香葉醇及其糖苷在茶樹中的積累和對紅茶香氣的貢獻

周漢琛，楊霽虹，劉亞芹，王 輝，雷攀登

（安徽省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所 安徽黃山 245000）

茶葉香氣是評價茶葉品質的重要指標之一，目前在各茶類中已鑒定出約700 多種揮發(fā)性物質[1]。其中，萜類化合物是茶葉中一類重要的呈香物質[2]，尤其是單萜、倍半萜類等揮發(fā)性化合物對茶葉香氣品質有著重要貢獻[1]。它們大多具有花果香及較低的香氣閾值，容易被人類嗅覺感知，比如香葉醇、芳樟醇、橙花叔醇等。香葉醇和芳樟醇作為單萜類香氣物質在各類茶葉中普遍含量較高，橙花叔醇對烏龍茶花果香的形成具有重要貢獻[3]。

香葉醇具有典型的玫瑰花香，在紅茶、綠茶產(chǎn)品中含量豐富。Wang 等[4]研究表明香葉醇是祁門紅茶中含量最高的萜烯類化合物。日本的Takeo研究表明，茶樹品種（C.sinensis var.sinensis）鮮葉中香葉醇含量顯著高于茶樹品種（C.sinensis var.assamica），后者中的芳樟醇含量則較高[5-6]。Kang等[7]研究顯示，祁門紅茶中的香葉醇相對含量（6.89%）顯著高于大吉嶺紅茶（4.28%）、錫蘭紅茶（0.5%）及阿薩姆紅茶（0.32%），這表明香葉醇對祁門紅茶的特征香氣形成具有重要貢獻[7]。此外，關于太平猴魁、龍井綠茶、滇紅紅茶的研究顯示，香葉醇對各類茶的香氣品質形成同樣具有重要貢獻[8-11]。

在茶樹中，香葉醇主要以糖苷態(tài)儲存于細胞中，且主要以櫻草糖苷形式儲存，還有一部分以葡萄糖苷態(tài)儲存[12]。這類萜類糖苷物質作為茶葉香氣前體，在茶葉加工過程中由葡萄糖苷酶、櫻草糖苷酶等水解酶催化并釋放出苷元物質[12]。研究顯示茶樹中香葉醇的生物合成受季節(jié)變化以及機械損傷的影響[4-6]。此外，研究表明香葉醇糖苷含量隨季節(jié)的變化波動較大，春季含量最高，香葉醇糖苷為47.5（峰面積之比），夏季次之（26.6），而秋季最低（13.3）[4]。香葉醇糖苷含量在不同葉片發(fā)育狀態(tài)下也表現(xiàn)出不一致，其中幼嫩葉片中含量最高，表現(xiàn)出幼嫩葉片＞莖＞成熟葉片＞枝條[12]。

香葉醇作為重要的茶香物質，深入研究其在茶樹中的積累特性及對茶葉香氣的貢獻，能夠促進后續(xù)系統(tǒng)研究茶葉香氣形成機制。本研究對不同茶樹品種、不同茶樹器官、不同時間的香葉醇積累特性進行分析，同時對不同茶樹品種鮮葉加工的紅茶及加工過程中香葉醇的變化進行研究，旨在為后續(xù)研究香葉醇對茶葉香氣品質的貢獻提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中供試茶樹品種（C.sinensis var.sinensis）“鳧早2 號”（FZ2）、“舒茶早”（SCZ）、“皖茶91”（WC91）、“中茶108”（ZC108）、“浙農(nóng)117”（ZN117）、“皖茶4 號”（WC4）、“櫧葉種”（ZYZ）取材于安徽省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所；供試阿薩姆變 種（C.sinensis var.assamica）“勐庫大葉”（MKDY）、“清水3 號”（QS3）、“紫鵑”（ZJ）、“云抗14”（YK14）、“云抗37”（YK37）、“云抗43”（YK43）取材于云南省農(nóng)科院茶葉研究所；祁門紅茶加工過程樣（鮮葉、萎凋葉、揉捻葉、不同發(fā)酵時間葉）取材于安徽省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所；茶樹品種“舒茶早”第一葉、第二葉、第三葉及莖取材于5 月份，花、根等器官取材于9 月份；不同月份取樣均在每月份的下旬。

