火龍果果皮中甜菜紅素的提取、鑒定及金屬離子對其穩(wěn)定性的影響

艾雅娜，張海娟，廖紅梅

（江南大學食品學院 江蘇無錫 214122）

顏色是決定消費者對食品接受程度的關鍵質(zhì)量指標之一。對合成色素安全性的擔憂導致越來越多的消費者傾向于使用花青素、甜菜紅素、姜黃素、胡蘿卜素和葉綠素[1-5]等天然色素來替代之。目前，我國食用色素年產(chǎn)量約28 000 t，其中天然色素的產(chǎn)量約為25 000 t[6]。天然食用色素的使用量呈快速增長趨勢，市場需求增長率一直保持在10%以上[7]?？梢?，開發(fā)天然食用色素成為食品工業(yè)的重要領域之一。

甜菜紅素是水溶性含氮色素，基本發(fā)色基團是1，7-二偶氮庚甲堿[8]。其來源包括甜菜根、莧菜和紅肉火龍果[9]。然而，甜菜紅素易受熱、氧、光、pH 值、水活度、金屬離子和酶等的影響[9]，這限制了其在食品加工中的應用。紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus）是一種仙人掌科量天尺屬的熱帶/亞熱帶水果[8]，其紅紫色源于甜菜紅素。朱文嫻等[10]報道了4 個產(chǎn)地的紅肉火龍果肉中甜菜紅素含量為15.76～28.94 mg/100 g。Stinzing 等[11]的研究表明紅肉火龍果中甜菜紅素不僅可用作食用色素，還具有抗氧化和清除自由基等生物活性。此外，紅肉火龍果的果皮約占果實質(zhì)量18～24%[12]，通常被丟棄；然而，其果皮含150.46 mg/100 g（干重）甜菜紅素[13]。對果皮中甜菜紅素提取、純化，可充分利用植物資源，同時可減少環(huán)境污染源。

本文首先優(yōu)化紅肉火龍果果皮中甜菜紅素的提取條件，然后，分析果皮中甜菜紅素的結構，最后評價金屬離子Cu2+和Fe2+對甜菜紅素穩(wěn)定性的影響，以期為火龍果源甜菜紅素在食品加工中的應用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紅肉火龍果（Hylocereus polyrhizus）購自本地歐尚超市；HCl、氫氧化鈉、氯化亞鐵、乙醇等，購自國藥集團化學試劑有限公司；無水硫酸銅，購自北京伊諾凱科技有限公司；AB-8 大孔吸附樹脂，購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SRQ-7316 型破壁料理機，九陽股份有限公司；UV-1800 型紫外分光光度計，島津國際貿(mào)易（上海）有限公司；DC801 型真空冷凍干燥機，大和科學株式會社；SQP 型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；Eppendorf Centrifuge 5804 型臺式高速冷凍離心機，德國艾本德公司；cs-820N 型色度計，杭州彩普科技有限公司；MALDI SYNAPT MS超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國沃特世公司；HL-2S 恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；RV 8 旋轉蒸發(fā)儀，艾卡（廣州）儀器設備有限公司。

1.3 甜菜紅素的提取優(yōu)化

收集紅肉火龍果果汁和果切加工中去除的果皮，去除鱗片，清洗風干，切塊打漿制得果皮漿，待用。分別探究浸提液、料液比、浸提液pH 值、提取溫度和時間對提取紅肉火龍果果皮中甜菜紅素得率的影響。浸提液設置為：蒸餾水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇；料液比設置為：1∶3，1∶4，1 ∶5，1 ∶6，1 ∶7；浸提液pH 值設置為：3.0，4.0，5.0，6.0，7.0；提取溫度設置為：30，45，60，75，90℃；提取時間設置為：15，30，45，60，75 min。探究一個因素變化對甜菜紅素得率影響時，其它因素設置為：蒸餾水提取，料液比1∶5，浸提液pH 4.0，提取溫度30 ℃，提取時間60 min。每組試驗稱取50.00 g 的紅肉火龍果果皮漿，提取液于4 ℃、8 000×g 離心15 min 獲得。

