咸蛋清中幾種重要蛋白質(zhì)的提取和純化

白 菁，紀(jì)勝男，鄒 婕，黃 茜

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 國(guó)家蛋品加工技術(shù)研究中心 武漢 430070）

咸鴨蛋是新鮮鴨蛋在高鹽環(huán)境下腌制而得的中國(guó)特色傳統(tǒng)食品，因口味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而深受人們的喜愛(ài)。近年來(lái)，隨著食品的不斷創(chuàng)新，咸鴨蛋不僅作為輔味食品出現(xiàn)在餐桌上，油黃沙潤(rùn)的咸蛋黃還隨著咸蛋黃月餅、咸蛋黃青團(tuán)、咸蛋黃粽子等產(chǎn)品的“走紅”而消耗量倍增。然而，咸蛋清中的鹽分含量較高，咸蛋清中高達(dá)10%的蛋白質(zhì)未得到較好的利用。少部分咸蛋清會(huì)以較低比例摻入鮮蛋清中加工成為低端產(chǎn)品或簡(jiǎn)單脫鹽后作為飼料出售，加工方式粗放，造成大量高活性蛋白質(zhì)的損失和浪費(fèi)，不利于蛋品的精深加工，且大部分咸蛋清被直接丟棄并腐敗、發(fā)酵，對(duì)環(huán)境造成一定污染[1]。咸蛋清的有效利用和合理處理，成為食品工業(yè)亟待解決的問(wèn)題。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于咸蛋清的研究利用較少，主要集中在功能特性的利用、蛋白質(zhì)和生物活性肽的提取、脫鹽技術(shù)3 個(gè)方面[2]。咸蛋清因具有含鹽量高、乳化、凝膠、起泡等特性，可直接加至食品原料中以改善食品特性[3]。肖功年、Tan、王智云等[4-6]憑借咸蛋清較好的乳化性和凝膠性質(zhì)，將其分別添加到魚(yú)糜制品、面條、豆腐中，以改善食品的凝膠硬度、保水性和口感。除了良好的功能特性外，咸蛋清中還含有許多優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，如溶菌酶、卵白蛋白、卵類(lèi)黏蛋白、卵黏蛋白等。溶菌酶能夠水解革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，是一種天然、安全的殺菌劑和防腐劑，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域[7]。卵白蛋白在蛋白質(zhì)分析中被廣泛用作標(biāo)準(zhǔn)蛋白，其水解肽具有增強(qiáng)免疫、抗氧化等生物活性功能[8]。卵類(lèi)黏蛋白作為胰蛋白酶抑制劑，可用于有效傳遞胃腸敏感藥物[9]。卵黏蛋白是一種糖蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[10]。充分利用廢棄的咸蛋清資源，從中分離、提取有用蛋白質(zhì)，可減少環(huán)境污染，同時(shí)提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

目前，提取咸蛋清中的蛋白質(zhì)主要集中在溶菌酶上。崔春等[11]通過(guò)酸、熱處理沉淀蛋清蛋白，經(jīng)離心、過(guò)濾和超濾、冷凍干燥獲得溶菌酶，該方法未提及溶菌酶的得率和純度。Yang 等[12]采用陰離子多糖從5 倍稀釋的咸蛋清中分離溶菌酶，回收率僅為60%～65%。Ding 等[13]發(fā)明一種以L(fǎng)-甲狀腺素為親和配基的再生型親和沉淀劑，從咸鴨蛋清中純化出溶菌酶，回收率為94.32%，該方法使用的親和培基價(jià)格昂貴，成本較高。而從咸蛋清中分離其它蛋白質(zhì)尚未見(jiàn)研究報(bào)道。大部分單一蛋白質(zhì)的提取還是以蛋清為原料，其中卵白蛋白的分離方法主要有超濾法、電泳法、泡沫分餾法、液相色譜法[14]。這些方法分離過(guò)程較為復(fù)雜，很難擴(kuò)大規(guī)模推廣應(yīng)用。Abeyrathne 等[14]通過(guò)飽和硫酸銨和檸檬酸沉淀分離卵白蛋白，得到較高的純度并保留蛋白活性。卵類(lèi)黏蛋白有較好的熱穩(wěn)定性，曾有人嘗試通過(guò)加熱沉淀除去卵類(lèi)黏蛋白以外的蛋白質(zhì)，然而，該方法僅能有效分離卵類(lèi)黏蛋白這樣的單一蛋白，剩余蛋白質(zhì)在此過(guò)程中發(fā)生變性，未得到較好的利用[15]。Tanabe 等[16]使用25%乙醇從蛋清中分離卵類(lèi)黏蛋白，回收率約70%，其純度未報(bào)道。史曉霞[17]采用TCA-丙酮法粗分離，DEAE-32 離子交換層析法純化的方法制備卵類(lèi)黏蛋白，回收率僅23.8%，純度為95.3%。卵黏蛋白是蛋清中的高活性糖蛋白，其高黏性是維持新鮮雞蛋膠體特性的重要因素，可以用等電沉淀法、柱凝膠過(guò)濾、電泳法等方法提取出來(lái)，其中等電點(diǎn)沉淀法是最有效的分離卵黏蛋白的方法[15]。然而，這些方法都是從蛋清中分離單一蛋白質(zhì)，未實(shí)現(xiàn)連續(xù)分離，且均為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，很難工業(yè)化生產(chǎn)。

