基于分子信標(biāo)技術(shù)的肉類食品動(dòng)物源性成分多重篩檢方法

承 海，朱洪亮，姚振明，毛玲燕，張勝男，王慧君，邢家溧*

（1 寧波市產(chǎn)品食品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院（寧波市纖維檢驗(yàn)所） 浙江寧波 315408 2 嘉興市食品藥品與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院 浙江嘉興 330400）

畜禽肉及其制品因風(fēng)味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，一直以來(lái)都是居民日常膳食構(gòu)成中重要的食品品類之一，故其食品安全對(duì)保障消費(fèi)者健康權(quán)益具有重要意義。受疫情及畜牧業(yè)產(chǎn)能下滑等因素的綜合影響，近年來(lái)生鮮畜禽肉價(jià)格持續(xù)上漲，各類肉制品生產(chǎn)成本顯著增高，隨之而來(lái)的是肉類食品摻雜制假風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)增高，與之相關(guān)的重大食品安全事件近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外屢有報(bào)道[1-2]。這種違法制銷行為對(duì)消費(fèi)者造成經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)，來(lái)源不明的肉類原料也難以避免地帶來(lái)了食品安全風(fēng)險(xiǎn)隱患。肉類食品尤其是深加工產(chǎn)品在色、香、味、形及口感等性狀方面極為相近，難以用感官鑒定方法直接區(qū)分其源性成分。食品源性成分鑒定是對(duì)造假行為進(jìn)行高效靶向監(jiān)管的基礎(chǔ)支撐，也是食品安全檢測(cè)技術(shù)研發(fā)的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。為此，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局在 《假冒偽劣重點(diǎn)領(lǐng)域治理工作方案（2019-2021）》中明確強(qiáng)調(diào)，要“加大對(duì)食品摻假摻雜、非法添加等檢驗(yàn)方法的研制力度，切實(shí)筑牢打擊假劣食品的技術(shù)防線，為遏制食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)潛規(guī)則提供技術(shù)手段，有效防范系統(tǒng)性風(fēng)險(xiǎn)”。探索高效便捷、靈敏特異的肉類食品源性成分多重鑒定方法，是食品質(zhì)量安全檢測(cè)領(lǐng)域持續(xù)關(guān)注的研究方向。

當(dāng)前，關(guān)于動(dòng)物源性成分鑒定方法已有諸多報(bào)道，主要通過(guò)檢測(cè)具有種屬特異性的生物標(biāo)志物（蛋白質(zhì)或基因），從而達(dá)到鑒定和區(qū)分樣品種屬來(lái)源的目的[3]。相對(duì)于蛋白質(zhì)檢測(cè)而言，基因檢測(cè)以其靶分子具有更好的穩(wěn)定性、多樣性，在同一個(gè)體中不存在組織間表達(dá)差異性，同時(shí)，依靠PCR技術(shù)對(duì)微量靶分子的指數(shù)擴(kuò)增，大幅度提升了檢測(cè)方法的靈敏度和特異性，因此成為當(dāng)前動(dòng)物源性成分鑒定方法中最常用的檢測(cè)技術(shù)。目前我國(guó)已頒布實(shí)施的食品安全標(biāo)準(zhǔn)中也建立了基于探針雜交技術(shù)或測(cè)序技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。然而，值得關(guān)注的是，常用的鑒別方法多采用“一對(duì)一”檢測(cè)模式，即針對(duì)一種動(dòng)物種屬，設(shè)計(jì)和使用一套特異性引物和探針。為達(dá)到多重鑒定目的，往往需進(jìn)行多次試驗(yàn)或采用多重體系的檢測(cè)方法，檢測(cè)體系組成復(fù)雜，鑒定成本高?；蛐酒瑱z測(cè)雖可以達(dá)到預(yù)期鑒定效果，但是目前還未在食品檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng)域廣泛普及應(yīng)用。分子信標(biāo)是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理設(shè)計(jì)的雙標(biāo)簽基因檢測(cè)探針，通過(guò)獨(dú)特的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，當(dāng)與靶基因雜交時(shí)可通過(guò)熒光檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)模板的定性鑒定及定量分析[4]，具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，由于其獨(dú)特的技術(shù)原理，可通過(guò)熔解曲線分析區(qū)分雜交分子中基因錯(cuò)配情況，因此，也常被應(yīng)用于基因突變鑒別等分析[5-6]。