甜菜紅素得率[14]定義為單位質(zhì)量火龍果皮提取得到的甜菜紅素質(zhì)量（mg/100 g），由公式（1）和（2）計算[8，14]：

式中：C——提取液中甜菜紅素的質(zhì)量濃度，mg/100 mL；A——538 nm 下的吸光值；Mw——分子質(zhì)量（550 g/mol）；DF——稀釋倍數(shù)；ε——摩爾消光系數(shù)（65 000）；L——路徑長度（1 cm）；Y——甜菜紅素的得率，mg/100 g；V——提取液體積，mL；M——火龍果皮質(zhì)量，g。

1.4 甜菜紅素的純化

按照如下流程純化果皮甜菜紅素：提取液通過AB-8 大孔吸附樹脂柱充分吸附，先用蒸餾水洗脫，去除水溶性雜質(zhì)（果膠、糖等），再用60%乙醇溶液洗脫，得到甜菜紅素洗脫液。將洗脫液旋蒸濃縮（溫度40 ℃）并冷凍干燥，得到甜菜紅素提取物（粉末）。將制備的甜菜紅素提取物避光保存于-20 ℃。

1.5 甜菜紅素含量及結構分析

將500 mg 甜菜紅素提取物溶解于100 mL 水中，在黑暗中放置30 min 后，測定溶液在538 nm處的吸光度。提取物中甜菜紅素含量由公式（3）計算[12]：

式中：A——樣品538 nm 下的吸光值；Mw——分子質(zhì)量（550 g/mol）；DF——稀釋倍數(shù)；V——溶液體積，mL；ε——摩爾消光系數(shù)（65 000）；L——路徑長度（1 cm）；M——提取物質(zhì)量，g。

采用UPLC-MS 分析甜菜紅素單體，方法如下[8]：將甜菜紅素溶解于水中，質(zhì)量濃度為5 mg/mL。在4 ℃下10 000×g 離心15 min，收集上清液用于測試。具體檢測條件為：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；DAD 檢測器，檢測波長為535 nm；進樣量2 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫45 ℃；梯度洗脫，洗脫時間10 min。MS 條件參數(shù)為：ESI+離子掃描，m/z：20～1 000；脫溶劑溫度：400 ℃，脫溶劑氣體流量為700 L/h；碰撞能量25 eV，錐電壓30 V，霧化器壓力50 psi，毛細管電壓3 500 V。

1.6 金屬離子對甜菜紅素顏色穩(wěn)定性的影響

配制CuSO4和FeCl2溶液使之在甜菜紅素溶液（50 mg/L）中含量為0.00，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 mg/mL，室溫避光，于0，2，4，6，8，10，24 h 時在538 nm 處測定吸光值，拍攝記錄甜菜紅素溶液的顏色并采用色度計測定顏色值：L*、a*和b*值。ΔE 值根據(jù)下列公式（4）計算：

式 中，L*0、a*0和b*0值表示0 h 溶液的亮度值、紅綠值和黃藍值，L*、a*和b*值表示2，4，6，8，10，24 h 溶液的亮度值、紅綠值和黃藍值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均進行3 次平行試驗，使用SPSS 23.0 進行方差分析（ANOVA），采用Duncan 檢驗，顯著性水平為P=0.05。所有圖使用Origin 9.0 繪制。

2 結果與討論

2.1 甜菜紅素的提取優(yōu)化

從圖1a 可知，浸提液中水和乙醇的比例顯著影響甜菜紅素的得率。蒸餾水提取得到了最高的甜菜紅素得率，隨著乙醇濃度的增加，甜菜紅素的得率顯著降低（P＜0.05）。甜菜紅素得率降低可能由于其結構中有親水性的羧基和羥基，形成氫鍵，使其更易溶解在水中[16]。因此，選擇蒸餾水為提取溶劑。

料液比對甜菜紅素得率的影響如圖1b 所示。隨著料液比的增加，甜菜紅素的得率也隨著增大，料液比為1∶5 和1∶6 時，提取量無顯著性差異（P＞0.05），料液比增加至1∶7，得率下降。這可能是由于料液比增加使果皮漿與溶劑接觸的面積增大，促進自由擴散，但料液比達到一定程度時，甜菜紅素接近全部溶出，增加料液比會降低甜菜紅素的濃度[17]。從生產(chǎn)成本以及后續(xù)處理考慮，選擇料液比為1∶5。

