基于Illumina 高通量測(cè)序分析相溫貯藏對(duì)黃花菜表面微生物的影響

張 鵬，劉英杰，賈曉昱，薛友林，李江闊*

（1 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所 天津 300384 2 國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津）農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300384 3 遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院 沈陽 110036）

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）又稱金針菜、檸檬萱草，是我國特有的藥食同源珍有蔬菜[1]。截至2020 年底，我國黃花菜種植面積占全球總面積約98%，是山西大同、甘肅慶陽、寧夏吳忠、陜西大荔等地區(qū)重要種植經(jīng)濟(jì)作物[2]。黃花菜味質(zhì)鮮美，肉質(zhì)厚，口感佳，營(yíng)養(yǎng)豐富，其所含的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪分別占到60%，15%，2%[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃花菜的次級(jí)代謝產(chǎn)物如多酚和黃酮具有抗抑郁、抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化和保肝功效[4]。它既是佐餐佳品又是藥用保健食品，深受人們的喜愛。尤其是種植地當(dāng)?shù)氐南M(fèi)者，喜歡吃新鮮的黃花菜，然而黃花菜不耐儲(chǔ)，保鮮期極短，久貯后表面會(huì)生絨毛，產(chǎn)生腐爛，在運(yùn)輸和貯藏中易霉變[5]。霉變會(huì)對(duì)黃花菜的產(chǎn)量和商業(yè)價(jià)值產(chǎn)生影響，同時(shí)霉菌會(huì)產(chǎn)生毒素，危害人體健康。弄清貯藏期間黃花菜表面的主要微生物，尋找相關(guān)抑制方法，對(duì)黃花菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展十分重要。

高通量技術(shù)作為一種非培養(yǎng)技術(shù)，在食品微生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的越來越多[6]。它可以檢測(cè)食品微生物的群落結(jié)構(gòu)，具有測(cè)序通量高、結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)[7]，在基因組測(cè)序、功能基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)等方面廣泛應(yīng)用[8-10]。目前，基于16S/18S/ITS 的二代高通量測(cè)序技術(shù)已較為普遍地應(yīng)用于果蔬微生物菌群的多樣性研究。Zhang 等[11]采集14 個(gè)地區(qū)的28 個(gè)核桃樣品，對(duì)細(xì)菌16S rRNA 的V4 區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序分析，研究細(xì)菌在核桃殼表面的分布，得到藍(lán)藻門是核桃殼表面主要致病菌。李婕等[12]分別運(yùn)用16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)和平板分離培養(yǎng)法探究雙孢蘑菇在貯藏溫度4 ℃的環(huán)境下，菇體表面細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)及其變化情況，結(jié)果顯示，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，菇體表面細(xì)菌菌群豐度逐漸增加，其中，主要致腐菌為假單胞菌（Pseudomonas spp）。然而，目前基于高通量技術(shù)對(duì)黃花菜表面微生物的研究較少，對(duì)引起黃花菜霉變的主要菌群尚不清楚。

本試驗(yàn)以微環(huán)境氣調(diào)箱為載體，將采收的黃花菜分組放入冰箱（4 ℃±1 ℃）、冷庫（0 ℃±0.5 ℃）及相溫環(huán)境（-0.5 ℃±0.1 ℃）中。在進(jìn)行品質(zhì)檢測(cè)的基礎(chǔ)上，通過對(duì)其表面真菌、細(xì)菌的宏基因組檢測(cè)，確定主要微生物種群，同時(shí)研究抑制黃花菜褐變與霉變的保鮮方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃花菜產(chǎn)自甘肅慶陽，采摘時(shí)挑選成熟度一致、無病蟲害、無機(jī)械損傷的黃花菜作為試驗(yàn)材料。

