蚜蟲莫氏黑粉菌產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

紀(jì)晨雪，牛永武，許艷華，孫藝銘，楊巖曉，趙仁勇

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院 鄭州 450000）

脂肪酶（Triacylglycerol acylhydrolases，EC 3.1.1.3）屬于羧基酯水解酶類，作用于?；视偷聂人狨ユI，可以水解甘油三酯生成脂肪酸和甘油[1-2]，廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、皮革等領(lǐng)域。大量研究表明，脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物組織中。與動(dòng)植物合成脂肪酶相比，微生物合成脂肪酶具有種類豐富，生產(chǎn)成本低，溫度和pH 值適應(yīng)范圍廣，穩(wěn)定性高，底物選擇性強(qiáng)，有機(jī)溶劑耐受度好等優(yōu)良特點(diǎn)[3]。同時(shí)，生產(chǎn)脂肪酶的微生物具有繁殖快、生長(zhǎng)周期短且不受季節(jié)影響等優(yōu)點(diǎn)，適合用于工業(yè)化生產(chǎn)[4-7]。微生物生產(chǎn)脂肪酶已成為當(dāng)前市售脂肪酶的主要來源。為滿足脂肪酶應(yīng)用領(lǐng)域的多種消費(fèi)需求，研究人員主要圍繞脂肪酶菌株的挖掘、產(chǎn)酶條件優(yōu)化、菌株基因改造等方面展開研究。盧鑫[8]將米根霉脂肪酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，添加共表達(dá)伴侶蛋白，結(jié)果脂肪酶活提高了1.7 倍。錢忠英等[9]利用同源重組方式將疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶基因整合到畢赤酵母中，篩選并純化得到一個(gè)具有高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子的菌株。李牧[10]將嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌脂肪酶基因在重組大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，脂肪酶活較野生菌株提高了3.3 倍。景智波等[11]通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分，結(jié)果顯著提高了乳酸菌脂肪酶活。Abu 等[12]將耐熱細(xì)菌脂肪酶基因?qū)氘叧嘟湍钢羞M(jìn)行表達(dá)，同時(shí)利用響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，脂肪酶活提高了3 倍。吳蓉等[13]將南極假絲酵母脂肪酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)和發(fā)酵優(yōu)化，脂肪酶活提高了17.7 倍，是目前大腸桿菌生產(chǎn)脂肪酶的較高水平。孫建安[14]利用基因工程和發(fā)酵工程技術(shù)在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)脂肪酶，通過對(duì)碳源、氮源等培養(yǎng)基組分以及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終脂肪酶活提高了5.62 倍。

蚜蟲莫氏黑粉菌（Moesziomyces aphidis，M.aphidis）是一種能夠利用植物油作為單一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并且大量合成甘露糖赤蘚糖醇脂的菌株[15]，其可以高效利用和轉(zhuǎn)化甘油三酯。目前，蚜蟲莫氏黑粉菌的研究主要圍繞甘露糖赤蘚糖醇脂的合成和代謝調(diào)控展開，研究發(fā)現(xiàn)脂肪酶在合成甘露糖赤蘚糖醇脂過程中具有重要作用，而關(guān)于其脂肪酶的合成和酶學(xué)特性研究基本處于空白[16]。

基于此，本研究以蚜蟲莫氏黑粉菌為試驗(yàn)菌株，以脂肪酶活為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行單因素、Plackett-Burman、最陡爬坡和響應(yīng)面等試驗(yàn)，對(duì)合成脂肪酶的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高脂肪酶產(chǎn)量。本研究旨在拓寬脂肪酶生產(chǎn)菌株來源，挖掘蚜蟲莫氏黑粉菌工業(yè)化應(yīng)用潛力，為脂肪酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 蚜蟲莫氏黑粉菌（Moesziomyces aphidis，M.aphidis），本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）活化培養(yǎng)基（g/L）酵母浸粉3.0，麥芽浸粉3.0，葡萄糖10.0，蛋白胨5.0。

2）發(fā)酵培養(yǎng)基1（g/L）NaNO33.0，MgSO4·7H2O 0.3，KH2PO40.3，酵母浸粉1.00，葡萄糖40.0。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基2（g/L）NaNO33.0，MgSO4·7H2O 0.3，KH2PO40.3，酵母浸粉1.00，大豆油80.0 mL。