本研究設(shè)計(jì)出一種可以聯(lián)合提取咸蛋清中幾種主要蛋白質(zhì)，且操作簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化生產(chǎn)的分離方法，為蛋品資源利用率的提高提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咸鴨蛋蛋清，湖北神丹健康食品有限公司提供；濃鹽酸、檸檬酸、硫酸銨、無(wú)水乙醇、考馬斯亮藍(lán)R250 等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；SDS-PAGE 試劑盒，武漢市谷歌生物有限公司；SDS-PAGE 上樣緩沖液，碧云天生物技術(shù)；蛋白Marker，美國(guó)Thermo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22N 型高速冷凍離心機(jī)，株式會(huì)社日立制作所；DYY-12 電泳儀、雙垂直電泳槽，北京六一儀器廠；GELDOC2000 型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD 公司；ALPHA1-4 型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ 公司；FSH-2A 型高速分散器，中國(guó)化工儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 咸蛋清樣品預(yù)處理 由于本試驗(yàn)所用咸蛋清樣品為生產(chǎn)工廠流水線(xiàn)分離所得，或殘留有未徹底分離的蛋黃混入咸蛋清中，使得咸蛋清液呈橙黃色并伴有上浮油狀物，為提高分離效率和蛋白純度，需在分離蛋白前除去油狀物。加入純水稀釋離心，過(guò)濾除去油狀物，將上清液與沉淀均質(zhì)，待用。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳 使用SDS-PAGE試劑按照標(biāo)準(zhǔn)，制作體積分?jǐn)?shù)為12%的分離膠和體積分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠，插入電泳梳子，加入現(xiàn)配電泳緩沖液（Tris，甘氨酸，SDS）液封。取80 μL樣品溶液加20 μL SDS-PAGE 上樣緩沖液于1 mL 離心管中混勻，上樣前沸水煮5 min。上樣量為10 μL，放入雙垂直電泳槽，加入電泳緩沖液，在恒流條件下，濃縮膠電壓為80 V，經(jīng)過(guò)濃縮膠和分離膠交界處后，分離膠電壓調(diào)節(jié)至120 V。電泳結(jié)束后，取下膠片，依次置于固定液中固定30 min 以上，考馬斯亮藍(lán)染色液中染色30～40 min，脫色液中振蕩脫色，直至背景色脫去。獲得膠片利用凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

1.3.3 卵黏蛋白、卵白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白的分離用1 mol/L 的HCl 和檸檬酸調(diào)節(jié)預(yù)處理后的均質(zhì)液的pH 值，沉淀離心，將沉淀水洗脫鹽后，冷凍干燥得到卵黏蛋白。

用4%（NH4）2SO4和2%檸檬酸組合鹽沉淀分離卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，除去卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的上清液中富含卵白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白。

向除去卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的上清液中分別加入終體積分?jǐn)?shù)為20%，30%，40%的無(wú)水乙醇，沉淀分離卵白蛋白，將沉淀用純水水洗3 次脫醇脫鹽后冷凍干燥、分離的上清液，超濾脫醇脫鹽濃縮后，冷凍干燥。

根據(jù)蛋清中各種蛋白的含量百分比，計(jì)算各蛋白的理論含量值，計(jì)算卵黏蛋白、卵白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白的產(chǎn)率。用凝膠成像分析電泳凝膠，根據(jù)蛋白條帶的密度來(lái)計(jì)算蛋白純度。

