超高效液相色譜法檢測58 種大豆中的4 種嘌呤化合物

孫玉鳳，黃亞濤，劉佳萌，貫東艷，范 蓓，王鳳忠

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193）

大豆是豆科、蝶形花亞科、大豆屬植物，古代稱“菽”，在我國已有5 000 多年的栽培歷史。大豆在我國各地均有栽培，品種豐富，至今為止資源庫中已保有30 000 多個大豆種質(zhì)[1]。大豆富含多種營養(yǎng)物質(zhì)及功能因子，是我國重要的糧食、油料及飼料來源。大豆中同時(shí)存在天然毒素嘌呤化合物，它是一種含氮雜環(huán)類有機(jī)化合物，由鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤組成。嘌呤化合物代謝的最終產(chǎn)物為尿酸，由腸黏膜吸收進(jìn)入體液后隨尿液排出，人體中尿酸過高可誘發(fā)痛風(fēng)[2]。醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為痛風(fēng)病人不宜攝入大豆食品。一項(xiàng)對亞太地區(qū)的醫(yī)學(xué)工作者的調(diào)查顯示，48%的醫(yī)學(xué)工作者認(rèn)為攝入大豆會導(dǎo)致痛風(fēng)[3]。明確大豆中嘌呤化合物的含量，可為大豆加工及消費(fèi)提供科學(xué)指導(dǎo)。

目前研究人員采用多種前處理方法和檢測手段對嘌呤化合物進(jìn)行定量研究，嘌呤檢測中樣品前處理方法主要有酸解提取法、溶劑提取法、柱萃取、膜萃取、離子交換柱純化法和超聲提取法等[4]。常用的檢測方法為反相離子對色譜法[5]、高效液相色譜法[6-9]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10]等。在對大豆嘌呤化合物的檢測中，大多數(shù)只針對某一品種，尚未對多種大豆資源的嘌呤化合物進(jìn)行比較研究。本研究探討大豆中嘌呤化合物的色譜分離條件及提取條件，建立大豆中嘌呤化合物含量檢測的超高效液相色譜法，以完善我國不同大豆主栽品種的嘌呤化合物數(shù)據(jù)，為大豆加工的品種選用及合理膳食提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆樣品：58 種大豆樣品均由大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系試驗(yàn)站提供，樣品經(jīng)過粉碎機(jī)粉碎后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)品：腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤（色譜純，純度≥99.0%），上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇、甲酸、磷酸二氫鉀、磷酸、高氯酸、三氟乙酸（均為色譜純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸銨（色譜純），Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器及設(shè)備

超高效液相色譜儀（Acquity UPLC）、色譜柱（Acquity UPLCHSS T3）（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美國沃特世公司；電子分天平（MS105DU）、pH 計(jì)（Mettler Toledo），瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超純水系統(tǒng)（Milli-QAdvantageA10），香港力康生物醫(yī)療技術(shù)控股集團(tuán)；超聲波清洗器（KQ-600DE），昆山超聲儀器有限公司；恒溫水浴鍋（DK-8D 型），上海一恒科技有限公司；SHB-III 型循環(huán)水式真空抽濾裝置，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；氮吹儀（TTL-DC II 型），北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；0.22 μm 微孔濾膜，天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件的優(yōu)化

1.3.1.1 流動相的選擇 色譜柱為Acquity UPLCHSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相分別為0.02 mol/L 的磷酸二氫鉀（pH=3.40）和0.01 mol/L 的甲酸銨（pH=3.40），進(jìn)樣量1 μL，柱溫為30 ℃，流速為0.1 mL/min，檢測波長為254 nm，探究磷酸二氫鉀流動相和甲酸銨流動相對4 種嘌呤化合物的分離效果。

1.3.1.2 pH 值的選擇 確定流動相為0.01 mol/L甲酸銨后，分別設(shè)置pH=3.30，3.40，3.50，3.60 4個組，進(jìn)樣量1 μL，柱溫為30 ℃，流速為0.1 mL/min，檢測波長為254 nm，探究不同pH 值對4 種嘌呤化合物的分離效果。

1.3.2 嘌呤化合物提取條件的優(yōu)化

1.3.2.1 提取溶劑的選擇 選取以下兩種提取溶液，探究不同提取溶劑對4 種嘌呤化合物的提取效果。

A：三氟乙酸∶甲酸（V∶V=1∶1）混合溶液。

按以下步驟操作：準(zhǔn)確稱取冀豆16 號、冀黑豆1 號大豆粉末0.100 g，分別置于10 mL 玻璃試管中，向其中加入1 mL 水混勻，再加入1 mL 酸液，混勻后置于沸水浴水解30 min，立即冷卻，氮吹至體積約為0.5 mL，加水4 mL 后，用15 mol/L KOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至3.4，以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清定容至5 mL，過0.22 μm 微孔濾膜，備用。