1.1.3 相關(guān)試劑 葡萄糖、乳糖、糊精、（NH4）2SO4、NH4NO3、CaSO4、MnSO4、FeSO4、MgSO4無水乙醇，津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；麥芽糖、蔗糖、果糖、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏均為生化級(jí)，北京奧博星生物試劑有限公司；可溶性淀粉、ZnSO4、Fe2（SO4）3、KH2PO4，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；橄欖油、阿拉伯膠，邁瑞爾生物試劑有限公司；吐溫-20、曲拉通-100 均為化學(xué)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司；酵母浸粉為化學(xué)純，安琪酵母股份有限公司；CuSO4，西隴化工股份有限公司；吐溫-80 化學(xué)純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸，洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；異丙醇，天津市東力化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCL），索萊寶試劑；對(duì)硝基苯酚（PNP），阿拉丁試劑；考馬斯亮藍(lán)G250，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；咪唑啉，麥克林試劑。上述試劑無特別說明均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PL1502-S 分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司；ZHJH-C1109C 超凈工作臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；YXQ-LS 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Vortex-2 Genie 渦旋振蕩器，美國(guó)Scientific Industries 公司；SevenEasy S20 pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；5424 高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；UV-2550紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海華燕醫(yī)療器械有限公司；ZQZY-C8振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；SPARK 酶標(biāo)儀，澳大利亞Tecan 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng) -80 ℃冰箱中取出液體甘油保存的菌株，取1.00 mL 接種至50.00 mL 活化培養(yǎng)基中（250 mL 錐形瓶），28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h。取1.00 mL 活化液接種到50.00 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中（250 mL 錐形瓶），28 ℃，180 r/min 培養(yǎng)7 d，獲得發(fā)酵液。發(fā)酵液在12 000 r/min 條件下離心5 min，收集上清液即為胞外粗脂肪酶液，用于測(cè)定脂肪酶活和蛋白含量。

1.3.2 脂肪酶活和蛋白含量的測(cè)定 脂肪酶活測(cè)定以對(duì)硝基苯粉棕櫚酸酯（p-NPP）為底物，根據(jù)Winkler 等[17]和趙敏潔等[18]的方法稍作修改。在2.00 mL 離心管中加入600.0 μL p-NPP 溶液，同時(shí)加入適當(dāng)稀釋的粗酶液25.0 μL，空白對(duì)照加入等量0.05 mmol/L Tris-HCl pH 8.0 緩沖液，70 ℃水浴反應(yīng)10 min，500.0 μL 無水乙醇終止反應(yīng)。12 000 r/min 條件下離心5 min，在410.0 nm 處測(cè)定吸光度值。定義：1 min 催化水解底物硝基苯粉棕櫚酸酯（p-NPP）生成1 μmol 對(duì)硝基苯酚（pNP）所需酶量為1 個(gè)酶活單位（U）[19]。蛋白含量測(cè)定采用Bradford 方法[20]。

1.3.3 生物量的測(cè)定 生物量的測(cè)定采用干重法，根據(jù)Amal Najjar 等[21]和蔡海鶯[22]的方法稍做修改。50.0 mL 離心管稱重m1（g），取2.00 mL 發(fā)酵液，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，棄上清，保留菌體。用蒸餾水洗滌2 次，60 ℃烘至恒重m2（g），稱重并計(jì)算生物量Bm（g/L）。

1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 初始培養(yǎng)基的確定和產(chǎn)酶曲線測(cè)定 查閱文獻(xiàn)可知，1.1.2 節(jié)中的3 種培養(yǎng)基常用于蚜蟲莫氏黑粉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵，測(cè)定3 種培養(yǎng)基中的脂肪酶活，選擇脂肪酶活最高的培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基。將蚜蟲莫氏黑粉菌接種至初始培養(yǎng)基中發(fā)酵144 h，每隔24 h 測(cè)定脂肪酶活，獲得產(chǎn)酶曲線。

1.3.4.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1）培養(yǎng)基成分 分別研究碳源、氮源、金屬離子、表面活性劑和誘導(dǎo)劑等培養(yǎng)基組分及其添加量對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌生長(zhǎng)和合成脂肪酶的影響，試驗(yàn)方案為：

選取葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉和糊精等7 種常用碳源，分別添加40.0 g/L，對(duì)比菌體生物量和脂肪酶活，明確脂肪酶活最高的碳源種類，進(jìn)一步研究該碳源添加量對(duì)脂肪酶活的影響。