1.3.4 卵白蛋白的復(fù)溶 將醇沉卵白蛋白配成2 mg/mL 的溶液，并調(diào)節(jié)pH 值，測(cè)試能使卵白蛋白復(fù)溶的最佳pH 值，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察蛋白質(zhì)是否被水解。

1.3.5 蛋清液起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定 通過(guò)An 等[18]的方法測(cè)定起泡性能，稍加修改。用FSH-2A 型高速分散器，采用攪打法，以6 000 r/min 轉(zhuǎn)速對(duì)蛋清溶液進(jìn)行攪打，持續(xù)2 min，記錄攪打后的泡沫初始體積和靜置30 min 后的泡沫體積，按照下式計(jì)算蛋清的起泡性（FAI）和泡沫穩(wěn)定性（FS）：

式中：V0——攪打后泡沫初始體積，mL；Vt——靜置30 min 時(shí)的泡沫體積，mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)均一式3 份，每個(gè)樣品均一式2 份進(jìn)行分析測(cè)定。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并使用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行分析（P＜0.05）以評(píng)估結(jié)果的顯著性。使用SPSS 軟件（版本19.0）通過(guò)Duncan 的多范圍測(cè)試比較數(shù)據(jù)。使用Origin軟件（版本8.5）繪制圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾種蛋清的電泳對(duì)比

將咸蛋清樣品與新鮮雞蛋蛋清、新鮮鴨蛋蛋清、實(shí)驗(yàn)室供咸蛋清，按照1.3.2 節(jié)的方法做電泳對(duì)照。觀察圖1 中的蛋白印跡，咸蛋清與對(duì)照蛋清中均有較為清晰的卵黏蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白、卵類(lèi)黏蛋白、溶菌酶條帶。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)鴨蛋中卵黏蛋白的含量多于雞蛋中卵黏蛋白的含量，而卵轉(zhuǎn)鐵蛋白與溶菌酶在鴨蛋中的含量明顯少于雞蛋。綜上，選定卵黏蛋白、卵白蛋白、卵類(lèi)黏蛋白為主要分離蛋白。

圖1 蛋清對(duì)比電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of egg white contrast

咸蛋清樣品（泳道5、9）在130 ku 左右多存在一條蛋白印跡，質(zhì)譜測(cè)試該蛋白為蛋黃中卵黃素?；?yàn)闅埩舻牡包S中物質(zhì)，故擬對(duì)咸蛋清進(jìn)行預(yù)處理，分離蛋黃殘留物。

2.2 卵黏蛋白的分離

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的蛋清液的pH 值分別調(diào)節(jié)至3，4，5，6，8，9，10，觀察各條件下的卵黏蛋白分離情況；同時(shí)分別用HCl 和檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值，試驗(yàn)用不同的酸處理是否會(huì)對(duì)卵黏蛋白的分離產(chǎn)生影響；獲得的卵黏蛋白沉淀用1、2、3、4、5 倍純水進(jìn)行水洗，觀察沉淀水洗后的雜蛋白含量，綜合選擇分離卵黏蛋白的最佳條件。結(jié)果如下：

卵黏蛋白在沉淀時(shí)，有可能會(huì)與其它蛋白質(zhì)，特別是溶菌酶結(jié)合在一起。由圖2 中蛋白印跡分析中可以看到，當(dāng)分離條件為pH=8，9，10 時(shí)，接近溶菌酶等電點(diǎn)，卵黏蛋白沉淀中混有部分溶菌酶，影響了卵黏蛋白的純度。由于卵黏蛋白的等電點(diǎn)為4.75～5.0，當(dāng)pH 值調(diào)節(jié)至其等電點(diǎn)附近時(shí)，中和了卵黏蛋白的大部分表面電荷，通過(guò)4 000 r/min 的離心便可以容易的將卵黏蛋白與其它蛋白質(zhì)分離開(kāi)[14]。從圖3 中可以看到，用HCl 調(diào)節(jié)pH值獲得的卵黏蛋白（泳道7）比用檸檬酸調(diào)節(jié)獲得的卵黏蛋白（泳道6）濃度更高，水洗除去沉淀中帶有的卵白蛋白、卵類(lèi)黏蛋白等水溶性蛋白，對(duì)比可以看到使用HCl 調(diào)節(jié)pH 值可以獲得純度更高的卵黏蛋白，效果好于檸檬酸。因?yàn)槁佯さ鞍资且环N纖維狀蛋白質(zhì)，沉淀得到的卵黏蛋白呈面筋狀[19]，在水中溶解度極小，而卵黏蛋白的沉淀中會(huì)含有少量的卵白蛋白、卵類(lèi)黏蛋白等水溶性蛋白，因此用純水清洗沉淀，可以有效除去水溶性蛋白，而不使卵黏蛋白產(chǎn)生損失，相比其它純化方法，可以更加簡(jiǎn)便有效的獲得濃度較高的卵黏蛋白。從圖4中可以看到，低倍數(shù)水洗的沉淀中，仍存在有部分水溶性蛋白未被完全洗去，而用5 倍純水水洗卵黏蛋白沉淀時(shí)，因?yàn)榧兯w積較大，從而可以在溶解較多的水溶性蛋白后仍保持低蛋白濃度，達(dá)到盡可能減少卵黏蛋白中雜蛋白的目的，獲得純度較高的卵黏蛋白。

