超聲波加速陳化對湘柑茶品質的影響

李 想，潘兆平，付復華*，劉承鑫，王 琛，何 雙

（1 湖南省農業(yè)科學院農產品加工研究所 長沙 410125 2 湖南大學隆平分院 長沙 410125 3 果蔬貯藏加工與質量安全湖南省重點實驗室 長沙 410125 4 洞庭實驗室 長沙 410125 5 桂林理工大學化學與生物工程學院 廣西桂林 541000）

柑普茶是將陳皮與云南普洱熟茶結合，在普洱茶基礎上經過挖果、填茶、干燥等工藝制作而成一種微生物發(fā)酵茶[1]。它兼具水果和普洱茶的優(yōu)點，不僅具有陳皮的香醇口感和柚類特有果香，還具有普洱茶消炎殺菌、減肥降脂等功效[2-3]，深受消費者喜愛。湖南是柑橘種植大省，為了提高湖南柑橘資源與茶資源的綜合利用能力，戚賀亭等[4]和Qi 等[5]研究了湖南19 種柑橘的理化指標和加工適應性，最后選擇加工特性總分最高的金盆柚與云南普洱茶制成一種“湘式”柑普茶-湘柑茶。

無論是普洱茶還是陳皮，均有“愈陳愈好”“越陳越香”“陳久者良”之說[6-7]，因此只有貯藏超過3 年的湘柑茶才被視為合格。湘柑茶的自然陳化周期長，可能導致資金流轉不通、資源占用多且成本增加的問題。研究加速陳化可以縮短產品周期，降低成本，減少浪費，提高資源利用度。目前加速陳化的方法有物理法、化學法和生物法。其中物理法，如超聲催陳、超高壓催陳、輻照催陳和微波催陳等[8]，具有簡便、穩(wěn)定、清潔、高效、經濟等優(yōu)點而被廣泛使用。

超聲波的作用與聲空化有關，包括氣泡的生成和內爆破裂，引發(fā)極高的溫度和壓力，誘導某些化學反應并加快其反應速率[9-12]。超聲波在物理法加速陳化中，由于方便快捷、安全高等優(yōu)點而應用較多。Ma 等[13]利用超聲波技術處理鎮(zhèn)江醋，發(fā)現(xiàn)超聲處理的變化與自然陳化相似。超聲波加速陳化對柑普茶陳化過程有較好的促進作用，如鄭敏[14]以橙皮苷為研究對象，發(fā)現(xiàn)超聲波處理能增加其含量，達到加速陳化的目的。將超聲波加速陳化應用在湘柑茶中，還未見報道。本課題研究超聲加速陳化湘柑茶的最佳工藝，以及加速陳化對湘柑茶的主要化學成分與揮發(fā)性物質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金盆柚：（Citrus junos Sieb.ex Tanaka'yuzu'）選擇果皮未著色、生理未成熟、果實直徑4～4.5 cm 的金盆柚，湖南省岳陽縣惠泰云有限公司。

普洱熟茶：潤元昌勐海茶廠。

沒食子酸、蘆丁、橙皮苷（均為標準品），成都曼思特生物科技有限公司；福林酚，合肥博美生物科技有限公司；乙醇、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、環(huán)己酮、氯化鈉、甲醇（均為分析純），國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

Avanti J-26 XP 型高效離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；KQ-700DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；T6 新世紀型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Acquity 超高效液相色譜儀，美國Waters 公司；6890N-5973 型氣相色譜質譜儀（NIST08 譜庫），美國安捷倫公司；二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷萃取頭（DVB/PDMS，50/30 μm，65 μm），德國默克公司。

1.3 方法

1.3.1 湘柑茶的制備及樣品處理 湘柑茶制備工藝流程[5]：金盆柚清洗→頂部開口→取肉→洗皮→晾干→填茶→殺青→干燥→成品包裝。

操作要點：1）晾干：日曬至柑皮表面無水珠；2）填茶：普洱茶填入柑皮五分之四，普洱茶含水量＜10%；3）殺青：85 ℃殺青30 min；4）干燥：白天日曬，夜晚45 ℃輕烘，持續(xù)7 d。