冰箱，無錫松下冷機(jī)有限公司；冷庫，國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津）；500 mL 蓄冷劑，河南迪賽爾商貿(mào)有限公司；59.5 L 精準(zhǔn)溫控保鮮箱，上海佳寰實(shí)業(yè)有限公司；7.4 L 微環(huán)境氣調(diào)箱，寧波國嘉農(nóng)產(chǎn)品保鮮包裝技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 挑選無褐變現(xiàn)象、無開花的黃花菜，裝入微環(huán)境氣調(diào)箱中，每箱容量為1 000 g（±5 g），共裝9 箱，分為3 組，每組3 箱。A 組：置于冰箱（4 ℃±1 ℃）貯藏；B 組：置于冷庫（0 ℃±0.5℃）貯藏；C 組：置于內(nèi)有16 個(gè)500 mL 蓄冷劑盒的精準(zhǔn)溫控保鮮箱中，放入冷庫貯藏，控制溫度在-0.5 ℃±0.1 ℃。7 d 后拍照，測(cè)定褐變率和腐敗率，并隨機(jī)選取約70 g 黃花菜果實(shí)用液氮進(jìn)行凍樣，放于超低溫（-80 ℃）冰箱留存?；鞓犹崛NA分別建庫，提取DNA 樣本。

1.2.1.1 褐變率測(cè)定 每組選取30 個(gè)黃花菜進(jìn)行褐變級(jí)別判定，以無褐變?yōu)? 級(jí)，褐變面積小于10%為1 級(jí)，10%至30%為2 級(jí)，大于30%為3級(jí)，按褐變率=∑（褐變級(jí)別×該級(jí)別根數(shù)）/（最大褐變級(jí)別×總根數(shù)）計(jì)算。

1.2.1.2 DNA 提取與PCR 擴(kuò)增 使用CTAB 法提取黃花菜樣本中DNA，用無菌水將DNA 樣本稀釋至1 ng/μL，以稀釋后的黃花菜表面微生物宏基因組DNA 為模板，使用高效高保真酶、PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 及帶Barcode 的特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.2.1.3 PCR 產(chǎn)物的混樣和純化 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，合格后進(jìn)行磁珠純化及等量混樣，再次電泳檢測(cè)后用膠回收試劑盒回收。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)處理 從下機(jī)數(shù)據(jù)中依據(jù)Barcode 序列和PCR 擴(kuò)增引物序列拆分出各組黃花菜表面微生物DNA 樣本數(shù)據(jù)，再用FLASH[13]拼接每個(gè)黃花菜DNA 樣本的reads 后得到原始黃花菜Tags 數(shù)據(jù)，之后再過濾處理[14]。根據(jù)Caporaso 等[15]的Tags 質(zhì)量控制流程進(jìn)一步處理數(shù)據(jù)，將原始黃花菜Tags 數(shù)據(jù)從第一個(gè)堿基數(shù)長(zhǎng)度值為3（閾值≤19）的堿基位點(diǎn)斷開，再過濾堿基長(zhǎng)度小于75%的黃花菜Tags 數(shù)據(jù)[16]，將得到的DNA 序列與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)，去除最終產(chǎn)生的嵌合體序列DNA[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 數(shù)據(jù)作圖 利用Excel 工作表進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

1.3.2 OTU 聚類和物種注釋 用Uparse 算法[18]以一致性為97%的原則將黃花菜表面微生物DNA樣本序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），利用Qiime 軟件中的blast 方法[19]與Unit數(shù)據(jù)庫[20]進(jìn)行微生物樣本的物種注釋分析，使用MUSCLE[21]軟件進(jìn)行黃花菜微生物DNA 的快速多序列比對(duì)。

1.3.3 樣本復(fù)雜度分析 用Qiime 軟件計(jì)算各項(xiàng)指數(shù)，R 軟件繪制各種曲線及分析Alpha 多樣性指數(shù)組間差異。

1.3.4 多樣本比較分析 做Metastats 分析時(shí)使用R 軟件，在得出p 值后，再針對(duì)p 值用Benjamini and Hochberg False Discovery Rate 方法進(jìn)行修正，最終得到q 值[22]。進(jìn)而用R 軟件繪制PCA 圖及分析Beta 多樣性指數(shù)組間差異。

