沙棘籽粕低聚原花青素的制備及結(jié)構(gòu)與抗氧化活性分析

郭建峰，郄浩然，胡培毅，劉子超，譚志超，王 芳*

（1 中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院 太原 030051 2 中國露酒植物提取與健康因子山西省重點實驗室 太原 030051 3 北京寶得瑞健康產(chǎn)業(yè)有限公司 北京 100000）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）是胡頹子科沙棘屬多年生落葉灌木或小喬木，中國的沙棘屬植物具有豐富的資源蘊藏量和多樣性[1]。沙棘由果肉（68%）、種子（23%）和皮（7.75%）組成[2-3]，其中含有超過190 種活性成分和營養(yǎng)物質(zhì)，包括維生素類、黃酮類、多酚類、萜類、原花青素等[3]。研究表明，沙棘籽提取物中含有豐富的原花青素，已分離鑒定出原花青素的4 種單體和8 種二聚體，單體分別為兒茶素、表兒茶素、沒食兒茶素和表沒食子兒茶素[4-5]。

原花青素（Procyanidins，PC）由兒茶素、表兒茶素等黃烷三醇單體通過C4-C8 或C4-C6 鍵甚至C2-O-C7 連接而成，按聚合度分，聚合度2～4為低聚原花青素（Oligomeric Proanthocyanidins，OPC），聚合度≥5 為高聚原花青素（Polymeric Proanthocyanidins，PPC）[6-10]。研究表明，原花青素具有抗氧化、清除自由基、抑菌消炎、抗輻射、神經(jīng)保護作用、改善牙本質(zhì)膠原、抑制癌細胞增殖與凋亡等功效[11-16]。從植物中提取的原花青素以高聚體為主。高聚體原花青素水溶性較差，可能是大的空間位阻限制了酚羥基的活性，導(dǎo)致難以被人體吸收利用，只能作為低附加值產(chǎn)品進行利用。聚合度較低的OPC 水溶性較好，已被報道具有抗氧化、抗菌消炎、抗癌、皮膚保健等作用，其抗氧化能力明顯強于VE 和VC[17-18]。近年來OPC 在保健食品和化妝品中得到廣泛關(guān)注。

目前，國內(nèi)外對葡萄籽原花青素的研究較多，主要集中在提取工藝、生理活性及高聚體降解方面。對高聚體的降解方法主要酸催化[19]、堿催化[20-21]、催化加氫[22]、酶法等。葡萄籽原花青素（Grape Seed Proanthocyanidins，GSPs）由兒茶素（Catechin，C）、表兒茶素（Epicatechin，EC）和表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）3種組成[19]。而沙棘原花青素（Sea Buckthorn Proanthocyanidins，SBPC）由兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）和表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）構(gòu)成[4-5]。由于兩者中前兩種單體結(jié)構(gòu)一致，因此導(dǎo)致SBPC 與GSPs 的抗氧化性、提高免疫力、保護心血管等生物活性是相近的。SBPC 中GC 和EGC 兩種單體在B 環(huán)上有3個連續(xù)的羥基，造成SBPC 與GSPs 的差異，這種特殊的結(jié)構(gòu)特征直接影響SBPC 的某些功效，如SBPC 在抗氧化方面有突出優(yōu)勢。目前關(guān)于沙棘籽粕低聚原花青素制備、結(jié)構(gòu)和抗氧化性的報道較少。

我國的沙棘屬資源豐富，每年有高達數(shù)十噸的沙棘籽被浪費。為此，研究沙棘籽的精細加工、利用具有重要的現(xiàn)實意義。本文采用超高壓前處理沙棘籽，超聲提取低聚原花青素，通過IR 和UPLC-ESI-MS 分析沙棘籽粕原花青素含量，旨在為沙棘籽的精細開發(fā)與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑 沙棘籽粕：沙棘籽通過超臨界萃取沙棘籽油后，在通風(fēng)處晾干或冷凍干燥制成，粉碎過20～100 目篩。

