD、A2、B2、C2、D2項(xiàng)為極顯著差異項(xiàng)（P＜0.001），A項(xiàng)為顯著差異項(xiàng)（P＜0.01）。影響平貝母多糖提取率的排序是料液比（A）＞提取溫度（D）＞超聲功率（B）＞超聲時(shí)間（C）。模型決定系數(shù)R2等于0.988 4，表明回歸模型顯著性很高，而Radj2等于0.976 9，可以解釋試驗(yàn)響應(yīng)值在97.69水平上的變異情況，并且它與預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)Rpred2=0.941 6的數(shù)值也較為相近，表明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)真實(shí)數(shù)據(jù)有較好的擬合程度，對(duì)實(shí)際工作有一定的指導(dǎo)意義，據(jù)此可利用該模型對(duì)多糖提取率的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。

表3 回歸方程方差分析

應(yīng)用Design-Expert軟件分析得到提取平貝母多糖的最佳提取工藝：料液比1∶29.112 mg/mL、超聲功率49.545 W、超聲時(shí)間14.408 min、提取溫度34.391 ℃，通過(guò)模型預(yù)測(cè)出的平貝母多糖提取率為9.789%。

在軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，考慮到實(shí)際工藝設(shè)定的可行性，將最佳工藝調(diào)整為料液比1∶29 mg/mL，超聲功率50 W、超聲時(shí)間14 min、提取溫度34 ℃，在此條件下，重復(fù)試驗(yàn)3次，多糖提取率均值達(dá)到9.70%±0.10%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相近，說(shuō)明基于響應(yīng)面模型的多糖提取率優(yōu)化工藝分析方法有效且可行。

2.3 紫外光譜分析

如圖5所示，平貝母多糖在200 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收峰，在260和280 nm波長(zhǎng)處有小的吸收峰，可能存在少量的核酸及蛋白質(zhì)[21]。

圖5 平貝母多糖的紫外光譜

2.4 單糖組成分析

用16種單糖標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，用離子色譜法測(cè)定平貝母多糖的單糖組成，單糖標(biāo)準(zhǔn)品和平貝母多糖的離子色譜圖如圖6和圖7所示。結(jié)果表明，平貝母多糖主要由Glc組成，含有少量Ara和Gal，摩爾比為99.3∶0.3∶0.4。

圖6 單糖的離子色譜圖

圖7 平貝母多糖的離子色譜圖

2.5 紅外光譜分析

如圖8所示：3 419.06 cm-1處吸收峰為O—H和N—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生[22]；2 926.83 cm-1處吸收峰由C—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生[23]；1 653.62 cm-1處吸收峰為多糖內(nèi)—CHO及—COOH基團(tuán)C＝O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，提示有糖醛酸存在；1 369.17 cm-1處吸收峰由C—H變角振動(dòng)產(chǎn)生[24]，1 155.40 cm-1和1 022.47 cm-1處有吸收峰為糖環(huán)的特征吸收峰，表明具有吡喃環(huán)特征結(jié)構(gòu)[25]，852.87 cm-1和761.39 cm-1處吸收峰為α-糖苷鍵的特征吸收[26]。綜上，平貝母多糖具有多糖的一般特征峰，具由α-糖苷鍵連接的吡喃環(huán)型多糖。

圖8 平貝母多糖的紅外光譜

2.6 平貝母多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH清除率檢測(cè)是一種靈敏、快速、簡(jiǎn)單的方法，被廣泛用于藥品和食品抗氧化能力評(píng)估[27]。由圖9可知，平貝母多糖質(zhì)量濃度在0.2～4.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增大逐漸增強(qiáng)，質(zhì)量濃度4.0 mg/mL時(shí)，其清除率為60.40%，達(dá)到最大值。平貝母多糖對(duì)DPPH自由基具有一定清除能力，表現(xiàn)出較好的體外抗氧化能力，但效果弱于VC。

圖9 平貝母多糖的對(duì)DPPH自由基清除作用

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化平貝母多糖超聲提取工藝，通過(guò)平貝母多糖對(duì)DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。得到最優(yōu)工藝：料液比1∶29 g/mL、超聲功率50 W、超聲時(shí)間14 min、提取溫度34 ℃。影響平貝母多糖提取率的排序是料液比＞提取溫度＞超聲功率＞超聲時(shí)間。在此工藝條件下，平貝母多糖提取率為9.70%。離子色譜測(cè)定平貝母多糖主要由Glc、Ara和Gal組成，摩爾比99.3∶0.3∶0.4。平貝母多糖對(duì)DPPH自由基具有一定清除能力，質(zhì)量濃度4 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到最大值60.40%。試驗(yàn)結(jié)果為平貝母多糖研究及其開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。