試驗中所用標準品香葉醇購買于Sigma 公司；香葉基櫻草糖苷委托山東大學國家糖工程技術研究中心合成。

1.2 儀器與設備

本試驗中香葉醇含量分析使用氣相色譜質譜聯(lián)用儀Agilent 7697A-7890A（美國Agilent 公司）；香葉基櫻草糖苷分析使用液相-四級桿-飛行時間質譜儀Agilent 1290-Agilent 6545 LC/QTOF（美國Agilent 公司）。

1.3 香葉醇提取方法

參考文獻中方法[13-14]，采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS -SPME）對樣品中的揮發(fā)性物質進行吸附。紅茶中的揮發(fā)性物質提取方法為：準確稱取0.2 g 茶粉末，加入10 mL 沸水（茶水比1∶50），于70 ℃水浴平衡5 min 后，利用65 μmol/L PDMS/DVB SPME萃取頭（美國Supelco 公司）于70 ℃水浴吸附30 min，后用于GC-MS 分析。

鮮葉樣揮發(fā)物提取時，利用液氮將鮮葉研磨粉碎后稱取0.2 g，加入5 mL 超純水，于70 ℃水浴平衡5 min 后，利用65 μmol/L PDMS/DVB SPME 萃取頭于70 ℃水浴吸附30 min，后用于GC-MS 分析。

1.4 GC-MS 分析、香葉醇鑒定及定量

氣相質譜聯(lián)用儀Agilent 7697A-7890A 用于本研究中揮發(fā)性物質分析，其中氣相色譜柱為DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm；美國Agilent 公司），氣相不分流，流速為1.0 mL/min，載氣為氦氣，色譜柱升溫程序為：初始溫度50 ℃，保持1 min；以10 ℃/min 速率上升到100 ℃，并保持1 min；后以4 ℃/min 速率上升到200 ℃，并保持1 min；以16 ℃/min 速率上升到280 ℃，并保持7 min。

香葉醇鑒定依據(jù)NIST 數(shù)據(jù)庫、化合物保留指數(shù)（retention indices，RI）及標準品。香葉醇定量方法為使用標準品定量，準確吸取1 μL 300 μg/mL 香葉醇標準品加入5 mL 或10 mL 超純水，于70 ℃水浴平衡5 min 后，利用相同SPME 萃取頭于70 ℃水浴吸附30 min 后上機分析。香葉醇含量計算方式為：利用樣品中峰面積與標準品峰面積之比計算含量，其中紅茶樣品中香葉醇含量表示為μg/L，鮮葉中香葉醇含量表示為μg/g（鮮重，fresh weight，F(xiàn)W）。

1.5 香葉基櫻草糖苷提取

利用液氮將鮮葉樣品、紅茶加工過程樣研磨粉粹，準確稱取0.100 g，并立即加入750 μL 預冷的含0.1%甲酸的甲醇，充分振蕩15 s 后超聲15 min，后在10 000 r/min 下離心10 min，取上清液稀釋10 倍后，采用0.22 μm 有機系濾膜過濾，并用于液相質譜分析。

1.6 UPLC/Q-TOF 分析

Agilent 1290 超高效液相色譜儀結合Agilent 6545 LC/Q-TOF 四級桿-飛行時間質譜儀用于樣品中的香葉基櫻草糖苷分析；色譜柱為Zorbax revese-phase 柱（RRHD SB-C18 3×150 mm，1.8 μm）。離子源為Dual ESI，A 相洗脫液為含0.1%甲酸的蒸餾水，B 相洗脫液為含0.1%甲酸的乙腈。LC-MS/MS 運行時洗脫總時間為35 min：首先5% B 保持8 min；后10 min 內(nèi)B 相梯度由5%上升到45%；5 min 內(nèi)B 相梯度從45%上升到65%，并保持4 min；3 min 內(nèi)B 相梯度從65%下降到40%；3 min 內(nèi)B 相梯度從40%下降到5%，并保持2 min。流速始終為0.4 mL/min，樣品進樣量為2 μL，色譜柱溫度設為35 ℃。MS 采集率為1 spectra/s，采集范圍設為100～700。Auto 模式下MS/MS采集率為2 spectra/s。離子源碰撞能量為25 和35 eV 兩種。

本研究中樣品在負離子模式下運行，負離子模式下香葉基櫻草糖苷提取母離子（m/z）為493.22。本試驗條件下，香葉基櫻草糖苷出峰時間約為17.6 min。采用Agilent Masshunter（B.07.00版本）和Agilent 定量軟件Qualitative Analysis（B.07.00 版本）進行化合物的分析。樣品中香葉基櫻草糖苷通過標準品MS/MS 峰圖進行鑒定，并通過與標準品峰面積之比進行化合物的定量，含量表示為μg/g（FW）。

