酸面團(tuán)發(fā)酵煎餅對(duì)2 型糖尿病小鼠的影響

唐天培，黃自偉，張娜娜，閆博文*，趙建新，張 灝，陳 衛(wèi)，范大明

（1 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫 214122 2 泰安市強(qiáng)德食品有限公司 山東泰安 271000）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，主要分為1 型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）、2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2D）和妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）[1]。其中2 型糖尿病是最常見的糖尿病類型，占到所有糖尿病病例的90%以上。目前，對(duì)2 型糖尿病的臨床治療主要使用雙胍類、磺脲類、噻唑烷酮類和糖苷酶抑制劑等藥物[2]。此外，飲食控制也是治療2 型糖尿病的重要環(huán)節(jié)。以雜糧谷物制品為代表的低升糖指數(shù)（GI）食品能有效減緩餐后血糖的迅速上升，調(diào)節(jié)胰島素反應(yīng)，近年來受到越來越多的關(guān)注。

山東煎餅作為我國北方地區(qū)的傳統(tǒng)主食之一，主要由玉米、小米、高粱等雜糧制成。山東煎餅的制作過程雖較為簡(jiǎn)單但極需技巧，將谷物原料浸泡一段時(shí)間后，研磨成面糊，經(jīng)發(fā)酵或不發(fā)酵，在鏊子上用刮板快速均勻地?cái)傊瞥杀”〉膱A餅[3]。高溫、短時(shí)、低水分接觸的加工方式使得山東煎餅的淀粉糊化度顯著低于饅頭、干飯、粥等其它主食。淀粉糊化度越低，進(jìn)食后消化吸收速度越慢，有利于減緩餐后血糖反應(yīng)[4]。因此，山東煎餅因獨(dú)特的加工方式和雜糧谷物原料而被認(rèn)為是適合糖尿病患者食用的主食。

酸面團(tuán)是由谷物和水的混合物經(jīng)有活性的微生物（如酵母菌和乳酸菌）發(fā)酵后的產(chǎn)物，又被稱為“酵子”或“老面”，在米面食品的加工中通常被當(dāng)作“引子”以促進(jìn)米面食品的發(fā)酵[5]。酸面團(tuán)技術(shù)不僅可以改善食品的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，也能賦予食品一定的功能特性。有研究表明，用乳酸菌酸面團(tuán)發(fā)酵小麥和黑麥粉可以降低全麥面包的淀粉消化率[6]，這可能與酸面團(tuán)發(fā)酵能降低淀粉糊化度相關(guān)。此外，在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中，乳酸菌通過糖基水解酶的催化合成大量的有機(jī)酸和胞外多糖。有機(jī)酸尤其是乳酸能降低淀粉消化率，乙酸和丙酸能延遲胃排空時(shí)間[7]。很多研究報(bào)道了多糖對(duì)糖尿病的緩解作用，主要集中在植物多糖如燕麥多糖、枸杞多糖和桑葉多糖等，而關(guān)于乳酸菌胞外多糖對(duì)糖尿病影響的研究較少。部分體外試驗(yàn)表明，乳酸菌胞外多糖具有潛在的降血糖活性[8]。也有研究指出植物乳桿菌X1 的無細(xì)胞上清液通過抑制α葡萄糖苷酶活性顯示出潛在的抗糖尿病能力[9]。為了充分了解植物乳桿菌酸面團(tuán)發(fā)酵對(duì)山東煎餅抗糖尿病特性的影響，需進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。

本研究以高脂飲食結(jié)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的T2D 小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，研究植物乳桿菌發(fā)酵酸面團(tuán)山東煎餅對(duì)T2D 小鼠體重、血糖、胰島素抵抗、血脂、胰腺組織、短鏈脂肪酸水平及腸道菌群等方面的影響，為開發(fā)適合糖尿病患者的功能性主食提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米：購自中國無錫歐尚超市。

試劑：鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma 公司；60%高脂飼料，南通特洛菲飼料科技有限公司；二甲雙胍，阿拉丁試劑有限公司；蔗糖、牛肉膏、葡萄糖、酵母粉、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、吐溫80、無水乙醇、乙醚、濃硫酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰島素檢測(cè)試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒，南京建成生物工程研究所；PCR擴(kuò)增引物及合成序列，上海生工生物工程有限公司；FastDNA Spin Kit for Feces 糞便基因組提取試劑盒，美國MP 公司；QIAquick Gel Extraction Kit 膠純化回收試劑盒，德國Qiagen 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；膠體磨，河北廊坊科技有限公司；羅氏活力型血糖儀和血糖試紙，美國羅氏有限公司；MLS-3750 高壓蒸汽滅菌鍋，日本Sanyo 公司；5415R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；SWCJ-1FD 型超凈工作臺(tái)，上海智誠科技有限公司；Leica ASP300S 型全自動(dòng)脫水機(jī)、Leica RM2245型半自動(dòng)切片機(jī)，德國LEICA 公司；Pannoramic MIDI 型組織切片掃描儀，匈牙利3D Histech Kft公司；1300-ISQ 型Thermo/Trace GC-MS、3020 型多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；PE300 型MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，美國Illumina 公司；2100 型Agilent（安捷倫）生物分析儀，美國Agilent 科技有限公司。