GA、C、EC、ECG、EGCG、二聚體B2 等標(biāo)準(zhǔn)品，上海安譜實驗科技股份有限公司（HPLC≥99%）；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate，DPPH）、2，2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2’-azino -bis（3 -ethylbenzothiazoline -6 -sulfonic acid），ABTS）、2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪（2，4，6-Tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ），上海麥克林生化科技有限公司（HPLC≥99%）；香草醛等相關(guān)試劑均采購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司（AR≥99%）；試驗用水為蒸餾水。

1.1.2 儀器設(shè)備 SB-3200DTS 超聲波雙頻機，寧波新芝生物科技有限公司；ReadMax1900 型光吸收全波長酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司；Ultimate 3000 UHPLC-Q Exactive 液質(zhì)聯(lián)用儀，Thermo Scientific，US。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙棘籽原花青素的制備工藝 首先，沙棘籽粕按（1 ∶10～1 ∶30）料液比加入70%乙醇在600 MPa 下超高壓前處理20 min，接著調(diào)整體系的pH（2.00～5.00）在超聲溫度（30～50 ℃）下180 W 超聲反應(yīng)10～50 min，重復(fù)提取3 次，4 000 r/min 離心20 min，合并濾液后，減壓濃縮，得到濃縮液A。

濃縮液A 采用大孔樹脂AB-8（2.5 cm×60 cm）1 BV/h 上樣，吸附完全后，以2 BV/h 的流速利用蒸餾水除去部分多糖和蛋白質(zhì)，再利用30%～70%乙醇進行解吸。收集30%～70%乙醇洗脫液于28 ℃減壓濃縮后，得濃縮液B，濃縮液B 冷凍干燥后得到沙棘籽粕低聚原花青素提取物。以原花青素提取率、平均聚合度（mDP）為指標(biāo)，考察各因素對原花青素效果的影響。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化工藝 結(jié)合單因素試驗，以A（料液比）、B（超聲時間）、C（超聲溫度）、D（體系pH）進行4 因素3 水平的響應(yīng)面法優(yōu)化，以沙棘籽粕原花青素的提取率、平均聚合度（mDP）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken 原理，運用Design-Expert.V 12 軟件進行試驗優(yōu)化。

表1 Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計Table 1 Design of combined test of Box-Behnken

1.2.3 平均聚合度的測定

1.2.3.1 原花青素含量的測定 參考文獻[23]采用香草醛-鹽酸法。取1 mL 不同濃度的兒茶素（0～1 mg/mL）加入2.5 mL 1.5%香草醛-甲醇溶液和2.5 mL 30%鹽酸-甲醇溶液，混合均勻，（30±1）℃暗反應(yīng)15 min，于500 nm 測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.3113x+0.0793，R2=0.9936。取1 mL 稀釋的提取液，按上述步驟操作。按公式計算原花青素的提取率（ρ）：

式中：ρ——原花青素的提取率，%；m——凍干得到提取物的質(zhì)量，g；M——原料的質(zhì)量，g。

1.2.3.2 物質(zhì)的量的測定 參考文獻[23-24]采用改良香草醛-鹽酸法。取1 mL 不同濃度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0～4 mol/mL）加入2.5 mL 1.5%香草醛-乙酸溶液和2.5 mL 4%鹽酸-乙酸溶液，充分搖勻，（30±1）℃暗反應(yīng)15 min，在500 nm 測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.2287x+0.0951，R2=0.9987。取1 mL 稀釋的提取液，按上述步驟操作。

原花青素平均聚合度（mDP）的計算：

式中：m——原花青素質(zhì)量含量，μg；M——兒茶素相對分子質(zhì)量，290；n——原花青素物質(zhì)的量，μmol。

1.2.4 紅外光譜分析 利用K-Br 方法[25-26]檢測凍干沙棘籽粕的低聚原花青素提取物的紅外光譜，掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.2.5 UPLC-ESI-MS 分析