2 結(jié)果分析

2.1 不同處理黃花菜感官圖片和褐變率分析

由圖1 可看出，7 d 時(shí)3 組黃花菜均出現(xiàn)了不同程度的褐變，A 組黃化褐變最為嚴(yán)重，個(gè)別出現(xiàn)微微開花現(xiàn)象，是3 組中感官品質(zhì)最差的，B 組相較于A 組褐變程度較輕，C 組少數(shù)黃花菜尖部出現(xiàn)褐變，部分未黃化，感官品質(zhì)優(yōu)秀，說明相溫貯藏在黃花菜感官品質(zhì)的保持方面效果最佳。

圖1 不同處理黃花菜7 d 的感官圖片F(xiàn)ig.1 Sensory pictures of 7 d of different treatments of daylily

圖2 顯示的是不同處理黃花菜7 d 時(shí)褐變率情況，A 組黃花菜的褐變率高于35%，與其它兩組差異顯著（P＜0.05），表明A 組黃花菜在貯藏期間感官品質(zhì)下降得最快，B 組和C 組則下降得較為緩慢，兩組褐變率均低于15%，說明冷庫貯藏和相溫貯藏對(duì)黃花菜貯藏期間感官品質(zhì)的保持發(fā)揮了有效作用，且褐變率與感官圖片相符。

圖2 不同處理黃花菜7 d 褐變率Fig.2 The browning rate of daylily in different treatments at 7 days

2.2 物種注釋

對(duì)Illumina NovaSeq 測(cè)序得到的有效數(shù)據(jù)如下：真菌樣本中，A、B、C 組黃花菜樣品平均測(cè)得232，236，238 條tags，3 組樣品過濾嵌合體后的有效百分比分別為70.91%，71.56%，73.14%。細(xì)菌樣本中，A、B、C 組黃花菜樣品平均測(cè)得413，406，406 條tags，3 組樣品過濾嵌合體后的有效百分比分別為70.05%，77.52%，74.29%。

稀釋曲線可以描述不同處理組黃花菜組內(nèi)表面微生物DNA 樣本多樣性。稀釋曲線是黃花菜表面DNA 測(cè)序數(shù)據(jù)量與對(duì)應(yīng)的微生物物種數(shù)的數(shù)據(jù)圖，數(shù)據(jù)量越合理，稀釋曲線則越趨向平坦，同時(shí)，同一測(cè)序深度中OTU 數(shù)越多，樣本多樣性越高。如圖3、圖4 所示，各組處理黃花菜的稀釋曲線隨著深度的增加趨向平坦，說明此次測(cè)序數(shù)據(jù)足夠反映黃花菜的微生物群落組成。真菌測(cè)序深度為60 000 時(shí)，OTU 數(shù)：B 組＞C 組＞A 組，說明B組黃花菜的表面真菌多樣性高于其它兩組，細(xì)菌測(cè)序深度為50 000 時(shí)，OUT 數(shù)：A 組＞C 組＞B 組，說明A 組黃花菜的表面細(xì)菌多樣性高于其它兩組，C 組黃花菜表面真菌及細(xì)菌多樣性均為最低，證明相溫貯藏可以有效抑制黃花菜真菌及細(xì)菌的生長(zhǎng)，抑制其多樣性。

圖3 不同處理黃花菜真菌稀釋曲線和等級(jí)聚類曲線Fig.3 The sparse curve and rank abundance curve of daylily fungi in different treatments

圖4 不同處理黃花菜細(xì)菌稀釋曲線和等級(jí)聚類曲線Fig.4 Bacterial sparse curve and rank abundance curve of daylily in different treatments

同樣的，等級(jí)聚類曲線也可以表述不同處理組黃花菜組內(nèi)表面微生物DNA 樣本多樣性。等級(jí)聚類曲線橫坐標(biāo)是黃花菜微生物樣本中的OTUs按相對(duì)豐度排序編號(hào)，縱坐標(biāo)是微生物樣本相對(duì)豐度，等級(jí)聚類曲線趨勢(shì)越平緩，黃花菜微生物物種分布越均勻，而黃花菜微生物物種的豐富度越高，等級(jí)聚類曲線在橫坐標(biāo)上的跨度越大[23]。由圖3、圖4 可知，A 組黃花菜表面微生物樣本曲線在橫軸上的跨度最大，曲線最平緩，說明其真菌種類分布的均勻程度和豐富度高于其它兩組處理，同理，B 組黃花菜的細(xì)菌種類分布的均勻程度和豐富度高于其它兩組處理，相比之下，C 組樣本真菌細(xì)菌豐富度、均勻度最低，進(jìn)而得出相溫貯藏處理可使表面微生物生長(zhǎng)的豐富度降低。