本研究以畜禽動(dòng)物基因組極為廣泛的多樣化和異質(zhì)性為基礎(chǔ)，通過(guò)多基因序列比對(duì)和篩選，設(shè)計(jì)和應(yīng)用1 對(duì)通用引物及1 根具有兼容“錯(cuò)配”能力的分子信標(biāo)探針，建立一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，適用于常見(jiàn)畜禽食用動(dòng)物源性成分鑒定的基因檢測(cè)方法。該方法體系簡(jiǎn)單、成本低廉、快速高效，為拓展動(dòng)物食品源性成分鑒定技術(shù)，提高食品真?zhèn)魏Y查效能提供技術(shù)思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

食品基因組提取試劑盒（EasyPure Food and Fodder Security Genomic DNA Kit）、克隆載體（pEASY-T1 Cloning Kit）、質(zhì)粒提取試劑盒（EasyPure Plasmid MiniPrep Kit）、探針?lè)╭PCR檢測(cè)試劑（PerfectStart II Probe qPCR SuperMix），全式金公司（北京）；高保真聚合酶試劑（Premix Taq）、探針?lè)╭PCR 檢測(cè)試劑（Premix Ex Taq），Takara 公司（北京）；引物及探針委托上海捷瑞公司合成，測(cè)序委托上海桑尼公司完成。

AB ViiATM7 熒光定量PCR 儀、ProFlex PCR儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司；GelDoc-It 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP 公司；MaestroNano 微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)MaestroGen 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集及鑒定 生鮮畜禽肉類標(biāo)準(zhǔn)樣品（包括豬、牛、羊、驢、雞、鴨）及其肉制品采購(gòu)自本地大型商超，馬、駱駝、狗標(biāo)準(zhǔn)樣品由本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。全部樣品采用《常見(jiàn)畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR 法》（GB/T 38164-2019）等標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增序列經(jīng)NCBI BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）在線序列比對(duì)分析，確定各樣品種屬來(lái)源。

1.2.2 通用引物及分子信標(biāo)設(shè)計(jì) 線粒體基因組具有高拷貝數(shù)、高異質(zhì)性、受食品加工工藝影響較小、易于檢測(cè)等特點(diǎn)，是物種鑒定常選用的靶基因之一[7]。根據(jù)本研究設(shè)計(jì)思路，按照目的基因片段兩端序列在種屬間保守（引物結(jié)合區(qū)）、中段序列在各種屬間高度異質(zhì)（探針雜交區(qū)）的結(jié)構(gòu)需求，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)篩選在各種屬間進(jìn)化速率適中的靶基因片段序列。各類畜禽肉標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)形態(tài)學(xué)及基因鑒定等方法確定種屬來(lái)源后，從Genbank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）中 選擇相應(yīng)種屬線粒體參考序列，包括：豬（Sus scrofa）NC012095、牛（Bos taurus）NC006853、山 羊（Capra hircus）NC005044、驢（Equus asinus）NC001788、狗（Canis lupus familiaris）NC002008、雞（Gallus gallus）NC001323、鴨（Anas platyrhynchos）EU755252、馬（Equus caballus）NC001640、駱駝（Camelus bactrianus）NC009628。