1.2.5.1 色譜條件 色譜柱（Eclipse Plus C18100 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：5.0 μL；流速：0.5 mL/min；流動相：A：0.1%甲酸；B：乙腈。洗脫程序：0～12 min，95%～65%A；12～18 min，65%～5%A；18～23 min，5% A；23～24 min，5%～95% A；24～30 min，95% A。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：HESI；翹氣速率：30 mL/min；輔助氣速率：10 mL/min；噴霧電壓：負(fù)離子3.2 kV；毛細管溫度320 ℃；輔助氣溫度300℃；S-lens：50%；碰撞電壓：NCE：30；掃描范圍m/z 200～3 000。

1.3 體外抗氧化活性的測定

1.3.1 DPPH 清除自由基能力的測定 參照文獻[27-28]，略作修改。取0.0079 g DPPH 溶于10 mL無水乙醇，配置成200 μmol/L 的母液，使用前用無水乙醇稀釋為60 μmol/L 的DPPH 工作液。在96孔板中，加入100 μL 不同濃度的Trolox 溶液（0～1 mmol/mL）和100 μL DPPH 工作液，室溫下暗反應(yīng)30 min，于517 nm 測定吸光度。以DPPH 自由基清除率為縱坐標(biāo)，以Trolox 的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.565x+0.2009，R2=0.9957。取100 μL 稀釋后提取液，按上述步驟測定。清除率按公式（3）計算：

式中：A0——無水乙醇+DPPH 的吸光度；A1——樣品+DPPH 的吸光度；A2——樣品+無水乙醇的吸光度。

1.3.2 ABTS 清除自由基能力的測定 參照文獻[29]，略作修改。取5 mL 14 mmol/L 的ABTS 溶液和5 mL 4.9 mmol/L 的K2S2O8，混合均勻，室溫暗反應(yīng)12～16 h，得到ABTS 工作液。將ABTS 工作液使用前用無水乙醇稀釋至A734nm=0.700±0.02。取20 μL 不同濃度的Trolox 溶液（0～1 mmol/mL）加入到180 μL ABTS 稀釋液中，室溫暗反應(yīng)10 min，于734 nm 處測定吸光值。以ABTS 自由基清除率為縱坐標(biāo)，以Trolox 的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0035x+0.13，R2=0.9913。取20 μL 稀釋后提取液，按上述步驟操作。

1.3.3 Fe3+還原能力測定（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）參考文獻[29-30]，略有修改。取pH 3.60 300 mmo/L 醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ 溶 液和20 mmol/L FeCl3按10 ∶1 ∶1比例混勻，37 ℃暗反應(yīng)10 min 得FRAP 工作液。在96 孔板中，加入20 μL 不同濃度的Trolox（0～1 mmol/mL）和180 μL FRAP 工作液，振蕩混勻，37℃反應(yīng)10 min，于593 nm 處測定吸光度。以還原產(chǎn)物吸光度為縱坐標(biāo)，Trolox 的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.6309x+0.0963，R2=0.9944。取20 μL 稀釋后提取液，按上述步驟操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比對低聚原花青素提取的影響 圖1a 為料液比對原花青素的影響。隨著料液比的增加，mDP 呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。當(dāng)料液比為1∶15 時，mDP 達到最小值，此時沙棘籽粕中原花青素的提取率達到最大值。而隨著料液比的增大，體現(xiàn)出負(fù)作用即其mDP 逐漸增大；這將會增加溶劑成本，同時雜質(zhì)溶出量增加不利于后續(xù)精制提純。

2.1.2 超聲時間對低聚原花青素提取的影響 超聲波加速提取天然產(chǎn)物中有效成分的理論依據(jù)是其機械作用、空化作用及熱效應(yīng)；其中空化和機械作可使沙棘籽中有效成分快速溶出，熱效應(yīng)則使溶液內(nèi)部溫度升高；這些作用可加速細胞壁的破壞，同時避免溫度過高造成原花青素的含量降低[31-32]。