樣品處理：將湘柑茶除去包裝，用真空包裝袋抽真空包裝，后進行超聲處理，超聲介質為水。處理好的湘柑茶經液氮急速冷凍后再機械粉碎，過45 目篩，真空包裝后于4 ℃貯藏待測。

1.3.2 超聲加速陳化優(yōu)化試驗 總黃酮作為陳皮和普洱茶中含量最高、最穩(wěn)定的重要活性成分，含量會隨著貯藏時間的延長而增加，可為湘柑茶“陳久者良”的說法提供科學理論依據(jù)[15-16]，因此本試驗以總黃酮含量作為陳化衡量指標。

1.3.2.1 單因素實驗 分別設置不同的超聲功率、超聲時間、超聲介質溫度，各因素固定值為超聲功率70 W，超聲時間35 min，超聲介質為水（40℃）。保持2 個因素不變，每次改變1 個因素，測定總黃酮的含量。

表1 OFAT 單因素實驗水平表Table 1 Factors and levels used in OFAT experiments

1.3.2.2 正交試驗 在單因素實驗結果的基礎上，以總黃酮含量為評價指標，選擇A 超聲功率、B 超聲時間、C 超聲溫度3 個因素進行三因素三水平的L9（34）正交試驗設計，以確定最佳超聲條件組合。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 主要化學成分的測定 總酚的測定參照《中華人民共和國國家標準 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313-2018）；

總黃酮的測定參照《食品中的總黃酮測定 分光光度法》（SZDB/Z 349-2019）；

橙皮苷的測定采用UPLC 法[4]，UPLC 條件：Waters Acquity UPLC BEH Ci 鍵合色譜柱（180 mm×2.1 mm×1.7 pirn）；流動相：甲醇（流動相A），水（流動相B）；洗脫條件：采用梯度洗脫，0～3 min，40%～45%流動相A；3～7 min，45%～40%流動相 A；7～50 min，40%流動相 A。流速 0.15 mL/min；進樣量2 μL；柱溫30 ℃；檢測波長283 nm；橙皮苷標準曲線方程為：y=13283x+8021.7，R2=0.9999。

1.3.3.2 揮發(fā)性成分測定

1）HS-GC-MS 檢測條件 參照文獻[17]。取3.00 g 樣品移入20 mL 頂空進樣瓶中，加入6 mL飽和氯化鈉溶液和20 μL 的內標物環(huán)己酮（0.1894 g/mL，乙醇稀釋）后，立即用聚四氟乙烯隔墊密封，60 ℃水浴5 min，頂空萃取30 min，插入老化好的萃取頭，于250 ℃的氣相色譜進樣器中無分裂解吸5.5 min。

2）質譜條件[18]電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度230 ℃；母離子m/z 285；激活電壓1.5 V；質量掃描范圍m/z 35～550。

通過質譜與標準NIST 08 文庫的保留指數(shù)比較，采用內標法計算揮發(fā)性化合物含量[19]。

1.3.3.3 感官評價 沸水醒茶10 s 后倒掉，按茶/水：1 g/50 mL 的比例用煮茶器煮茶20 min 后進行感官評價。組成20 人評定小組（男女各10 人），對湯色（20 分），香氣（30 分），滋味（30 分）和接受度（20 分）進行評定[4]，具體評價標準見表2。

表2 湘柑茶感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of Xianggan teas

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用IBM SPSS Statistics 23 軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA 方差分析（P＜0.05 表示有統(tǒng)計學差異），采用Origin 2021 軟件作圖；所有試驗平行3次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 超聲條件優(yōu)化