針對(duì)檢測(cè)靶區(qū)兩端保守序列，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物，經(jīng)BLAST 比對(duì)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast），擇優(yōu)選擇一對(duì)適用于各種屬靶基因片段擴(kuò)增及分子信標(biāo)熒光檢測(cè)的高特異性通用型引物。既往研究表明，較長(zhǎng)環(huán)部序列的分子信標(biāo)對(duì)靶基因異質(zhì)性具有更好的“兼容性”，由于錯(cuò)配核苷酸在種類、數(shù)量及位置的差異，可通過(guò)雜交分子熔解溫度的差異，區(qū)分存在異質(zhì)性的靶基因[8-9]。根據(jù)各類參考基因序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)分子信標(biāo)探針，應(yīng)用Mfold 程序（http：//www.unafold.org/mfold/applications/dna -folding -form.php）在線分析探針構(gòu)象，應(yīng)用UNAFold 程序（http：//www.unafold.org/hybrid2.php）在線分析探針與靶基因雜交特性并預(yù)測(cè)雜交分子熔解溫度（Tm）[10]，由此擇優(yōu)選擇適用于目標(biāo)基因鑒定的分子信標(biāo)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)DNA 載體構(gòu)建及鑒定 各類畜禽肉標(biāo)準(zhǔn)樣品的新鮮肌肉組織經(jīng)磁珠研磨均質(zhì)后，取100 mg 均質(zhì)樣品，采用基于改良CTAB 裂解法的基因組提取試劑盒提取DNA，取1 μL 模板基因組，使用所設(shè)計(jì)通用引物對(duì)和Premix Taq 高保真擴(kuò)增體系，采用三步法反應(yīng)條件擴(kuò)增目的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后，回收244 bp 目的片段，采用T-A 克隆法構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑取藍(lán)色陽(yáng)性克隆，使用M13 通用引物對(duì)進(jìn)行PCR 篩選及測(cè)序鑒定。提取成功克隆標(biāo)準(zhǔn)基因片段的重組載體，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè)及熔解曲線分析 以重組載體為模板，使用商品化探針qPCR 預(yù)混體系檢測(cè)分子信標(biāo)MB-P 對(duì)各類標(biāo)準(zhǔn)基因的鑒別能力。20 μL 反應(yīng)體系為：2×qPCR 預(yù)混夜10 μL，上、下游通用引物FP 和RP 終濃度0.2 μmol/L，探針MBP 濃度0.1 μmol/L，50×ROX 參比染料0.2 μL。RTPCR 及熔解曲線反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s、50 ℃復(fù)性20 s 并檢測(cè)熒光值、72 ℃延伸10 s，共45 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增程序結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，將反應(yīng)體系升溫至95 ℃變性1 min，降溫至40 ℃雜交5 min，隨后以每步0.2 ℃升溫速率緩慢遞增至80 ℃，同步采集熒光。應(yīng)用系統(tǒng)自帶程序?qū)晒庾兓闆r進(jìn)行分析，繪制熔解曲線，確定探針與各標(biāo)準(zhǔn)基因雜交分子的特征Tm。

1.2.5 靈敏度與特異性分析 10 倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)基因載體至濃度為109～102copies/μL，取1 μL標(biāo)準(zhǔn)基因稀釋液為模板，采用上述建立的反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，分析各模板濃度下熒光定量PCR 反應(yīng)的Ct 值及熔解溫度，綜合考察所建立分子信標(biāo)鑒定方法的靈敏度和特異性。

1.2.6 實(shí)樣檢測(cè) 取生鮮畜禽肉及不同加工工藝生產(chǎn)的肉制品，磁珠研磨均質(zhì)后采用試劑盒法提取基因組，用滅菌水稀釋至10 ng/μL，應(yīng)用《常見(jiàn)畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR 法》（GB/T 38164-2019）及本研究所建立檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定，考察分子信標(biāo)檢測(cè)方法對(duì)不同種類肉制品的鑒定能力。此外，以豬基因組提取物為基礎(chǔ)，按照1∶100、1 ∶10 和1 ∶1 比例摻入其它動(dòng)物基因組制成混合基因模板，采用所建立方法進(jìn)行檢測(cè)，考察本方法對(duì)混合樣品的鑒別能力。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物及探針設(shè)計(jì)