圖1b 為超聲時間對原花青素的影響。隨著超聲時間的增加，mDP 呈現(xiàn)逐漸減小而提取率逐漸增大的趨勢，這可能是由于超聲波時間增加使得溶質(zhì)和溶劑間的熱效應(yīng)增強，沙棘籽粕與溶劑中原花青素的濃度差逐漸縮小，還可能是在酸性條件下長時間的溫度作用使得原花青素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致。

2.1.3 超聲溫度對低聚原花青素提取的影響 圖1c 為超聲溫度對原花青素的影響。當(dāng)提取溫度低于45 ℃時，沙棘籽原花青素的提取率隨著超聲溫度增加呈增加趨勢，而mDP 隨著溫度增加而逐漸減小，溫度升高有利于分子間運動如滲透、溶解等，沙棘籽中有效成分加速溶出使其轉(zhuǎn)移至溶劑中[31]。但原花青素屬于熱不穩(wěn)定物質(zhì)，當(dāng)溫度過高，原花青素的提取率開始降低，同時還會造成其他熱穩(wěn)定的雜質(zhì)溶出。

2.1.4 體系pH 值對低聚原花青素提取的影響 圖1d 為體系pH 值對原花青素的影響。隨著體系pH值的降低，mDP 呈現(xiàn)驟然減小的趨勢，這可能是由于在整個體系中添加酸性催化劑，體系中pH 值發(fā)生變化，這種酸性環(huán)境更利于原花青素的解聚與提取，使得原花青素的提取率隨體系pH 值降低而增加。而當(dāng)體系pH 值達到4.0 左右時，雖然環(huán)境處于酸性狀態(tài)，但已無法提供原花青素解聚所需的環(huán)境，因此造成了mDP 驟然增大的現(xiàn)象即mDP＞4 為PPC。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 響應(yīng)面法優(yōu)化方案及結(jié)果如表2 所示。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results

2.2.2 回歸方程與方差分析 采用Design-Expert 12 軟件對響應(yīng)值和各因素進行回歸擬合，以沙棘籽粕原花青素提取率（Y1）、mDP（Y2）為響應(yīng)值，得到各因子的二次回歸擬合方程為：

由表3 可知，得率（Y1）P=0.0003＜0.01 表示該模型顯著，在這種情況下，A、B、AB、AC、CD、B2、C2、D2是重要的模型項；其R2=0.8841 說明88.41%能夠由該模型解釋；這些數(shù)據(jù)均表示該模型能解釋響應(yīng)值的變化，即該模型與實際試驗擬合較好；各因素對沙棘籽原花青素提取率的影響：料液比＞超聲時間＞溶劑pH 值＞超聲溫度。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

mDP（Y2）P＜0.0001 表示該模型顯著，在這種情況 下，A、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2是重要的模型項；其R2=0.9599 說明95.99%能夠由該模型解釋；這些數(shù)據(jù)均表示該模型能解釋響應(yīng)值的變化，即該模型與實際試驗擬合較好；各因素對mDP 的影響：料液比＞體系pH 值＞超聲時間＞超聲溫度。

2.2.3 各因素間對原花青素平均聚合度的交互作用 采用Design-Expert 12 軟件對料液比、超聲時間、超聲溫度、體系pH 值之間交互作用的關(guān)系進行分析，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 各因素對原花青素平均聚合度的交互作用Fig.2 The interaction of various factors on the average degree of polymerization of proanthocyanidins