2.1.1 超聲功率的篩選 超聲功率對湘柑茶總黃酮的影響如圖1 所示。由圖1 可知，隨著超聲功率的增加，總黃酮的含量呈先增加后減少的趨勢，當超聲功率為70W 時，總黃酮達到了最高為（3.945±0.073）g/100 g。其原因可能是超聲功率的增加會使樣品中的酚類物質轉化為黃酮類物質，而超聲功率過高，加劇產生的空化效應導致了黃酮類物質的環(huán)鏈鍵斷開，造成黃酮類物質的損失分解[20-22]。因此，最適超聲功率為70 W。

圖1 超聲功率對總黃酮的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on total flavonoids

2.1.2 超聲時間的篩選 超聲時間對湘柑茶總黃酮含量的影響如圖2 所示，隨著超聲時間的增加，總黃酮的含量呈增加趨勢，并在65 min 時總黃酮的含量最高，之后隨著時間的增加樣品總黃酮含量降低。超聲作用時間過長，會使樣品中的黃酮結構遭到破壞，影響黃酮穩(wěn)定性。因此，選擇的超聲時間為65 min。

圖2 超聲時間對總黃酮的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on total flavonoids

2.1.3 初始溫度的篩選 試驗分別在20，30，40，50，60 ℃條件下進行，由圖3 可知，湘柑茶在初始超聲溫度為30 ℃時總黃酮的含量最高，大于30℃溫度下樣品總黃酮的量開始降低，可能是過高的溫度會使黃酮結構破壞分解，因此試驗中選擇超聲初始溫度為30 ℃。

圖3 超聲溫度對總黃酮的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on total flavonoids

2.1.4 正交試驗結果 在單因素試驗的基礎上，以總黃酮的含量為指標，選擇超聲功率（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）為考察因素進行三因素三水平的正交試驗，試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 超聲加速陳化條件優(yōu)化正交試驗設計與結果Table 3 Design and results of optimizing orthogonal test of ultrasonic acceleration of aging conditions

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 ANOVA analysis of orthogonal test results

由表3 可知，8 號試驗組合（A2B1C2）總黃酮含量最高，為（3.516±0.03）g/100 g，根據(jù)極差分析可知，影響總黃酮含量的因素主次順序為C＞A＞B，即超聲溫度＞超聲功率＞超聲時間；最優(yōu)超聲加速陳化工藝組合為A2B1C2，即超聲功率為70 W、超聲時間55 min、超聲溫度30 ℃。由表4 可知，超聲溫度對總黃酮含量影響顯著（P＜0.05），方差分析結果與極差分析結果一致。在最優(yōu)條件下進行3次平行驗證試驗，總黃酮含量平均為（4.011±0.10）g/100 g，高于試驗組。因此，確認最優(yōu)超聲加速陳化工藝組合為A2B1C2，即超聲功率為70 W、超聲時間55 min、超聲溫度30 ℃。

2.2 主要化學成分研究

在最優(yōu)超聲條件下對湘柑茶進行加速陳化試驗，得到主要化學成分含量如圖4 所示。由圖可見超聲處理的湘柑茶總多酚含量僅僅增加了4.48%，其結果與龔淑英等[23]在常溫下貯藏，初始含水量為7%貯藏45 d、含水量12%貯藏90 d 的普洱茶總多酚含量增加量相似。他們認為總多酚在貯藏過程中含量較穩(wěn)定、變化不明顯，但在普洱茶在貯藏初期中，多酚含量有一個緩慢上升的過程。經過超聲處理的湘柑茶中總黃酮和橙皮苷均有顯著性增加（P＜0.05），其中總黃酮含量增加了22.63%，橙皮苷增加了11.11%，與劉素娟[24]研究變化趨勢相似，隨著貯藏時間的增加，陳皮的總黃酮和橙皮苷均呈增加趨勢，在劉的研究中，陳皮貯藏12 個月時，總黃酮含量增加了25%左右、橙皮苷含量增加了約9%。結果表明，超聲處理能加速湘柑茶陳化，本試驗加速效果與普通陳化1 年左右相當。