1.7 香葉醇生物合成候選基因篩選與功能分析

利用開放網(wǎng)站TPIA（http：//tpdb.shengxin.ren/）獲得“舒茶早”二代基因組組裝數(shù)據(jù)。依據(jù)Xia 等[15]研究結果顯示，二代基因組CSS2.0 中共有72 個候選萜類合成酶基因。通過基因結構[16]、蛋白結構域解析（http：//pfam.xfam.org/）獲得具有全長功能的單萜類合成酶基因或雙功能萜類合成酶基因。

全長克隆候選基因，并與植物雙元表達載體PBI121 連接，以農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化體系瞬時過表達于本氏煙草葉片中，3 d 后收取葉片。其中以侵染緩沖液（MES 10 mmol/L，MgCl220 mmol/L，乙酰丁香酮200 μmol/L）處理葉片為陰性對照，瞬時過表達羅勒（Sweet Basil）香葉醇合成酶基因ObGES 葉片為陽性對照。將瞬時表達葉片液氮研磨后，稱取0.2 g，加入5 mL 超純水以及200 mg/mL AR2000（廣譜糖苷酶）于37 ℃水浴平衡20 min 后，利用65 μmol/L PDMS/DVB SPME 萃取頭于70 ℃水浴吸附30 min，后用于GC-MS 分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0 軟件對試驗樣品間的差異進行單因素方差分析（ANOVA），其中運算方法為最小顯著性差異法（LSD），以檢驗不同樣品間的顯著性（P＜0.05）。相關性分析利用GraphPad Prism9軟件（GraphPad，USA）完成。

2 結果與分析

2.1 香葉基櫻草糖苷在茶樹中的積累特性

香葉醇在茶樹中主要以糖苷態(tài)儲存在細胞中，且主要以櫻草糖苷型儲存，約占70%～78%[17]。為量化香葉醇積累差異，本研究分析了香葉基櫻草糖苷在不同茶樹品種間、茶樹不同組織器官中的含量變化。結果顯示6 個供試中國變種（C.sinensis var.sinensis）鮮葉中顯著積累更多的香葉基櫻草糖苷，分布范圍為1.4～3.3 μg/g，而6 個阿薩姆變種（C.sinensis var.assamica）葉片中香葉基櫻草糖苷的含量普遍較低，約為0.1～0.6 μg/g（圖1a）。在12 個供試茶樹品種中，茶樹品種WC4嫩梢中的香葉基櫻草糖苷含量最為豐富，其次為祁門櫧葉種ZYZ（圖1a）。

圖1 不同茶樹品種及“舒茶早”不同組織器官中香葉基櫻草糖苷積累變化Fig.1 The accumulation patterns of geraniol and its primeveroside in the fresh leaves of different tea cultivars and in the different tissues of the SCZ cultivar

以茶樹品種“舒茶早SCZ”為對象，分析了茶樹不同組織器官中香葉基櫻草糖苷含量變化。結果顯示，香葉基櫻草糖苷在第一葉中含量最高，為1.17 μg/g；在茶樹根部的含量最低，為0.02 μg/g（圖1b）；茶樹葉片幼嫩部位積累更多的香葉基櫻草糖苷，而在發(fā)育程度高的葉片中，香葉基櫻草糖苷含量較低。在茶樹花器官中，花瓣中的香葉基櫻草糖苷含量最低，約為0.07 μg/g，隨著茶花逐漸盛開，香葉基櫻草糖苷含量顯著下降（圖1b）。在茶樹不同組織器官中，香葉基櫻草糖苷含量變化總體為：葉＞花＞根。

2.2 不同月份中香葉醇積累特性

為探究不同月份下茶樹中香葉醇的積累特性，本研究分析了不同茶樹品種嫩梢在不同月份中的香葉醇含量。在所測4 個茶樹品種中，香葉醇均在3 月份嫩梢中的含量最為豐富（圖2）。尤其是茶樹品種WC4，在3 月份嫩梢中，香葉醇含量達到8.01 μg/g，而其在2 月份嫩梢中含量只有0.54 μg/g；與2 月份相比，3 月份WC4 嫩梢中香葉醇積累量約增加了15 倍，然后隨著月份增加，香葉醇含量逐漸降低；不同月份下，茶樹品種FZ2 和SCZ 嫩梢中香葉醇變化規(guī)律與茶樹品種WC4 基本相同，均在3 月份嫩梢中含量最高，而茶樹品種ZC108 在5 月份嫩梢中的香葉醇含量略高于4 月份中的含量（圖2）。在所測茶樹品種中，6、7、8 月份嫩梢中的香葉醇含量變化不大，基本持平（圖2）。