按照本研究設(shè)計(jì)思路，靶基因的特定結(jié)構(gòu)是實(shí)現(xiàn)通用型分子信標(biāo)多重鑒定功能的基礎(chǔ)。經(jīng)各種屬動(dòng)物線粒體基因組參考序列比對(duì)分析，篩選出16S rDNA 基因中一段224 bp 序列為目標(biāo)序列。以該片段兩端保守序列及中段高異質(zhì)序列為模板，分別設(shè)計(jì)通用型引物及分子信標(biāo)（見(jiàn)表1）。探針經(jīng)構(gòu)象分析符合設(shè)計(jì)要求，與各種屬動(dòng)物參考序列間存在0～10 個(gè)堿基錯(cuò)配，經(jīng)雜交性狀分析，各類雜交產(chǎn)物預(yù)測(cè)熔解溫度（Tm）在59.1～68.3℃區(qū)間（見(jiàn)表2），且任意兩者間差值高于1 ℃，理論上滿足鑒別需求[11]。

表1 基于16S rDNA 基因設(shè)計(jì)的通用引物及分子信標(biāo)序列設(shè)計(jì)Table 1 The sequence of universal primers and molecular beacon probe based on 16s rDNA

表2 各類源性標(biāo)準(zhǔn)DNA 模板序列及雜交分子Tm 檢測(cè)結(jié)果Table 2 Oligonucleotide sequences of molecular plasmid DNA standard and the results of Tm detection

2.2 標(biāo)準(zhǔn)DNA 樣品構(gòu)建及檢測(cè)

應(yīng)用通用型引物分別擴(kuò)增9 種畜禽動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)樣品基因組，擴(kuò)增產(chǎn)物采用電泳及測(cè)序鑒定，結(jié)果可見(jiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，測(cè)序結(jié)果與參考基因完全一致，表明基于參考序列設(shè)計(jì)的通用型檢測(cè)體系對(duì)不同種屬來(lái)源的基因組均具有良好的特異性，滿足樣品檢測(cè)和鑒定的需求。

以10 ng 克隆入各類動(dòng)物靶區(qū)片段的標(biāo)準(zhǔn)DNA 重組載體為模板，應(yīng)用商品化探針型RTPCR 檢測(cè)體系及方法進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，結(jié)果顯示，基于通用型分子信標(biāo)的RT-PCR 檢測(cè)，各標(biāo)準(zhǔn)DNA 均形成良好的擴(kuò)增曲線。熔解曲線分析可見(jiàn)，各標(biāo)準(zhǔn)DNA 雜交分子均形成獨(dú)立的熔解峰（見(jiàn)圖1），實(shí)測(cè)Tm 值雖與預(yù)測(cè)值存在一定的差異（見(jiàn)表2），但滿足普通RT-PCR 檢測(cè)儀的分辨能力。

圖1 畜禽肉樣品通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR results of animal gene templates with a universal pair of primers

圖2 標(biāo)準(zhǔn)DNA 模板熔解曲線（B）分析結(jié)果Fig.2 Melting curves in real-time PCR assay applying the molecular plasmid DNA standards from different species of animal samples

圖3 標(biāo)準(zhǔn)DNA 梯度稀釋模板擴(kuò)增曲線（a）及熔解曲線（b）分析結(jié)果Fig.3 Amplification curves（a）and melting curves（b）in real-time PCR assay applying the molecular plasmid DNA standards with serial dilutions

2.3 靈敏度及特異性分析

應(yīng)用一致的反應(yīng)條件檢測(cè)10 倍梯度稀釋的豬標(biāo)準(zhǔn)DNA 模板，考察所建立方法的靈敏度及特異性，結(jié)果可見(jiàn)，在101～108copies/μL 模板濃度下，RT-PCR 反應(yīng)擴(kuò)增曲線良好，Ct 值在15～35 區(qū)間，與模板起始濃度呈良好的線性關(guān)系（R2=0.99），提示分子信標(biāo)探針具有良好的檢測(cè)靈敏度。經(jīng)熔解曲線分析可見(jiàn)，隨著模板濃度的降低，熔解峰高逐步下降，但各濃度模板對(duì)應(yīng)的Tm值聚集在（68.0±0.1）℃，表明在不同模板濃度下，雜交分子熔解溫度的檢測(cè)結(jié)果保持良好的穩(wěn)定性，由此提示，MB-P 探針熔解曲線分析的精密度能夠保證有效區(qū)分各類源性基因Tm間的差異性。