2.3 基于OTU 的花瓣圖分析

如圖5 所示，真菌樣本中，在A 組黃花菜表面共有543 個(gè)OTUs，A 組特有142 個(gè)OTUs；B 組黃花菜表面共有764 個(gè)OTUs，B 組特有302 個(gè)OTUs；C 組黃花菜表面共有606 OTUs，C 組特有176 個(gè)OTUs。B 組樣本序列所得真菌OTU 數(shù)量最多，C 組其次，A 組最少。如圖5 所示，細(xì)菌樣本中，在A 組黃花菜表面共有843 個(gè)OTUs，A 組特有672 個(gè)OTUs；B 組黃花菜表面共有199 個(gè)OTUs，B 組特有59 個(gè)OTUs；C 組黃花菜表面共有263 OTUs，C 組特有100 個(gè)OTUs。冰箱貯藏的A組樣本序列所得細(xì)菌OTU 數(shù)量最多，含有最豐富的細(xì)菌種群，且與其它兩組差異較大，C 組其次，B 組最少。

圖5 不同處理黃花菜真菌和細(xì)菌OTU 花瓣圖Fig.5 Different treatment of daylily fungus and bacteria OTU petal map

2.4 屬水平注釋概況

根據(jù)不同處理組黃花菜表面微生物物種注釋結(jié)果，選取在屬水平上黃花菜微生物相對(duì)豐度排名靠前的10 個(gè)物種名稱和其相對(duì)豐度，以及其它物種占比，用這些數(shù)據(jù)制作成柱形圖，由圖6 所示，可以得到在屬水平上各組黃花菜表面相對(duì)豐度較高的真菌群落及其比例為：座囊菌（31.54%，45.77%，53.37%）、小葡萄菌（19.72%，13.53%，9.09%）、銀耳菌（6.84%，19.24%，8.05%）、散囊菌（0.22%，1.15%，0.16%）、子囊菌（0.54%，1.43%，0.80%），由圖6 可知，藍(lán)細(xì)菌（20.61%，63.09%，69.70%）、γ-變形桿菌（38.84%，2.04%，0.33%）、α-變形桿菌（35.65%，34.21%，28.91%）、芽孢桿菌（1.76%，0.12%，0.08%）、梭菌（1.70%，0.25%，0.44%）是不同處理黃花菜細(xì)菌群落在屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群。

圖6 不同處理黃花菜真菌和細(xì)菌在屬水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖Fig.6 Histogram of relative abundance of daylily fungi and bacteria in different treatments at the genus level

2.5 樣本復(fù)雜度分析

用Alpha Diversity 分析不同處理黃花菜表面的微生物群落多樣性[24]，得到各組黃花菜表面微生物種群及群落內(nèi)物種的豐富度和多樣性。統(tǒng)計(jì)表中涉及到4 個(gè)指數(shù)，Shannon 指數(shù)是樣品中的分類總數(shù)及其占比，物種分布越均勻，群落多樣性越高，Shannon 指數(shù)越大。Simpson 指數(shù)是群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度，Simpson 指數(shù)值越大，群落多樣性越低。Chao1 指數(shù)是群落樣品中包含的物種總數(shù)，ACE 指數(shù)是群落中OTU 數(shù)目。

表1 及表2 中所有結(jié)果Coverage 指數(shù)為0.99或1.00，說明不同處理黃花菜樣品中各微生物群種序列基本都已被測(cè)出，結(jié)果可以反映黃花菜樣本的測(cè)序情況。A、B、C 3 組檢測(cè)出的真菌物種數(shù)依次為：292，404，323，檢測(cè)出的細(xì)菌物種數(shù)依次為：344，120，128。根據(jù)表3 里的Shannon 指數(shù)，真菌群落多樣性及物種分布均勻程度由高到低依次為：B 組、C 組、A 組，Simpson 指數(shù)說明群落內(nèi)物種多樣性及均勻度由高至低為：B 組、A 組、C 組。同樣的，由表4 可得，Shannon 指數(shù)證明細(xì)菌群落多樣性和物種分布均勻度最高為A 組，B 組次之，C組最低，Simpson 指數(shù)證明細(xì)菌群落內(nèi)結(jié)果由高到低為：A 組、B 組、C 組。