B：6%高氯酸溶液。

按以下步驟操作：準(zhǔn)確稱取冀豆16、冀黑豆1號大豆粉末0.100 g，分別置于10 mL 玻璃試管中，向其中加入2 mL 6%高氯酸，混勻，沸水浴水解30 min，立即冷卻，用15 mol/L 氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 值至3.4，以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清定容至5 mL，過0.22 μm 微孔濾膜，備用。

1.3.2.2 水解時(shí)間的選擇 以冀豆16 號和冀黑豆1 號為對象，操作步驟同1.3.2.1 節(jié)A，沸水浴中水解時(shí)間分別調(diào)整為15，30，60 min，探究不同水解時(shí)間對4 種嘌呤化合物的提取效果。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 配制250 mg/L 鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，吸取各嘌呤單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL 于5 mL 容量瓶中，用純水定容至刻度，配制成50 mg/L 的混合中間液。準(zhǔn)確移取0.04，0.08，0.2，0.4，0.8，2 mL 混合中間液至6 個10 mL 棕色容量瓶，用超純水定容至刻度，配制為0.2，0.4，1.0，2.0，4.0，10 mg/L 的系列梯度溶液，過0.22 μm 微孔濾膜，用已確定的最佳色譜方法進(jìn)行超高效液相色譜分析。以峰面積（Y）及樣品質(zhì)量濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3 倍信噪比（S/N）所對應(yīng)的濃度為檢出限（LOD）。

1.3.4 方法性能研究

1.3.4.1 精密性檢驗(yàn) 按照1.3.3 節(jié)所述方法，選取一個濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品（4.0 mg/L）用已確定的最佳色譜方法連續(xù)進(jìn)樣5 次，分別對鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤的峰面積進(jìn)行測定，然后計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD）。

1.3.4.2 重復(fù)性檢驗(yàn) 選取冀豆16 大豆粉末樣品6 份，分別稱取0.100 g，按照確定的最佳嘌呤提取方法處理，將6 份處理的樣品進(jìn)行超高效液相色譜分析，色譜條件同1.3.1 節(jié)所述，根據(jù)測定量計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.4.3 加標(biāo)回收率檢驗(yàn) 分別稱取冀豆16 大豆粉末樣品12 份，每份0.100 g，按照確定的最佳嘌呤提取方法處理，將12 份處理的樣品進(jìn)行超高效液相色譜分析，色譜條件同1.3.1 節(jié)所述。之后，按每種嘌呤含量的0.5，1，2 倍加入嘌呤標(biāo)品，配制成低、中、高3 個濃度，上機(jī)檢測。每個樣品測定3 次，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.4.4 58 種大豆中4 種嘌呤化合物含量的測定準(zhǔn)確稱58 種大豆粉末0.100 g，按照確定的最佳嘌呤提取方法處理，將處理的樣品進(jìn)行超高效液相色譜分析，色譜條件同1.3.1 節(jié)所述，每個樣品測定3 次，分析58 種大豆樣品中嘌呤化合物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化的色譜條件

采用0.02 mol/L 磷酸二氫鉀（pH=3.40）和0.01 mol/L 甲酸銨（pH=3.40）分別作為流動相，探究流動相種類對4 種嘌呤化合物的分離效果。當(dāng)以0.02 mol/L 磷酸二氫鉀（pH=3.40）為流動相時(shí)，結(jié)果如圖1a 所示，無法分離4 種嘌呤化合物，鳥嘌呤與腺嘌呤出峰時(shí)間重疊。當(dāng)以0.01 mol/L 甲酸銨（pH=3.40）為流動相時(shí)，結(jié)果如圖1b 所示，4種嘌呤化合物都能得到較好的分離，峰形也比較好，沒有拖尾現(xiàn)象，因此，判定此流動相適合多組分嘌呤化合物的分離。

圖1 流動相的種類對4 種嘌呤分離效果的影響Fig.1 Influence of mobile phase types on purine separation effect of four kinds

采用pH 值分別為3.30，3.40，3.50，3.60 的0.01 mol/L 甲酸銨為流動相，探究不同pH 值對4種嘌呤化合物的分離效果，結(jié)果如圖2 所示。試驗(yàn)表明，流動相的pH 值對4 種嘌呤化合物的分離度和峰形均存在較大影響，流動相的pH 值過高或過低均不利于4 種嘌呤化合物的分離。當(dāng)pH值為3.30 時(shí)，鳥嘌呤和腺嘌呤分離度小于0（圖2a）。當(dāng)pH 值為3.40 時(shí)，鳥嘌呤和腺嘌呤分離度達(dá)到1.78（圖2b），分離度較好，4 種嘌呤分離度均符合要求。當(dāng)pH 值繼續(xù)升高達(dá)到3.50 時(shí)，黃嘌呤出現(xiàn)異峰（圖2c）。繼續(xù)調(diào)節(jié)pH 值至3.60 時(shí)，只分離出3 個峰，腺嘌呤和次黃嘌呤未被分開，合并成一個峰，且黃嘌呤峰形呈現(xiàn)前沿峰（圖2d）。綜上所述，本研究選用pH 值為3.40 的0.01 mol/L 甲酸銨溶液作為最佳流動相。