圖2 pH 值對(duì)卵類(lèi)黏蛋白分離影響的電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of the effect of pH conditions on the separation of ovomucin

圖3 酸的種類(lèi)對(duì)卵黏蛋白分離影響的電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of the effect of acid selections on the separation of ovomucin

圖4 沉淀水洗倍數(shù)對(duì)卵黏蛋白純度影響的電泳圖Fig.4 SDS-PAGE of the effect of DW vol of precipitation on the purity of ovomucin

選擇用HCl 調(diào)節(jié)預(yù)處理后的咸蛋清液的pH=5，離心沉淀，用5 倍純水水洗沉淀，沉淀凍干后獲得卵黏蛋白，水洗液轉(zhuǎn)入上清液中，進(jìn)行后續(xù)的蛋白分離，減少損失。相比于張立斌等[19]提出的，先后在咸蛋清中加入15 mol/L 的鹽和蛋水比為1 ∶14 的鹽水，再在25 ℃下反應(yīng)分離3 h 和柱色譜分離法等方法，本試驗(yàn)方法的操作步驟更為簡(jiǎn)單，且對(duì)試驗(yàn)環(huán)境的要求較低，能夠更加快速的分離出純度較好、產(chǎn)率較高的卵黏蛋白（產(chǎn)率和純度＞80%）。

2.3 硫酸銨沉淀法去除卵轉(zhuǎn)鐵蛋白

選取4%，5%，6%的（NH4）2SO4和2%，2.5%，3%的檸檬酸進(jìn)行正交組合，根據(jù)電泳印跡，觀察卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離較好的鹽組合，結(jié)果如下：

本試驗(yàn)中使用低濃度的硫酸銨和檸檬酸組合沉淀卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，來(lái)代替酸環(huán)境下使用高濃度硫酸銨來(lái)沉淀卵白蛋白的分離方法[20]，能夠留下包含著可溶卵白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白的上清液。根據(jù)圖5 中的蛋白印跡，可以發(fā)現(xiàn)，向上步分離得到的上清液中加入4.0%（NH4）2SO4和2.0%檸檬酸組合后，能夠盡可能的除去卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，且不會(huì)連帶損失過(guò)多的卵白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白。檸檬酸的加入有助于硫酸銨沉淀卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的原因，可能是檸檬酸的加入降低了蛋清液的pH 值，接近了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的等電點(diǎn)（6.0），使得卵轉(zhuǎn)鐵蛋白沉淀分離[15]。

圖5 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白沉淀組合電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of ovotransferrin precipitation combination

卵黏蛋白的上清液中加入4.0%（NH4）2SO4和2.0%檸檬酸來(lái)沉淀卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，為后續(xù)卵類(lèi)黏蛋白和卵白蛋白的分離減少雜蛋白干擾。這種分離方法比其余的方法中所需要的硫酸銨使用量少很多[21]，且咸蛋清中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白含量少于新鮮雞蛋中的含量，能夠方便有效的除去卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，在大規(guī)模工業(yè)化擴(kuò)大試驗(yàn)中，更為便捷，可以有效降低成本。

2.4 卵白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白的分離

Abeyrathne 等[15]曾嘗試向蛋清液中加入43%的乙醇，沉淀除了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵類(lèi)黏蛋白以外的大部分蛋白，再向分離得到的上清液中加入高濃度的硫酸銨和檸檬酸組合，逐步分離獲得有較高純度和產(chǎn)率的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵類(lèi)黏蛋白。借鑒此方法，向獲得的富含卵白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白的上清液中加入無(wú)水乙醇，達(dá)到分離卵白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白的目的。在100 g 混合上清液中分別加入20%，30%，40%的無(wú)水乙醇，分析卵白蛋白的分離效果。結(jié)果如下：