選取NaNO3、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、（NH4）2SO4、NH4NO3、尿素、牛肉膏等8 種常見氮源，分別添加4.0 g/L，對(duì)比菌體生物量和脂肪酶活，明確脂肪酶活最高的氮源種類，進(jìn)一步研究該氮源添加量對(duì)脂肪酶活的影響。

選取Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+7 種金屬離子，均以硫酸鹽形式分別按不同濃度添加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，研究對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶活的影響。

選取吐溫-80、吐溫-20、咪唑啉、SDS、TX-100、阿拉伯膠等6 種常用表面活性劑，分別添加0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），測(cè)定菌體生物量和脂肪酶活，明確促進(jìn)脂肪酶合成的表面活性劑種類，進(jìn)一步研究該表面活性劑添加量對(duì)脂肪酶合成的影響。

選取橄欖油、葵花油、大豆油、玉米油、花生油、芝麻油等6 種常用誘導(dǎo)劑，分別添加2.0%，對(duì)比菌體生長(zhǎng)和脂肪酶活，明確脂肪酶活最高的誘導(dǎo)劑種類，進(jìn)一步研究該類誘導(dǎo)劑添加量對(duì)脂肪酶活的影響。

2）培養(yǎng)條件 研究初始接種量（2.0%，4.0%，6.0%，0.80%，10.0%）、裝液量（250 mL 錐形瓶中分別裝入10.0，30.0，50.0，70.0，90.0，110.0 mL）、初始pH（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0）和培養(yǎng)溫度（20.0，25.0，30.0，35.0，40.0，45.0 ℃）對(duì)菌體生長(zhǎng)和脂肪酶合成的影響，明確顯著影響脂肪酶合成的培養(yǎng)條件。

1.3.4.3 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）Plackett-Burman（PB）試驗(yàn) 針對(duì)上述對(duì)脂肪酶合成有影響的影響因素，利用Design Expert 10.0.7 軟件進(jìn)行PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出對(duì)脂肪酶合成最顯著的影響因素。

2）最陡爬坡試驗(yàn) 基于PB 試驗(yàn)篩選出的顯著影響因素，以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，逼近最大響應(yīng)值區(qū)域。

3）響應(yīng)面試驗(yàn) 通過最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大脂肪酶活區(qū)域后，基于Design Expert 10.0.7 軟件對(duì)關(guān)鍵因子進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定產(chǎn)脂肪酶的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始培養(yǎng)基的選擇及產(chǎn)酶曲線測(cè)定結(jié)果

將蚜蟲莫氏黑粉菌接種至3 種培養(yǎng)基中發(fā)酵144 h，每隔24 h 測(cè)定脂肪酶活，結(jié)果見圖1a?？梢钥闯?，發(fā)酵培養(yǎng)基1 中脂肪酶活最高，第6 天可達(dá)（27.66±0.7）U/mL。隨后在發(fā)酵培養(yǎng)基1 中接種后，每隔12 h 測(cè)定脂肪酶活，結(jié)果見圖1b。可以看出，168 h 后發(fā)酵液中脂肪酶活最高達(dá)（32.10±1.72）U/mL，且酶活隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)基本保持穩(wěn)定。因此，選取發(fā)酵培養(yǎng)基1 作為初始培養(yǎng)基，后續(xù)研究中均在培養(yǎng)7 d 后測(cè)定脂肪酶活。

圖1 培養(yǎng)基種類對(duì)脂肪酶合成的影響及產(chǎn)酶曲線測(cè)定Fig.1 Effects of medium types on lipase synthesis and determination of lipase production curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 碳源是微生物生長(zhǎng)代謝的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)脂肪酶的合成具有調(diào)控作用。研究7 種糖類碳源對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶活的影響，結(jié)果見圖2a。碳源為葡萄糖時(shí)，發(fā)酵液中脂肪酶活最高可達(dá)（36.82±0.05）U/mL。進(jìn)一步對(duì)葡萄糖添加量進(jìn)行研究，結(jié)果見圖2b?？梢钥闯?，葡萄糖添加量為（0.0～80.0）g/L 時(shí)，隨著添加量增加，發(fā)酵液中生物量不斷增加，脂肪酶活、蛋白含量和發(fā)酵后pH 值均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，表明葡萄糖添加量對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌的生長(zhǎng)代謝具有調(diào)控作用。其中，脂肪酶活在葡萄糖添加量為50.0 g/L 時(shí)達(dá)到最高，為（39.18±0.02）U/mL。因此，初步確定葡萄糖添加量為50.0 g/L。