圖2 流動相pH 值對4 種嘌呤分離效果的影響Fig.2 Influence of pH value of mobile phase on the separation effect of four purines

2.2 優(yōu)化的嘌呤化合物提取條件

2.2.1 選擇的提取溶劑 嘌呤化合物在食物中主要以結(jié)合態(tài)形式存在，在測定嘌呤化合物含量時(shí)要將其水解成4 種游離嘌呤堿基再測定[11]。提取嘌呤的方法主要有酸解提取法、柱萃取、膜萃取法等，其中最常用的是酸解提取法，而酸解提取法中最常用的酸主要是高氯酸[12]和三氟乙酸甲酸混合溶液[13]兩種。不同酸解提取法對嘌呤含量測定的影響如何，至今少有報(bào)道。本研究選用三氟乙酸∶甲酸（V ∶V=1 ∶1）混合溶液及6%高氯酸溶液作為提取溶劑，分別對冀豆16 號和冀黑豆1 號進(jìn)行嘌呤化合物提取，并通過超高效液相色譜進(jìn)行測定，結(jié)果如表1 所示。

表1 不同提取溶劑測定結(jié)果（n=3）Table 1 Determination results of different extraction solvents（n=3）

由表1 可知，用三氟乙酸∶甲酸（V∶V=1∶1）混合溶液作為提取溶劑時(shí)，冀豆16 號和冀黑豆1 號中4 種嘌呤化合物含量測定值顯著高于6%高氯酸溶液提取組，其中，次黃嘌呤使用前者條件提取后的測定值是后者的4 倍以上，鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤使用前者條件提取后的測定值是后者的1.21～1.35 倍，總嘌呤使用前者條件提取后的測定值是后者的1.22～1.27 倍。雖然高氯酸水解法操作簡單、成本低，但是高濃度的高氯酸會降解嘌呤化合物，造成測定結(jié)果偏低[14]。三氟乙酸和甲酸易揮發(fā)，經(jīng)過氮吹后可除去大部分酸，降低樣液中鹽濃度，水解效果好，嘌呤損失小[12]。因此，本研究選擇三氟乙酸∶甲酸（V ∶V=1 ∶1）混合溶液作為最佳提取溶劑。

2.2.2 選擇的水解時(shí)間 在樣品前處理方法中，前人對嘌呤化合物的水解溫度做了大量研究，結(jié)果表明嘌呤化合物的最佳水解溫度為100 ℃[15-17]，在水解時(shí)間上，劉鎮(zhèn)等[15]選用30 min 水解釀造黃酒用糧食原料中的嘌呤，毛玉濤等[18]選用60 min水解豆?jié){中嘌呤。為確定嘌呤化合物最佳水解時(shí)間，本研究以冀豆16 號和冀黑豆1 號為對象，分別設(shè)置了15，30 和60 min 進(jìn)行水解處理，其它操作步驟按照1.3.1 節(jié)所述進(jìn)行，并通過超高效液相色譜進(jìn)行測定，結(jié)果如表2 所示。

表2 不同水解時(shí)間測定結(jié)果（n=3）Table 2 Determination results of different water bath times（n=3）

由表2 可知，水解時(shí)間為30 min 時(shí)，冀豆16號和冀黑豆1 號中4 種嘌呤化合物含量測定值顯著高于15 min 組和60 min 組，表明水解時(shí)間在15～60 min 之內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，樣品中鳥嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤的含量均隨水解時(shí)間的延長呈現(xiàn)低-高-低的趨勢，說明水解時(shí)間過短或過長都會對大豆中嘌化合物含量測定值產(chǎn)生影響。水解時(shí)間過短會導(dǎo)致嘌呤化合物從結(jié)合態(tài)向游離態(tài)轉(zhuǎn)化不徹底或未轉(zhuǎn)化，水解時(shí)間過長會引起游離態(tài)的嘌呤化合物發(fā)生降解，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。因此，本研究選擇30 min 作為嘌呤化合物最佳水解時(shí)間。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照確定的最佳超高效液相色譜條件，將配置好的嘌呤混合標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液檢測，以峰面積（Y）及樣品質(zhì)量濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系及檢出限結(jié)果見表3。4 種嘌呤化合物在0.2～10 mg/L 質(zhì)量濃度范圍線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均在0.9995 以上。檢出限在0.0412～0.1001 mg/L 之間，靈敏度較高，可以滿足試驗(yàn)的要求。