浸提液pH 值對甜菜紅素得率的影響如圖1c所示。隨著pH 值的增加，甜菜紅素得率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，pH 值為5 時，得率最高且與其它pH 值下的得率差異性顯著（P＜0.05）。這可能與甜菜紅素在不同pH 值下的穩(wěn)定性有關，Stinzing等[11]研究表明，在pH 值為5.0 時，火龍果中甜菜素的顏色穩(wěn)定性最好。因此選擇浸提液pH 值為5。

提取溫度對甜菜紅素得率的影響如圖1d 所示。30 ℃下甜菜紅素的得率最大，但與45 ℃下無顯著性差異（P＞0.05）。隨著溫度的進一步升高，得率顯著下降（P＜0.05）。結果表明，甜菜紅素的熱穩(wěn)定性較差，較高的溫度導致其熱降解[18]?？紤]到生產(chǎn)過程中的能源負擔，選擇提取溫度為30 ℃。

提取時間對甜菜紅素得率的影響如圖1e 所示。隨著提取時間的延長，甜菜紅素的得率增大。在提取時間為60 min 時，甜菜紅素的得率達到了最大值。超過60 min，得率開始下降，可能是長時間的提取，甜菜紅素降解[19]。因此選擇提取時間為60 min。

經(jīng)純化工藝流程獲得甜菜紅素提取物，提取物中甜菜紅素的含量為95.2 mg/g，遠高于Cai等[20]報道的莧屬植物提取物中14～47 mg/g 的甜菜紅素含量。結果表明，紅肉火龍果果皮廢棄物可作為甜菜紅素的良好來源。

2.2 甜菜紅素的鑒定

通過UPLC-MS 對提取物中甜菜紅素單體結構進行鑒定，如圖2 所示，根據(jù)保留時間和質(zhì)譜圖等和已報道的相關文獻進行比較[8，16，21-23]，分析出純化后的甜菜紅素提取物中具有6 種的單體結構（表1）。Fathordoobady 等[16]用溶劑和超臨界流體法提取紅肉火龍果果皮中的甜菜紅素，純化后分別檢測到6 和8 種甜菜紅素單體。陽辛鳳等[24]分析鑒定出紅肉火龍果果皮提取液中具有14 種甜菜紅素單體。表明不同的提取方法以及純化過程都會造成火龍果果皮中甜菜紅素單體測定的差異。

表1 提取物中甜菜紅素單體分析Table 1 Monomer analysis of betacyanins extract

圖2 甜菜紅素提取物的（a）UPLC 圖譜和（b）質(zhì)譜圖Fig.2 （a）UPLC profile and（b）corresponding MS of betacyanins extract

由表1 可知，丙二酰甜菜苷和甜菜苷為主要的甜菜紅素，二者占比分別為46.49%和34.35%。這與Fathordoobady 等[16]的研究結果一致。丁酰甜菜苷是紅肉火龍果皮提取物中另一種少量的甜菜紅素，在紅肉火龍果的果肉和果皮均存在[8，16]。不同來源的甜菜紅素其組成和含量存在差異。例如，朱文嫻[8]分析鑒定出濃縮紅肉火龍果汁中具有13種甜菜紅素單體，甜菜苷和丙二酰甜菜苷分別占比70%和15%左右；在藜科植物紅甜菜中以甜菜苷及其異構體異甜菜苷為主，占75%～95%[25]；在莧屬植物中莧菜苷和異構體異莧菜苷分別占80%和20%左右，基本不含其它甜菜紅素[20]。