圖2 碳源種類和添加量對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶的影響Fig.2 Effects of carbon source types and supplemental levels on lipase synthesis by M.aphidis

2.2.2 氮源對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 氮源直接影響微生物體內(nèi)蛋白酶的合成和活力，研究8 種氮源對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌生長(zhǎng)和合成脂肪酶活的影響，結(jié)果見圖3a。可以看出，有機(jī)氮源組的脂肪酶活均高于無機(jī)氮源組，與Maia 等[23]的研究結(jié)果一致。而硝酸鈉和酵母浸粉復(fù)配添加的初始培養(yǎng)基中脂肪酶活最高，進(jìn)一步探究硝酸鈉和酵母浸粉添加比例的影響，結(jié)果見圖3b?？梢钥闯?，硝酸鈉和酵母浸粉添加比例為1∶1～11∶1時(shí)，脂肪酶活先增加后保持穩(wěn)定，蛋白含量先增加后降低，生物量和發(fā)酵后pH 值基本不變。其中，硝酸鈉和酵母浸粉復(fù)配添加比例為3∶1 時(shí)，脂肪酶活最高達(dá)（40.22±0.05）U/mL。因此，初步確定培養(yǎng)基中氮源組成為硝酸鈉和酵母浸粉復(fù)配添加比例為3∶1。

圖3 氮源種類和添加量對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶的影響Fig.3 Effects of nitrogen source types and supplemental levels on lipase synthesis by M.aphidis

圖4 MgSO4 添加量對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶的影響Fig.4 Effects of MgSO4 supplementation on lipase synthesis by M.aphidis

2.2.3 金屬離子對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 探究7 種金屬離子對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶活的影響，結(jié)果見表1。與對(duì)照組比較，添加Ca2+、Mg2+、Mn2+或Zn2+均可以顯著提高發(fā)酵液的脂肪酶活，而添加Cu2+、Fe2+或Fe3+進(jìn)一步降低發(fā)酵液中脂肪酶活。其中，MgSO4添加量為300 mg/L 時(shí)，脂肪酶活最高，達(dá)（27.52±0.63）U/mL。進(jìn)一步探究MgSO4添加量對(duì)脂肪酶活的影響，結(jié)果見圖7?？梢钥闯觯琈gSO4添加量在0.00～0.60 g/L 時(shí)，發(fā)酵液中脂肪酶活、蛋白含量、生物量和發(fā)酵后pH 值均為先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)MgSO4的添加量為0.40 g/L 時(shí)，脂肪酶活最高，為（25.00±0.05）U/mL。因此，初步確定MgSO4添加量為0.40 g/L。

表1 金屬離子種類和濃度對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶活的影響Table 1 Effects of metal ion species and concentration on lipase activity of M.aphidis

2.2.4 表面活性劑對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 表面活性劑可以增加細(xì)胞膜的通透性從而加速氧氣在培養(yǎng)基中的傳遞，有利于微生物更好地合成并分泌胞外脂肪酶[24]。從非離子、兩性離子、陰離子和陽離子等4 類表面活性劑中選取具有代表性的種類，研究其對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶活性的影響，結(jié)果見圖5a?？梢钥闯?，添加吐溫-80 的發(fā)酵液脂肪酶活最高，為（35.55±0.05）U/mL。進(jìn)一步研究吐溫-80 添加量的影響，結(jié)果見圖5b。添加量在0.00%～0.35%時(shí)，脂肪酶活和蛋白含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，而生物量和發(fā)酵后pH 值無明顯變化。當(dāng)添加0.30%吐溫-80時(shí)，脂肪酶活最高，為（44.72±0.02）U/mL。因此，初步確定吐溫-80 的添加量為0.30%。

圖5 表面活性劑種類和添加量對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶的影響Fig.5 Effects of surfactant types and dosage on lipase synthesis by M.aphidis

2.2.5 誘導(dǎo)劑對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 脂肪酶分為結(jié)構(gòu)型脂肪酶和誘導(dǎo)型脂肪酶[25]，誘導(dǎo)劑能夠促進(jìn)誘導(dǎo)型脂肪酶的合成并提高酶活。研究誘導(dǎo)劑種類對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶活的影響，結(jié)果見圖6a。可以看出，花生油作為誘導(dǎo)劑時(shí)，脂肪酶活最高，為（36.77±0.02）U/mL。進(jìn)一步研究花生油添加量的影響，結(jié)果見圖6b?；ㄉ偷奶砑恿吭?.0%～6.0%時(shí)，脂肪酶活和蛋白含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，而生物量和發(fā)酵后pH 值呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)。當(dāng)花生油的添加量為2.0%時(shí)，脂肪酶活最高達(dá)（45.78±0.20）U/mL。因此，蚜蟲莫氏黑粉菌合成的脂肪酶可能屬于誘導(dǎo)型脂肪酶，初步確定花生油最佳添加量為2.0%。