根據(jù)圖6 中的蛋白印跡，可以看到加入終濃度為20%的乙醇時(shí)，上清液中仍有少量的卵白蛋白未能完全分離。而加入終體積分?jǐn)?shù)為30%和40%的乙醇后，上清液中無(wú)殘留卵白蛋白印跡，均可以達(dá)到較好的分離效果。根據(jù)表1 中卵白蛋白沉淀的質(zhì)量，也可以看到加入終體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇后，便可基本沉淀溶液中的卵白蛋白。

表1 乙醇沉淀卵白蛋白Table 1 Precipitation of ovalbumin with ethanol

圖6 卵白蛋白沉淀電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of sup-optimization of ovalbumin precipitation

因此只需向上一步分離得到的上清液中加入終體積分?jǐn)?shù)為30%的無(wú)水乙醇，便可較好的分離卵類(lèi)黏蛋白和卵白蛋白，將獲得的上清液超濾脫醇脫鹽濃縮，冷凍干燥，得到卵類(lèi)黏蛋白；沉淀多次水洗脫醇脫鹽，冷凍干燥，獲得的卵白蛋白。Abeyrathne 等[15]將除去溶菌酶、卵黏蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的蛋清上清液，超濾脫鹽濃縮，利用卵白蛋白較好的耐熱性，加熱沉淀其余蛋白質(zhì)，以達(dá)到分離上清液中卵白蛋白的目的。然而加熱沉淀的蛋白質(zhì)中，含有其它雜蛋白，導(dǎo)致純度受到一定的影響。相比較而言，本試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便，可以較快分離純度較高的卵類(lèi)黏蛋白和卵白蛋白（純度分別為98.5%和92.7%）。

2.5 蛋白分離結(jié)果分析

綜上，將咸蛋清預(yù)處理除去油狀物后，先用HCl 調(diào)節(jié)蛋清液pH=5，離心分離沉淀，沉淀用5倍水洗后冷凍干燥得到卵黏蛋白；上清液中加入4.0%（NH4）2SO4和2.0%檸檬酸組合鹽沉淀除去卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，再向上清液中加入終濃度為30%的無(wú)水乙醇，離心后，上清液超濾脫醇脫鹽，冷凍干燥得到卵類(lèi)黏蛋白，沉淀多次水洗后脫醇脫鹽，冷凍干燥得到卵白蛋白。

根據(jù)表2 中數(shù)據(jù)，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下，卵類(lèi)黏蛋白的產(chǎn)率＞76%，卵白蛋白的產(chǎn)率＞98%，卵黏蛋白的產(chǎn)率＞83%。根據(jù)圖7 聚丙烯酰胺電泳凝膠印跡顯示，卵類(lèi)黏蛋白和卵白蛋白的蛋白純度＞90%，卵黏蛋白的蛋白純度＞89%。圖7 中可以看到各分離步驟分離效果較好，且凍干樣電泳圖顯示蛋白印跡純度較高。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)蛋白分離流程基本可以實(shí)現(xiàn)從咸蛋清樣品中連續(xù)分離出產(chǎn)率較高，純度較好的卵黏蛋白、卵白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白。相較于其它分離方法，本試驗(yàn)方法基于低化學(xué)水平，分離方法更加簡(jiǎn)便，適于擴(kuò)大規(guī)模，應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)中。

表2 蛋白分離結(jié)果Table 2 Result of protein separation

圖7 蛋白分離電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of result of protein separation

2.6 醇沉卵白蛋白的復(fù)溶

由于醇沉卵白蛋白過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)和氫鍵等次級(jí)鍵作用有影響，因此嘗試在堿條件下復(fù)溶卵白蛋白，測(cè)試能夠使其復(fù)溶的最佳條件。結(jié)果如下：

從圖8a 中可以看到調(diào)節(jié)pH 值至12.5，13.0，13.5 時(shí)，卵白蛋白均能夠較好的溶解，復(fù)溶液澄清。將復(fù)溶液于4 ℃下靜置5 d，再次取樣電泳，得到圖8b，可以看到，pH=13.0 和13.5 的復(fù)溶液發(fā)生不同程度的水解，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，而pH=12.5 的復(fù)溶液有較好的穩(wěn)定性，大部分蛋白未被水解。根據(jù)張英君對(duì)咸蛋清酶解條件的研究[22]，在相同的溫度、NaOH 濃度下，蛋白質(zhì)的水解程度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，因此，pH=13.0 和13.5 的復(fù)溶液隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，而被逐漸水解；同時(shí)在相同的溫度、反應(yīng)時(shí)間下，蛋白質(zhì)的水解程度隨NaOH 濃度的增大而增大。