2.3 金屬離子對甜菜紅素穩(wěn)定性的影響

2.3.1 CuSO4對甜菜紅素穩(wěn)定性的影響 由圖3所示，當加入CuSO4時甜菜紅素溶液由紫紅色變成橘紅色，這是由于Cu2+與甜菜紅素發(fā)生絡合作用，金屬-色素復合物的形成導致其發(fā)生顏色變化[26]。隨著時間延長，甜菜紅素溶液的顏色變淺乃至轉變?yōu)辄S綠色。如圖4 所示，添加CuSO4后，甜菜紅素溶液L*值顯著升高（P＜0.05），a*和b*值顯著降低（P＜0.05），導致色差值ΔE 增加；且CuSO4濃度越高變化趨勢越明顯。由圖5 可知，與未添加組相比，添加CuSO4使甜菜紅素溶液吸光度值顯著降低（P＜0.05），且其變化與CuSO4濃度正相關。故少至0.05 mg/mL CuSO4也會干擾甜菜紅素的穩(wěn)定性。這可能是由于CuSO4導致了甜菜紅素的氧化。Agnieszka 等[27]研究結果表明在Cu2+影響下甜菜苷脫氫生成新甜菜苷（黃色），新甜菜苷在Cu2+的作用下進一步氧化，生成2-脫羧基-黃嘌呤新甜菜苷（黃色）。

圖3 CuSO4（0.00～1.00 mg/mL）對甜菜紅素溶液顏色的影響Fig.3 Influence of CuSO4（0.00-1.00 mg/mL）on the color of betacyanins solution

圖4 CuSO4 對甜菜紅素溶液色度值（a）L*、（b）a*、（c）b*和（d）△E 的影響Fig.4 Influence of CuSO4 on the chromaticity values（a）L*，（b）a*，（c）b* and（d）ΔE of betacyanins solution

圖5 CuSO4 對甜菜紅素溶液538 nm 處吸光值的影響Fig.5 Influence of CuSO4 on absorbance value of betacyanins solution at 538 nm

2.3.2 FeCl2對甜菜紅素穩(wěn)定性的影響 如圖6所示，加入FeCl224 h 后甜菜紅素溶液顏色由紅色變?yōu)榛壹t色，并且出現(xiàn)少量白色懸浮物。這與Liu 等[28]的結果一致。如圖7 所示，加入FeCl2后溶液的L*、a*和b*值均降低，且隨FeCl2濃度增大而降低更明顯。隨著時間延長，添加超過0.10 mg/mL FeCl2的甜菜紅素溶液L*和b*值呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，a*值持續(xù)降低，導致ΔE 值增大。如圖8 所示，與未添加FeCl2相比，甜菜紅素溶液的A538nm值顯著降低（P＜0.05），且與FeCl2濃度正相關。因此FeCl2不利于甜菜紅素的穩(wěn)定性，當其超過0.10 mg/mL 時對甜菜紅素的顏色影響加劇。

圖6 FeCl2（0.00～1.00 mg/mL）對甜菜紅素溶液顏色的影響Fig.6 Influence of FeCl2（0.00-1.00 mg/mL）on the color of betacyanins solution

圖7 FeCl2 對甜菜紅素溶液色度值（a）L*、（b）a*、（c）b*和（d）ΔE 的影響Fig.7 Influence of FeCl2 on the chromaticity values（a）L*，（b）a*，（c）b* and（d）ΔE of betacyanins solution

圖8 FeCl2 對甜菜紅素溶液538 nm 處吸光值的影響Fig.8 Influence of FeCl2 on absorbance value of betacyanins solution at 538 nm

3 結論

紅肉火龍果果皮廢棄物可作為甜菜紅素的良好來源，其優(yōu)化提取條件為：采用蒸餾水提取，料液比1∶5，pH=5，在30 ℃下提取60 min；提取物中甜菜紅素的含量為95.2 mg/g。提取物中含有6 種甜菜紅素單體，以丙二酰甜菜苷和甜菜苷為主，二者分別占比達46.49%和34.35%。CuSO4和FeCl2的存在不利于甜菜紅素穩(wěn)定性；即使0.05 mg/mL CuSO4也會造成溶液顏色變化和A538nm值降低，當超過0.10 mg/mL FeCl2存在時會導致甜菜紅素溶液顏色變色加劇。故在以甜菜紅素為主要呈色劑/著色劑的食品加工貯藏中應盡量避免與銅制、鐵制器具接觸。