圖2 不同月份下茶樹鮮葉中香葉醇的含量變化Fig.2 The accumulation patterns of geraniol in the fresh leaves of different varieties in different months

2.3 香葉醇對紅茶香氣的貢獻分析

本研究分析了祁門紅茶加工進程中的萎凋葉、揉捻葉、不同時間發(fā)酵葉中香葉基櫻草糖苷的含量變化，結果顯示香葉基櫻草糖苷在萎凋進程中開始下降，在揉捻過程中劇烈減少，約減少了90%，隨著發(fā)酵進程延長，香葉醇櫻草糖苷進一步被水解，發(fā)酵完成時，只有鮮葉中的3.8%（圖3a），這與已有的報道結果相一致[18-19]。

圖3 香葉醇及其櫻草糖苷在祁門紅茶加工中不同品種紅茶中的含量及OAV 值Fig.3 The contents of geraniol and its primeveroside in the processing stage of Keemun black tea and the tea infusions of six black tea samples and the odor activity value of geraniol in six tea infusions

以黃山地區(qū)6 個茶樹品種紅茶為例（圖3b），氣相質譜分析結果顯示6 個品種紅茶中香葉醇豐度均較高，其中WC4 品種紅茶中的香葉醇豐度顯著高于其它品種紅茶（圖3b）。含量計算結果顯示W(wǎng)C4 品種紅茶茶湯中香葉醇含量最高，約為187.34 μg/L，其次為SCZ 紅茶茶湯，香葉醇含量為49.27 μg/L；櫧葉種ZYZ 紅茶茶湯中香葉醇含量為45.06 μg/L；WC91 紅茶茶湯中的香葉醇含量最低，為26.01 μg/L（圖3c）。

據(jù)文獻報道顯示，香葉醇在水中的閾值約為3.2～75 μg/L，不同研究中所用閾值有較大差異，常用的有3.2 μg/L[1]，40 μg/L[10]，75 μg/L[11]。根據(jù)L.J.van Gemert 新書中的標注，最近文章中的研究表明香葉醇閾值為6.6 μg/L[20]。因此，本研究中以閾值6.6 μg/L 計算了香葉醇在6 個紅茶茶湯中的香氣活性值（odor activity value，OAV）。結果表明，WC4 品種紅茶茶湯中香葉醇香氣活性值最高，為28.38，其次為SCZ 茶湯，為7.47（圖3d）。一般認為香氣化合物OAV 值＞1 是對茶湯香氣有貢獻[11]，而在本研究中的6 個紅茶茶湯中，香葉醇OAV 值均＞1，約為3.93～28.38，這表明香葉醇對紅茶香氣構成具有重要貢獻。

2.4 香葉醇生物合成相關萜類合成酶候選基因分析

基于二代基因組數(shù)據(jù)，顯示共有72 個候選茶樹萜類合成酶基因，通過與已發(fā)表并鑒定功能的萜類合成酶基因結構進行關聯(lián)分析，推測具有全長的單萜合成酶/雙功能萜類合成酶基因共有23個。本研究利用茶樹不同組織器官中香葉基櫻草糖苷的含量與各候選基因表達量進行Pearson 相關性分析（圖4a），結果顯示共有7 個萜類合成酶基因表達量與香葉基櫻草糖苷含量變化顯著相關，分別為CSS0012478（R=0.984），CSS0006343（R=0.865），CSS0007975（R=0.978），CSS0012706（R=0.979），CSS0013756（R=0.817），CSS0027229（R=0.820）和CSS0025755（R=0.984），其中CSS0012478、CSS0007975、CSS0012706 和 CSS00 25755 表達模式與香葉基櫻草糖苷含量變化達到極顯著相關（R＞0.9 且P＜0.01）。

圖4 茶樹中香葉醇生物合成萜類合成酶候選基因篩選與功能分析Fig.4 The identification of geraniol synthase candidate genes and the functional verification