圖8 醇變性卵白蛋白復(fù)溶液電泳圖Fig.8 SDS-PAGE of alcohol-denatured ovalbumin redissolution

因此選擇pH=12.5 作為醇沉卵白蛋白的復(fù)溶條件，便于得到的卵白蛋白的進(jìn)一步研究。而將pH=12.5 的復(fù)溶液在溶解后中和回pH=9 時(shí)，可以延長(zhǎng)水解時(shí)間。

2.7 醇沉卵白蛋白復(fù)溶液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性

采用1.3.5 節(jié)中的方法測(cè)定卵白蛋白復(fù)溶液的起泡性和泡沫穩(wěn)定性，并與新鮮雞蛋蛋清、咸蛋清樣品作對(duì)照。結(jié)果如下：

新鮮雞蛋清均質(zhì)后的泡沫，整體泡沫顆粒較大，泡沫表面較硬，可成型，泡沫消泡速度較慢，30 min 后泡沫無(wú)較大變化，穩(wěn)定性較高。咸蛋清均質(zhì)后的泡沫，泡沫由下向上顆粒逐漸變大，泡沫易破裂，消泡速度較快，30 min 后上層泡沫稀疏，部分破裂，穩(wěn)定性較差。卵白蛋白復(fù)溶液均質(zhì)后的泡沫，泡沫整體較為綿密，顆粒較小，表面較軟，落泡速度快，30 min 后表面部分泡沫破裂，穩(wěn)定性較差。

根據(jù)表3 和圖9，咸蛋清的起泡性較差或是因?yàn)橄痰扒逯泻}量較高，會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解度，表面剛性等，對(duì)蛋白質(zhì)的起泡性有抑制作用[23]，同時(shí)，咸蛋清中混有殘留的脂類(lèi)，會(huì)吸附在泡沫與空氣的界面上，導(dǎo)致泡沫因壓力不平衡而破裂，蛋白質(zhì)的起泡性與泡沫穩(wěn)定性隨著蛋白質(zhì)中脂類(lèi)含量的增加而線(xiàn)性降低，即呈負(fù)相關(guān)[24]。而復(fù)溶液的起泡性較好，但是泡沫穩(wěn)定性較差，是因?yàn)榈扒宓钠鹋菪灾饕蕾?lài)于卵白蛋白和溶菌酶[25]，泡沫穩(wěn)定性主要依賴(lài)于卵黏蛋白[26]，而復(fù)溶液中缺少有高度黏性、在蛋清中能夠維持濃厚蛋白穩(wěn)定性的卵黏蛋白。

表3 起泡性（FAI）及泡沫穩(wěn)定性（FS）對(duì)比Table 3 Comparison of foaming property and foam stability

圖9 卵白蛋白復(fù)溶液起泡性Fig.9 SDS-PAGE of foaming property of ovalbumin redissolution

3 結(jié)論

本試驗(yàn)根據(jù)咸蛋清中的蛋白質(zhì)組成，確定了分離的目標(biāo)蛋白，利用等電點(diǎn)沉淀、（NH4）2SO4和檸檬酸沉淀、乙醇沉淀的方法，從咸蛋清中依次連續(xù)分離得到卵黏蛋白、卵白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下，卵類(lèi)黏蛋白的產(chǎn)率＞76%，卵白蛋白的產(chǎn)率＞90%，卵黏蛋白的產(chǎn)率＞89%。根據(jù)聚丙烯酰胺電泳凝膠印跡顯示，卵類(lèi)黏蛋白和卵白蛋白的蛋白純度＞90%，卵黏蛋白的蛋白純度＞89%。通過(guò)蛋白分離流程獲得的變性卵白蛋白冷凍干燥粉，可于pH=12.5 下有較好的溶解性，且該卵白蛋白的復(fù)溶液具有較好的起泡性。希望能夠?yàn)楣S化等大規(guī)模咸蛋清處理提供新的思路，有效提高咸蛋清的利用率，減少蛋品資源的大量浪費(fèi)。