從圖2 可看出，料液比與超聲時間、超聲溫度、溶劑pH 值的3D 圖走勢較陡峭，等高線密集且呈橢圓形，說明兩兩變量之間交互作用較強。同理，超聲溫度、體系pH 值與超聲時間的交互作用也較強。而圖2f 中，超聲時間與體系pH 值的3D圖走勢陡峭，等高線密集但未呈現(xiàn)橢圓形，說明這兩者之間的交互作用較弱。由圖2 的響應(yīng)面圖及F 值可知兩因素對原花青素平均聚合度影響大小依次為：CD＞AD＞BC＞AC＞BD＞AB。

2.2.4 最佳工藝條件的預(yù)測和驗證 經(jīng)過Design-Expert 12 對數(shù)據(jù)進行處理，分析得本研究的最佳工藝為：料液比1 ∶13.89（g/mL）、超聲時間27.89 min、超聲溫度42.67 ℃、體系pH 2.63。在這種條件下模型預(yù)測沙棘籽粕原花青素提取率為6.741%、mDP 為3.260。

考慮實際情況，對上述條件最佳工藝進行修正：料液比1 ∶15（g/mL）、超聲時間28 min、超聲溫度45 ℃、體系pH 2.50。在此條件下進行3 次驗證試驗，沙棘籽粕原花青素平均聚合度為3.35＜4，即為OPC，RSD 為1.69%，表明試驗結(jié)果與模型擬合良好，說明本工藝條件可行、可靠。

2.3 沙棘籽粕原花青素的紅外光譜分析

圖3 中吸收峰均發(fā)生在原花青素母核的C6-C3-C6 結(jié)構(gòu)上，3 405 cm-1為-OH 伸縮振動，2 926 cm-1為C-H 伸縮振動，1 722 cm-1為C=O 伸縮振動，1 615 cm-1和1 452 cm-1均為苯環(huán)的C=C 伸縮振動，1 347 cm-1為苯環(huán)的C-H 彎曲振動，1 203 cm-1、1 065 cm-1可能為C 環(huán)的C-O-C 伸縮振動，837 cm-1則是由于2，3，4 位存在羥基取代形成。最后，626 cm-1是C-H 的面外伸縮振動。

圖3 沙棘籽原花青素的紅外光譜Fig.3 Infrared spectrum of sea buckthorn seeds proanthocyanidins

根據(jù)文獻報道，原花青素的特征骨架在1 650～1 000 cm-1和850～700 cm-1區(qū)域，850～700 cm-1的吸收峰收數(shù)目直接取決于B 環(huán)上羥基的數(shù)量，同時以C（EC）為主的原花青素在780～770 cm-1吸收峰明顯，以GC（EGC）為主的原花青素則在730 cm-1左右有強吸收峰[33-34]。純化物的紅外光譜在725 cm-1有1 個吸收峰，表明本研究的純化物以GC（EGC）為主，C（EC）次之。這也說明了沙棘籽粕原花青素與葡萄籽原花青素結(jié)構(gòu)上的區(qū)別[33]。

2.4 UPLC-ESI-MS 分析

沙棘籽粕原花青素成分復(fù)雜，根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)研究，選擇合適的分子離子峰進行二級質(zhì)譜分析，鑒定出6 種單體、三類二聚體、三聚體，UPLCESI-MS 分析結(jié)果見表4。

表4 沙棘籽粕原花青素主要質(zhì)譜數(shù)據(jù)及辨析Table 4 Main mass spectrum data and analysis of seabuckthorn seed meal proanthocyanidins

單體：C 與EC 互為同分異構(gòu)體，兩者分子離子峰[M-H]-m/z 均為289，并且二級質(zhì)譜的碎片峰信息中均有明顯的m/z 245，203，179，125，說明兩者二級質(zhì)譜裂解規(guī)律一致，即m/z 245 為[M-H]-失去1 分子CO2，m/z 203 為[M-H]-失去兩分子C2H2O，m/z 179 為[M-H]-失去1 分子C2H6O2，m/z 125 為A 環(huán)中1，4 位置開環(huán)裂解。根據(jù)文獻[4，35-36]推斷保留時間1.95 min 為C，8.24 min 為EC。