圖6 誘導(dǎo)劑種類和添加量對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶的影響Fig.6 Effects of inducer type and amount on lipase synthesis by M.aphidis

2.2.6 培養(yǎng)條件對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌產(chǎn)脂肪酶的影響 分別研究接種量、初始pH 值、裝液量和溫度對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶活的影響，結(jié)果見圖7。從圖7a、7b 可以看出，接種量為2.0%～10.0%，初始pH 值為4.0～9.0 時(shí)，發(fā)酵7 d 后的脂肪酶活、生物量、發(fā)酵后pH 值無明顯差別。因此，后續(xù)PB 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)不考慮接種量、初始pH 值作為優(yōu)化因子。由圖7c 可知，250 mL 錐形瓶中裝液量在10.0～110.0 mL 時(shí)，發(fā)酵液中脂肪酶活、蛋白含量等呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。已有研究表明，裝液量主要影響培養(yǎng)液中的溶氧濃度，表明氧氣充足的條件更有利于蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶。然而，考慮到本研究發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)酵液蒸發(fā)損失較大，初步確定為30.0 mL的裝液量做進(jìn)一步研究。由圖7d 可知，在25.0～45.0 ℃范圍內(nèi)，脂肪酶活、蛋白含量以及發(fā)酵后pH 值均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。其中，25.0℃條件下所得發(fā)酵液中的脂肪酶活最高，為（49.99±0.05）U/mL。試驗(yàn)過程中觀察發(fā)現(xiàn)，蚜蟲莫氏黑粉菌在高于40.0 ℃及以上條件下基本不生長(zhǎng)，但測(cè)定生物量過高，主要原因是在生物量測(cè)定的烘干過程中，出現(xiàn)具有流動(dòng)性的黏稠液體，水分含量較大，導(dǎo)致測(cè)定值過高。因此，初步確定培養(yǎng)溫度為25.0 ℃。

圖7 培養(yǎng)條件對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶的影響Fig.7 Effects of culture conditions on lipase synthesis by M.aphidis

2.3 PB 試驗(yàn)結(jié)果

PB 試驗(yàn)是通過比較2 水平因素與整體差異性之間的顯著效果，從眾多因素中篩選出關(guān)鍵影響因素，大幅減少試驗(yàn)次數(shù)，提高試驗(yàn)響應(yīng)值的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[26]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)N=12[27-28]，對(duì)葡萄糖（A）、NaNO3（B）、酵母浸粉（D）、MgSO4（E）、花生油（G）、吐溫-80（H）、裝液量（J）、溫度（K）共8 個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)因素各取高、低2個(gè)水平，響應(yīng)值為脂肪酶活，另設(shè)3 個(gè)虛擬項(xiàng)考察試驗(yàn)誤差[29]，試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平和響應(yīng)值分別見見表2和表3。

表2 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 2 PB experimental design factor levels

表3 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)響應(yīng)值（N=12）Table 3 PB design and response values（N=12）

利用Design Expert 10.0.7 軟件對(duì)PB 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表4?？梢钥闯?，葡萄糖、吐溫-80、裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶具有負(fù)效應(yīng)，NaNO3、酵母浸粉、MgSO4、花生油、溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶具有正效應(yīng)。8 個(gè)因素對(duì)脂肪酶活的影響順序?yàn)椋篘aNO3＞溫度＞酵母浸粉＞裝液量＞葡萄糖＞吐溫-80＞花生油＞MgSO4。

表4 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素對(duì)脂肪酶活的影響情況Table 4 Effects of various factors on lipase activity in PB experimental design

本試驗(yàn)擬合的模型顯著，P=0.0013＜0.05，R2=0.9869，經(jīng)方差分析所得的回歸方程為：Y=29.16-4.68A+9.05B+7.73D+2.57G-3.70H-5.75J+8.63K。該模型的F 值為42.99，僅有0.13%的概率不能用該模型表示。表5 中所列因素，除了花生油，其它因素F 值均小于0.05，說明這些因素對(duì)模型影響顯著。其中最顯著的3 個(gè)因素為：NaNO3＞溫度＞酵母浸粉。