圖4 不同處理湘柑茶主要化學成分的變化Fig.4 Changes of main chemical components of Xianggan tea in different treatments

2.3 揮發(fā)性成分

揮發(fā)性成分是湘柑茶陳化品質的一個重要標準。試驗對比了未經處理和最優(yōu)超聲加速陳化條件處理的湘柑茶香氣成分的變化。結果表明，未處理和超聲的湘柑茶中均有53 種揮發(fā)性成分，D-檸檬烯、反式-β-金合歡烯、γ-松油烯在二者之間均有較高含量，超聲之后的湘柑茶中D-檸檬烯含量降低，反式-β-金合歡烯和γ-松油烯含量則有所增加。在超聲陳化過程中，發(fā)現(xiàn)有14 種香氣成分消失，14 種物質生成。新生成了4-萜烯醇、4-甲基-1-（1-甲基乙基）-二氫衍生物-雙環(huán)[3.1.0]己烷、1-甲基-4-（1-甲基乙基）苯和11 種烯類，消失的揮發(fā)性成分有鄰甲氨基苯甲酸甲酯、鄰-異丙基苯、1-甲基-3-[（1-甲基亞乙基）環(huán)丙基]-苯和11種烯類。

α-松油醇是具有海桐花香的醇類，經過超聲處理，其含量顯著增加（P＜0.05），與鮑曉華[25]發(fā)現(xiàn)其在普洱茶貯藏過程中含量會上升結果一致，對湘柑茶的陳香有較好的協(xié)調作用，新生成的萜烯醇類-4-萜烯醇則能調和湘柑茶陳香風味[26]。3-甲基-4-異丙基苯酚在超聲處理下也呈增加趨勢，與研究報道的酚類香氣在貯藏中會增加相一致[27]，有利于湘柑茶陳香風味的形成。醚類物質在超聲作用下略微降低，烷類物質有一種新物質的生成；鄰甲氨基苯甲酸甲酯為柑皮特有的香精油成分，隨著貯藏時間的延長，湘柑茶中柑皮油包層的香精油會逐漸減少至消失，超聲后的湘柑茶鄰甲氨基苯甲酸甲酯消失符合這一規(guī)律[28]。

烯烴類成分中，檸檬烯是碳氫化合物中最為豐富的香氣成分，呈刺激性檸檬味，由表5 可知，經過超聲處理的湘柑茶D-檸檬烯降低，可使湘柑茶香味更香醇優(yōu)雅，與易倫朝等[29]研究結果相似，無論是自然陳化還是人工陳化，D-檸檬烯均呈降低趨勢；在超聲處理下湘柑茶新生成了（+）-3-蒈烯，有研究表明貯藏1 年的普洱茶中（+）3-蒈烯含量較高，不同品種普洱茶中（+）3-蒈烯在第3 年后含量均會降低[25]，表明超聲處理有一定的陳化效果。在超聲處理下新生成的（Z）-β-羅勒烯、α-愈創(chuàng)木烯均為湘柑茶陳化香氣中的代表性物質[25，30]。1，2，3-甲氧基苯是普洱茶中陳香含量最豐富的香氣成分，對陳香味起重要作用[31-32]，在試驗中其含量增加，說明超聲處理有利于湘柑茶產生陳香香氣。

表5 不同處理湘柑茶揮發(fā)性成分的變化Table 5 Changes of volatile components of Xianggan tea in different treatments

表6 不同處理湘柑茶主要氣味活性化合物的OAV 值Table 6 OAV values of main odorant active compounds in Xianggan tea in different treatments