2.4 食品樣品檢測(cè)

食品深度加工工藝可造成食材中DNA 的斷裂和降解，影響基因檢測(cè)效能[12]。應(yīng)用所建立反應(yīng)條件檢測(cè)生鮮肉及肉制品DNA 提取樣品，分析結(jié)果見(jiàn)圖4，可見(jiàn)在相同檢測(cè)條件下，各類豬肉制品基因樣品均有效擴(kuò)增，所形成熔解峰對(duì)應(yīng)Tm值不存在顯著差異（見(jiàn)圖4），表明所建立分子信標(biāo)方法適用于常見(jiàn)畜禽肉類食品的檢測(cè)和鑒定。

圖4 豬肉加工食品熔解曲線分析結(jié)果Fig.4 Melting curves assay applying the genomic DNA isolated from different food products

2.5 混合樣品檢測(cè)

將豬和雞兩種動(dòng)物的基因組提取物按比例制成混合樣品，經(jīng)檢測(cè)可見(jiàn)，兩類源性基因模板均形成獨(dú)立的特征熔解峰，對(duì)應(yīng)的Tm與其源性基因檢測(cè)結(jié)果相一致。隨著雞源性基因比例的增加，其熔解峰相應(yīng)增高（見(jiàn)圖5）。對(duì)特征熔解溫度相近的不同源性基因混合樣品進(jìn)行檢測(cè)，未見(jiàn)各源性基因成分形成獨(dú)立的熔解峰，而在混合基因特征Tm間的區(qū)域內(nèi)形成新的融合峰，且融合峰向起始模板濃度占優(yōu)的源性基因偏移，此結(jié)果可能與長(zhǎng)鏈探針高容錯(cuò)能力對(duì)混合雜交分子熱動(dòng)力學(xué)的綜合影響以及檢測(cè)設(shè)備分辨率相關(guān)。以上結(jié)果表明，應(yīng)用所建立檢測(cè)體系可進(jìn)行肉類食品動(dòng)物源性成分篩查，通過(guò)熔解曲線分析中形成的特征性熔解峰或熔解峰偏移現(xiàn)象，指示樣品中可能存在異源性基因，為進(jìn)一步開(kāi)展確證鑒定檢測(cè)提供指征。

圖5 混合畜禽肉樣品熔解曲線分析結(jié)果Fig.5 Melting curves assay applying the genomic DNA isolated from mix sample

3 結(jié)論

區(qū)別于Taqman 探針，分子信標(biāo)技術(shù)既能夠?qū)Π蟹肿舆M(jìn)行特異性檢測(cè)，又能夠依靠特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行熔解曲線分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)突變基因的區(qū)分和鑒定。本研究針對(duì)常見(jiàn)畜禽動(dòng)物線粒體基因，設(shè)計(jì)和構(gòu)建基于通用型引物和長(zhǎng)鏈分子信標(biāo)的RTPCR 檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)不同種屬動(dòng)物靶基因雜交產(chǎn)物特征性Tm的檢測(cè)和區(qū)分，可實(shí)現(xiàn)豬、牛、羊、雞、鴨等多種常見(jiàn)畜禽肉類食品源性成分的鑒定，并可通過(guò)考察受檢樣品Tm 與參考值之間的偏移情況，為鑒定樣品是否存在摻雜提供指示。通用型檢測(cè)體系的應(yīng)用，在提供多重檢測(cè)能力的同時(shí)，簡(jiǎn)化了體系組成，避免了常規(guī)多重檢測(cè)體系中多重引物及探針體系內(nèi)部的相互干擾，靈敏度高、特異性好，檢測(cè)成本相對(duì)低廉，適用性好，方法可靠，為更好的開(kāi)展肉類食品摻假問(wèn)題的篩查鑒別提供了良好的技術(shù)支撐。