同理，GC 與EGC 互為同分異構(gòu)體，兩者分子離子峰[M-H]-m/z 均為305，并且兩者二級質(zhì)譜裂解規(guī)律一致，即m/z 219 為[M-H]-失去兩分子C2H2O，m/z 179 為[M-H]-失去1 分子C2H6O2，m/z 125 為A 環(huán)中1，4 位置開環(huán)裂解。因此，推斷5.58 min 為GC，6.84 min 為EGC[4，36]。

ECG 由[M-H]-m/z 441 和二級質(zhì)譜碎片峰m/z 423，289，245，233，179，125 等信息，推測其裂解規(guī)律為m/z 423 為失去1 分子H2O，m/z 289 為失去沒食子酸酯部分，m/z 245，179，125 與兒茶素的二級質(zhì)譜裂解規(guī)律一致，對比文獻[37]，推測4.83 min 為ECG。

EGCG 由[M-H]-m/z 457 和二級質(zhì)譜碎片峰m/z 305，179，177，153，125 等信息，推測保留時間3.79 min 為EGCG[38]。其二級質(zhì)譜裂解規(guī)律為m/z 305 為[M-H]-失去沒食子酸酯，接著失去兩分子C2H2O 為m/z 245，進一步失去1 分子C2H6O2為m/z 179，而m/z 125 為A 環(huán)中1，4 位置開環(huán)裂解。

通過與文獻[35-38]結(jié)果比對，及分析原花青素的成鍵與裂解方式[39-40]，本研究中共鑒定4 類不同構(gòu)成的二聚體，包括3 類B 型二聚體、一類A型二聚體：

第1 類[M-H]-m/z 為577，是由兩個C（EC）構(gòu)成的二聚體，其二級質(zhì)譜信息中m/z 407 為二聚體先經(jīng)RDA 重排在失去1 分子H2O 得到；m/z 289 為二聚體失去1 分子單體得到，m/z 179，125與C（EC）的裂解規(guī)律一致。

第2 類 [M-H]-為m/z 609，是由2 個GC（EGC）構(gòu)成的二聚體，其二級質(zhì)譜信息中m/z 423為二聚體先經(jīng)RDA 重排在失去1 分子H2O 得到；m/z 305 為構(gòu)成二聚體的連接鍵斷裂形成。而m/z 245，179，125 與其單體的裂解規(guī)律一致。

第3 類[M-H]-為m/z 593，是由1 個C（EC）和1 個GC（EGC）構(gòu)成的二聚體。其二級質(zhì)譜信息中m/z 407 為二聚體先發(fā)生RDA 重排而得到的，再失去1 分子H2O 形成，m/z 305 為失去，1 分子C（EC）形成，m/z 289 為失去1 分子GC（EGC）形成，m/z 125 為構(gòu)成單體中A 環(huán)的1，4 位置開環(huán)裂解。

第4 類[M-H]-為m/z 575，由于A 型二聚體和B 型二聚體在鍵的連接方式上存在差異，即A型二聚體不僅含有C4-C8或C4-C6還有C2-O-C7或C2-O-C5，因此兩者在質(zhì)譜信息中存在顯著差異。根據(jù)二級質(zhì)譜信息m/z 423 為[M-H]-發(fā)生RDA 重排而得到的，再失去1 分子H2O 就形成m/z 407；二聚體組成單元之間的連接鍵斷裂，m/z287（[MT-3H]-）為C4位置斷裂形成，m/z 245 [MH]-是失去1 分子結(jié)構(gòu)單元和1 分子CO2得到。與文獻[41]～[45]A 型原花青素結(jié)果相似。目前沙棘籽粕中尚未有關(guān)于A 型原花青素的相關(guān)報道，本研究可能是首次鑒定出沙棘籽粕中A 型二聚體原花青素。這也有可能是本研究工藝導(dǎo)致沙棘籽中高聚原花青素解聚，形成A 型原花青素。