表5 PB 試驗(yàn)因素顯著性分析Table 5 Significance analysis of PB experimental factors

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面擬合模型只有在臨近最優(yōu)區(qū)域內(nèi)才能更準(zhǔn)確地反映模型的真實(shí)情況[30]，因此，利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最優(yōu)點(diǎn)附近區(qū)域并進(jìn)行模擬分析[31]。根據(jù)PB 試驗(yàn)所得的3 個(gè)最顯著因素：NaNO3、溫度、酵母浸粉，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，以脂肪酶活為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6?？梢钥闯?，脂肪酶活最大響應(yīng)值在第2 組與第4 組之間。因此，以第3 組條件為響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Experimental design and results of steepest climb

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

通過最陡爬坡試驗(yàn)逼近產(chǎn)脂肪酶活最高區(qū)域后，采用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken 設(shè)計(jì)法，對(duì)NaNO3添加量、溫度和酵母浸粉添加量等3 個(gè)關(guān)鍵因子設(shè)置3 個(gè)水平，編碼和對(duì)應(yīng)值見表7。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和各組脂肪酶活測(cè)定結(jié)果見表8。以脂肪酶活為響應(yīng)值，利用Design Expert 10.0.7 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合得到脂肪酶活與各因素變量的二次回歸模型：

表7 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平Table 7 Response surface design factors and levels

表8 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果Table 8 Response surface design results

回歸方程的方差分析和模型可信度分析見表9?？芍?，模型在α=0.01 水平上回歸顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型相符，模型建立正確。且一次項(xiàng)和平方和項(xiàng)對(duì)酶活均有顯著性影響。模型的決定系數(shù)R2=0.9973，變異系數(shù)C.V.%=1.91，說明擬合較好，較為真實(shí)地反應(yīng)各因素與脂肪酶活之間的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果可信。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Regression model variance analysis

2.6 響應(yīng)曲面分析

響應(yīng)面曲面圖是開口向下的凸面曲線，存在最高值，響應(yīng)面的陡峭程度反映了隨自變量的變化，曲線越陡峭，說明響應(yīng)值越靈敏[32]。等高線圖反映了兩因素的交互作用，呈圓形說明兩因素作用不顯著，呈橢圓形說明交互作用顯著。設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖8。可以看出，酵母浸粉和硝酸鈉、酵母浸粉和溫度的交互作用對(duì)脂肪酶活有顯著影響，而硝酸鈉和溫度的交互作用不顯著。進(jìn)一步利用軟件計(jì)算分析，預(yù)測(cè)脂肪酶活最高值為81.90 U/mL，此時(shí)培養(yǎng)溫度為25.8℃，硝酸鈉添加量為3.1 g/L，酵母浸粉添加量為2.24 g/L。

圖8 NaNO3、酵母浸粉和溫度對(duì)酶活影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of NaNO3，yeast extract and temperature on enzyme activity

2.7 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和有效性，對(duì)預(yù)測(cè)的最佳培養(yǎng)基組分和條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見表10?？芍?，驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)定脂肪酶活為（83.14±1.09）U/mL，比優(yōu)化前的發(fā)酵液中脂肪酶活提高約2.6 倍，且與模型預(yù)測(cè)值相差小于1.50%，說明響應(yīng)面優(yōu)化法能顯著提高蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶活，所得模型能夠真實(shí)反映所篩選關(guān)鍵因素對(duì)脂肪酶活的影響。

表10 最優(yōu)水平及驗(yàn)證結(jié)果Table 10 Optimal level and verification results

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和PB 試驗(yàn)篩選出對(duì)蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶活影響最顯著的3 個(gè)因素：NaNO3添加量、溫度、酵母浸粉添加量。利用最陡爬坡試驗(yàn)探究脂肪酶活的最大響應(yīng)值區(qū)域，確定響應(yīng)面的中心點(diǎn)。通過響應(yīng)面試驗(yàn)得到蚜蟲莫氏黑粉菌合成脂肪酶的最佳條件：NaNO3添加量為3.1 g/L，溫度為25.8 ℃，酵母浸粉添加量為2.24 g/L，此時(shí)脂肪酶活為（83.14±1.09）U/mL，比未優(yōu)化前提高了約2.6 倍。本研究對(duì)實(shí)現(xiàn)蚜蟲莫氏黑粉菌高效合成脂肪酶具有重要意義，為脂肪酶的提取純化、酶學(xué)特性和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。