表1 不同處理黃花菜真菌Alpha Indices 統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of alpha indices for different treatments of daylily fungi

表2 不同處理黃花菜細(xì)菌Alpha Indices 統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of alpha indices for different treatments of daylily bacteria

2.6 多樣本比較分析

多樣本比較分析是通過制作黃花菜表面微生物樣本DNA 的PCA 圖及Beta 多樣性指數(shù)組間差異分析，比較各組間黃花菜樣本的表面微生物群落信息[25-26]。根據(jù)黃花菜微生物物種注釋結(jié)果，選取豐度排名靠前的10 個(gè)屬，根據(jù)其在每個(gè)黃花菜表面微生物DNA 樣本中的豐度信息，將同類OTUs 信息制作成聚類熱圖，再進(jìn)行主成分分析。由圖9、圖10 所示，可以直觀地顯示不同處理黃花菜樣品中真菌及細(xì)菌的差異。

如圖7，根據(jù)黃花菜表面微生物OTU 的豐度數(shù)據(jù)，繪制黃花菜微生物屬水平上的數(shù)據(jù)熱圖，熱圖中不同顏色的梯度反映出不同處理組黃花菜表面微生物的群落相似性及物種聚類關(guān)系。不同處理的3 組黃花菜真菌群落結(jié)構(gòu)只有1 個(gè)聚類：A組和C 組聚為一類，B 組則分散不能聚類，說明不同樣品間真菌群落存在一定的差異性，A 組和C組群落結(jié)構(gòu)相似度較高。主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）[27]是依據(jù)降維思維提取出現(xiàn)有的有效數(shù)據(jù)中最關(guān)鍵元素的一種方法[28]。不同處理組黃花菜的樣本DNA 在PCA 圖中的距離越近，其微生物群落結(jié)構(gòu)越相似。結(jié)果也顯示黃花菜樣品A 組、C 組距離較近，即A 組黃花菜和C組黃花菜表面真菌群落結(jié)構(gòu)更相似。

圖7 不同處理黃花菜真菌品種多樣本比較分析Fig.7 Comparison and analysis of multi-samples of fungus varieties of daylily

圖8 為不同處理黃花菜細(xì)菌樣本分析比較，不同處理的3 組黃花菜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可分為1 個(gè)聚類：B 組和C 組聚為一類，A 組則分散不能聚為一類，說明A 組與其它兩組真菌群落存在一定的差異性，B 組和C 組群落結(jié)構(gòu)較接近。主成分分析結(jié)果也顯示樣品B 組、C 組距離較近，與聚類熱圖結(jié)果一致。

圖8 不同處理黃花菜細(xì)菌品種多樣本比較分析Fig.8 Comparative analysis of multiple samples of daylily bacteria in different treatments

3 結(jié)論

綜合對(duì)比得出，稀釋曲線和等級(jí)聚類曲線證明相溫貯藏可以有效抑制表面微生物的多樣性生長(zhǎng)，在屬水平上真菌的優(yōu)勢(shì)菌群有：座囊菌（Dothideomycetes）、小葡萄菌（Microbotryomycetes）、銀耳菌（Tremellomycetes）、散囊菌（Eurotiomycetes）、子囊菌（Sordariomycetes），屬水平上黃花菜細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群為：藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteriia）、γ-變形桿菌（Gammaproteobacteria）、α-變形桿菌（Alphaproteobacteria）、芽孢桿菌（Bacilli）、梭菌（Clostridia）。不同的貯藏溫度對(duì)黃花菜表面細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)具有一定的影響，冷庫貯藏和相溫貯藏黃花菜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高，相比之下冰箱貯藏處理則有很大差異。