通過全長克隆，將CSS0007975、CSS0012478和CSS0025755 瞬時過表達于本氏煙草葉片中，其中以侵染緩沖液瞬時表達葉片為陰性對照，以已鑒定功能的羅勒香葉醇合成酶ObGES 為陽性對照。結果顯示，與陰性對照相比，CSS0007975、CSS0012478 和CSS0025755 瞬時過表達本氏煙葉片中香葉醇豐度雖略有增加但未達到顯著水平，而瞬時過表達ObGES 本氏煙葉片中，香葉醇豐度顯著提升（圖4b）。

3 討論與結論

香葉醇在不同茶樹品種中的差異已經(jīng)多有報道[2，4-5]，且目前常以萜烯指數(shù)（芳樟醇+芳樟醇氧化物/芳樟醇+芳樟醇氧化物+香葉醇）來表明茶樹品種間香葉醇與芳樟醇積累的差異[5]。日本Takeo[5]的研究顯示，斯里蘭卡地區(qū)阿薩姆種（Assamica）茶樹變種萜烯指數(shù)可達到1；雜交變種約為0.2～0.7，而中國種（Sinensis）茶樹變種萜烯指數(shù)普遍較低，最低可達到0.07。Xia 等[15]的研究表明我國云南地區(qū)18 個常見栽培茶樹品種主要是阿薩姆種茶樹變種，與安徽、浙江地區(qū)栽培品種（系）差異較大。本研究中，6 個供試中國種茶樹變種為安徽、浙江地區(qū)選育及當?shù)卦耘嗥贩N，其香葉基櫻草糖苷含量顯著高于6 個供試阿薩姆種茶樹變種，這與茶樹變種的遺傳背景密切相關。Xia 等[15]的研究即表明，栽培品種在遺傳馴化中存在選擇性，兩個變種間共有的馴化基因只有206 個，而阿薩姆種茶樹變種獨有馴化基因為548 個，中國種茶樹變種獨有馴化基因538 個，這表明不同茶樹栽培品種（系）在遺傳馴化中逐漸產(chǎn)生差異，使得內(nèi)源次級代謝途徑改變，并導致代謝產(chǎn)物積累不同。

茶樹葉片中積累較多的香葉醇與萜類合成酶表達模式密切相關[21]。前期研究顯示，茶樹單萜類合成酶表達量在葉片中積累較高，而倍半萜類合成酶則在花中表達較高[21]。不同月份中，3 月份嫩梢中香葉醇積累更豐富，這與王華夫研究較一致[4]。隨著月份增加，光照增強、溫度升高，茶樹次級代謝受到調(diào)控，影響了香葉醇生物合成量。

本研究中顯示，祁門紅茶在加工揉捻階段，香葉基櫻草糖苷含量極顯著下降。已有的研究表明糖苷類物質可能主要儲藏在液泡中[22]，而櫻草糖苷酶基因已被證明定位于細胞壁中[23]。在鮮葉采摘后，水分充足，細胞形態(tài)完整，隨著萎調(diào)進程的增加，水分逐步散失，細胞透性增加[24]，部分香葉基糖苷水解并釋放出苷元；在紅茶加工揉捻階段，酶與底物充分接觸，結合態(tài)的香葉醇幾乎全部轉成游離態(tài)，進而對紅茶香氣產(chǎn)生貢獻。本研究中6個品種紅茶中香葉醇的香氣活性值均＞1，且最高達到約28。祁門紅茶的“祁門香”被認為具有濃郁的玫瑰花香、甜香等[25]，顯著有別于中國云南地區(qū)的滇紅紅茶，可能存在香葉醇貢獻率的差異。

本研究中，初步對香葉醇生物合成相關萜類合成酶基因進行了篩選與功能驗證，結果顯示與ObGES 過表達相比，3 個茶樹萜類合成酶候選基因合成香葉醇功能較弱且可能為假陽性，有待進一步分析。

綜上所述，香葉醇在茶樹葉片中富集，且以糖苷態(tài)儲存在細胞中，在紅茶加工過程的揉捻工序中，因細胞破碎水解釋放并對其香氣產(chǎn)生貢獻。不同月份下、不同茶樹品種中的香葉醇積累特性均有不同，推測這與香葉醇生物合成途徑受溫度、光照調(diào)控相關，以及存在遺傳背景的差異。本研究結果為后續(xù)研究香葉醇生物合成及調(diào)控機制提供了理論依據(jù)。