綜上所述，超聲處理有加速陳化的效果，可使湘柑茶風味更接近自然陳化，香味更醇厚優(yōu)雅。

2.4 感官評價

對于湘柑茶來說，陳化是其向著香、醇、濃、甘方向轉變的重要步驟，陳化可使茶滋味更加醇和溫潤、湯亮香高。本試驗對超聲加速陳化處理的湘柑茶的湯色、香氣、滋味和接受度進行評定，發(fā)現(xiàn)經過超聲處理的湘柑茶與未處理的在感官特征中存在一定差異，其中，經過超聲處理的湘柑茶各特征分值均高于未處理的，湯色、香氣、滋味和接受度的變異系數(shù)依次為1.06%，1.96%，4.96%和4.35%，這說明對感官評價差異影響最大的是滋味和接受度。從表7 的分值中可以看出，超聲處理的湘柑茶柑橘香、茶香比未超聲處理的更濃郁協(xié)調；超聲產生的茶多酚氧化產物、降解產物和衍生物等使湘柑茶湯色更深、更明亮通透；湘柑茶在貯藏一段時間后，感官表現(xiàn)為苦澀味減少，滑順、濃醇感增加，可能是茶黃素減少使樣品的帶刺激性澀味減少，符合湘柑茶超聲后在滋味上較未超聲處理的更醇厚、細膩的結果[25]；因此，超聲處理的湘柑茶在接受度上優(yōu)于未處理的。

表7 不同處理湘柑茶感官評價表Table 7 Sensory evaluation table of Xianggan tea with different treatments

綜上所述，超聲處理后的湘柑茶感官品質優(yōu)于未超聲處理的，因此超聲處理不僅可以加速陳化，還可以提高品質。

2.5 主成分分析

主成分分析（Principal component analysis，PCA）[34]是將湘柑茶的主要化學成分、感官評價和20 種關鍵香氣化合物（OAV＞1，表6）共27 個指標進行分析，得到圖5。PCA 分析結果共提取到6 個主成分，第1 個主成分貢獻率為73.17%，第2 個主成分貢獻率為16.07%，前3 個主成分的特征值均大于1，累計方差貢獻率達到了95.85%。由圖5可知，未超聲處理的湘柑茶位于第二、三象限，超聲處理的則位于第一、四象限，不同處理的湘柑茶樣品可以得到很好的區(qū)分，說明其綜合品質具有顯著差異。在雙重信息圖中，D-檸檬烯、反式茴香醚、（＋）-α-蒎烯等烯類香氣物質與未處理的湘柑茶具有一致性。香氣、總多酚和一部分烯類、醇類等成分構成了超聲加速陳化后湘柑茶的重要指標。

圖5 主成分分析雙重信息圖Fig.5 Dual infographic of principal component analysis

綜上所述，超聲處理后影響湘柑茶品質的主要成分與陳化相關成分相一致，說明超聲處理具有加速陳化作用，且能進一步提升湘柑茶品質。

3 結論

對“湘柑茶”這一湘式柑普茶進行超聲加速陳化試驗，同時結合主成分分析研究最優(yōu)超聲條件處理后的湘柑茶主要化學成分、揮發(fā)性成分以及感官評價的變化。結果表明，湘柑茶超聲陳化最優(yōu)條件為超聲功率70 W、超聲時間55 min、超聲溫度30 ℃；超聲處理后湘柑茶的總黃酮與橙皮苷含量顯著增加，符合陳化規(guī)律，與前人研究相比，達到了1 年左右的陳化效果；在超聲陳化過程中，有14 種香氣成分消失，14 種物質生成，α-松油醇、3-甲基-4-異丙基苯酚、（Z）-β-羅勒烯等主要陳化風味增加，鄰甲氨基苯甲酸甲酯、D-檸檬烯等新鮮湘柑茶特有風味含量下降；超聲處理的湘柑茶香氣、湯色、滋味、接受度均優(yōu)于未處理的，且較未超聲處理湘柑茶的湯色更深、滋味更醇厚、優(yōu)雅細膩；主成分分析結果顯示共提取到6 個主成分，前3個主成分的特征值均大于1，累計方差貢獻率達到了95.85%，超聲處理后影響湘柑茶品質的主要成分與陳化相關成分相一致。由此可知，超聲處理具有加速陳化作用，且能進一步提升湘柑茶品質。