表3 嘌呤化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Table 3 Result of purine standard curve

2.4 方法性能研究

2.4.1 方法精密性 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表4，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.6000%，表明本研究建立的超高效液相色譜檢測方法精密度良好，重現(xiàn)性高，可應(yīng)用于樣品檢測。

表4 精密性結(jié)果Table 4 Result of precision

2.4.2 方法重復(fù)性 按照確定的最佳提取條件及色譜條件對冀豆16 大豆粉末樣品中的嘌呤化合物進(jìn)行提取和測定，結(jié)果顯示：鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.1103%，1.0728%，1.3762%，0.9457%，表明重復(fù)性較好。

2.4.3 加標(biāo)回收率 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表5，鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤平均回收率分別為96.6225%，100.1373%，93.4343%，92.5926%，說明采用本研究確定的最佳提取條件可有效保留嘌呤化合物，減少樣品中嘌呤化合物的損失。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 5 Recovery rates of samples with added specimen（n=3）

2.5 大豆樣品檢測結(jié)果與分析

按照確定的最佳提取條件及色譜條件，對我國不同主栽品種共計(jì)58 種大豆中嘌呤化合物進(jìn)行提取和測定，每種樣品平行測定3 次，結(jié)果見表6。

表6 大豆樣品中4 種嘌呤化合物的含量（mg/kg）Table 6 The contents of four kinds of purine in soybean samples（mg/kg）

由表6 可知，所有大豆樣品嘌呤含量中，鳥嘌呤含量最高，其次為腺嘌呤，黃嘌呤及次黃嘌呤在有的大豆品種未檢出，這與劉少林等[19]的研究結(jié)果一致。不同品種大豆中嘌呤含量差異較大，嘌呤含量在1 745.88～2 824.54 mg/kg 之間，高蛋白大豆品種中嘌呤含量高于2 300 mg/kg，其中冀豆23 嘌呤含量高達(dá)2 548.34 mg/kg；常規(guī)大豆品種中嘌呤含量在2 000～2 300 mg/kg 之間；高油、蛋脂雙高大豆品種中嘌呤含量低于2 000 mg/kg，其中中黃76嘌呤含量最低，為1 745.88 mg/kg；無腥大豆品種中嘌呤含量差異較大，綏無腥豆、五星1 號、五星2 號、五星3 號嘌呤含量分別為2 013.06，2 162.31，2 274.36，2 824.54 mg/kg。

Kaneko 等[8]測定了包括豆類及豆制品在內(nèi)的270 種食品中嘌呤含量，根據(jù)嘌呤含量將食品劃分為5 組，即極低組（＜500 mg/kg）、低組（500～1 000 mg/kg）、中組（1 000～2 000 mg/kg）、高組（2 000～3 000 mg/kg）、超高組（＞3 000 mg/kg），由此判斷，大豆介于嘌呤含量中組和高組。在明確大豆品種嘌呤含量的基礎(chǔ)上，選擇適當(dāng)類型的大豆品種，結(jié)合加工工藝[20-23]，可以更好地生產(chǎn)出適宜不同人群的大豆制品。

3 結(jié)論

超高效液相色譜法具有靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，本文建立了檢測大豆中4 種嘌呤化合物的超高效液相色譜法，選用Acquity UPLCHSS T3（2.1×100 mm，1.8 μm）為色譜柱，以00.01 mol/L pH 值為3.40 的甲酸銨溶液為流動相，流速為0.1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量1 μL，檢測波長為254 nm，檢測大豆中腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，此方法在線性范圍（0.2～10 mg/L）線性關(guān)系良好（R2＞0.9995），方法檢出限為0.0412～0.1001 mg/L，方法精密度RSD 小于0.6000%，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤RSD 值依次為1.1103%，1.0728%，1.376%，0.9457%。4 種嘌呤化合物加標(biāo)回收率在92.5926%～-100.1373%之間，適用于大豆中4 種嘌呤化合物的測定。本文還研究比較確定了理想的提取溶劑為三氟乙酸∶甲酸（V∶V=1∶1）混合溶液，理想的水解時(shí)間為30 min。應(yīng)用此方法測定的我國部分大豆主栽品種中嘌呤化合物含量數(shù)據(jù)顯示，不同大豆品種中嘌呤含量：高蛋白品種＞常規(guī)品種＞高油、蛋脂雙高品種，無腥大豆品種中嘌呤含量差異較大，該研究結(jié)論可為大豆加工及消費(fèi)提供科學(xué)指導(dǎo)。