三聚體C45H38O18m/z 865：其二級質(zhì)譜信息中m/z 407 為[M-H]-先發(fā)生RDA 重排再失去1 分子結(jié)構(gòu)單元形成；三聚體組成單體之間的鍵斷裂，m/z 289 為B-unit（base）形成，m/z 287 為T-unit（top）形成，前者的離子豐度遠強于后者，與Monagas 等[46]結(jié)果一致，m/z 245 是[M-H]-失去兩分子結(jié)構(gòu)單元和1 分子CO2得到，m/z 125 為一個結(jié)構(gòu)單元的A 環(huán)中1，4 位置開環(huán)裂解。由于A 型原花青素易發(fā)生聚合反應(yīng)，m/z 865 有可能是兩分子A型二聚體聚合后，失去1 個H 并發(fā)生quinone methide fission（QM）cleavage 分子間斷裂（m/z減少290）產(chǎn)生的[38，45]。

從相關(guān)質(zhì)譜信息中得到，PPC（mDP≥5）未檢出，因此證明了本研究工藝對制備沙棘籽粕低聚原花青有顯著效果。

2.5 抗氧化活性評價

以Trolox 標(biāo)準(zhǔn)品為對照，結(jié)果用Trolox 的當(dāng)量（μmol Trolox/g DW）表示，考察料液比、超聲時間、超聲溫度和體系pH 值對抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 沙棘籽粕原花青素總離子流圖Fig.4 Seabuckthorn seed meal proanthocyanidin total ion chromatogram

當(dāng)超聲時間、超聲溫度、體系pH 值一定，沙棘籽粕原花青素對DPPH、ABTS、FRAP 的抗氧化活性隨著料液比的增加逐漸降低，這可能是料液比影響有效成分的溶出，導(dǎo)致部分雜質(zhì)的溶出量增大。同理，超聲時間、超聲溫度、體系pH 值這3 個因素對DPPH、ABTS、FRAP 的活性均為正相關(guān)，這表明上述3 個因素有利于沙棘籽粕原花青素的制取，并很好地提升了原花青素的生物活性。

目前，有研究表明原花青素中單體ECG 的抗氧化活性高于其它單體，且二聚體的抗氧化活性高于單體，隨著聚合度的增加抗氧化性逐漸減弱[47-48]。本研究通過對比可以判斷出低聚體含量較高的原花青素的抗氧化能力較強，造成差異較明顯，這可能由于原花青素的聚合度不同導(dǎo)致其基本單元的構(gòu)成不同，還與其分子質(zhì)量、空間位阻等因素不同有關(guān)[49-50]。

圖5 不同處理對（a）DPPH、（b）ABTS、（c）FRAP 抗氧化活性的影響Fig.5 The effect of different treatments on（a）DPPH，（b）ABTS，（c）FRAP antioxidant activity

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了在超聲波輔助下，酸性解聚沙棘籽粕原花青素的工藝，其中各因素對mDP 的影響順序為：料液比＞體系pH 值＞超聲時間＞超聲溫度。研究表明，最優(yōu)工藝為料液比1∶15（g/mL）、超聲時間28 min、超聲溫度45 ℃、體系pH 2.85 時，沙棘籽粕原花青素提取率達到6.556%，mDP 為3.35，其抗氧化性為DPPH 2.205 mmol Trolox/g DW，ABTS 1.307 mmol Trolox/g DW，F(xiàn)RAP 0.8143 mmol Trolox/g DW。本研究中所利用的方法很大程度上提高了沙棘籽粕中原花青素得率和抗氧化活性，同時具有操作簡單、提速快、耗能低、提取率高等優(yōu)點，可為沙棘籽的精細加工利用提供依據(jù)，為沙棘籽原花青素的合理開發(fā)提供理論依據(jù)。