1.3 菌懸液的制備

植物乳桿菌X1 因其高產(chǎn)胞外多糖的特性和潛在的降血糖能力[9-10]被選擇用來發(fā)酵酸面團(tuán)，其由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種庫提供。菌株通過劃線分離，挑取單菌落于液體MRS 培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，再按2%接種量在液體MRS 培養(yǎng)基中37 ℃二代培養(yǎng)18 h。然后接種于液體MRS 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h 進(jìn)行擴(kuò)培。將擴(kuò)培好的植物乳桿菌X1 在4 ℃，6 000 r/min 條件下離心10 min，所得菌泥用無菌水通過菌落計(jì)數(shù)方法調(diào)整活菌量在109CFU/mL 得到菌懸液，用于接下來的酸面團(tuán)發(fā)酵。

1.4 酸面團(tuán)發(fā)酵及山東煎餅的制備

將玉米按1∶1.2（質(zhì)量比）浸泡在水中6 h，然后用膠體磨研磨成玉米面糊。將上述菌懸液加入面糊中混勻達(dá)到最終濃度108CFU/g，然后37 ℃發(fā)酵12 h 獲得酸面團(tuán)（pH 3.72±0.10，1010CFU/g）。

未發(fā)酵山東煎餅是用100%未發(fā)酵玉米面糊在鏊子上攤制而成（140 ℃，40 s）。發(fā)酵山東煎餅是用80.0%的未發(fā)酵玉米面糊和20.0%的酸面團(tuán)混合均勻后在鏊子上攤制而成（140 ℃，40 s）。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作均嚴(yán)格遵守江南大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的章程（SYXK 2012-0002）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理審核號(hào)為 JN.No20210615c0600922[189]。60 只C57BL/6J 小鼠（SPF 級(jí)，雄性，3 周齡）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組（8 只）飼喂正常小鼠飼料和糖尿病造模組（52 只）飼喂60%高脂飼料。4 周高脂飼料喂養(yǎng)后糖尿病組52 只小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ 溶液（100 mg/kg 體重，溶于0.1 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液，pH 4.5），同時(shí)空白組小鼠注射檸檬酸鹽緩沖液。繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)1 周后，測(cè)定空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG＞11.1 mmol/L 即為造模成功[11]。

將造模成功的32 只T2D 小鼠隨機(jī)分成4組，每組8 只，分別是模型組（MC）、陽性對(duì)照組（PC）、未發(fā)酵煎餅組（NFP）和發(fā)酵煎餅組（FP）?？瞻捉M（NC）為正常小鼠始終飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，模型組（MC）為T2D 小鼠飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，陽性對(duì)照組（PC）為T2D 小鼠飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料同時(shí)每天灌胃二甲雙胍（200 mg/kg 體重），未發(fā)酵煎餅組（NFP）和發(fā)酵煎餅組（FP）為T2D 小鼠分別飼喂未發(fā)酵山東煎餅和發(fā)酵山東煎餅制成的飼料（煎餅樣品凍干后由江蘇協(xié)同生物有限公司按73%的對(duì)應(yīng)樣品加27%的標(biāo)準(zhǔn)飼料制成棒狀飼料）。干預(yù)持續(xù)6周，小鼠可以自由獲得食物和水。每周禁食12 h后記錄體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，用2 mL 滅菌干燥EP 管收集新鮮糞便樣本，立即冰上放置，并迅速轉(zhuǎn)移到-80 ℃的冰箱中。小鼠禁食不禁水12 h 后腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉（0.5 mL/10 g 體重），摘除眼球取血后頸椎脫臼處死。血液在4 ℃，3 000 r/min 離心15 min，收集血清保存在-80 ℃冰箱中。胰腺組織用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水漂洗后固定在4%多聚甲醛溶液中。

1.6 空腹血糖、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)的檢測(cè)

每周一小鼠禁食不禁水12 h 后采用尾部取血方式，使用羅氏血糖儀檢測(cè)空腹血糖值。

胰島素水平的檢測(cè)采用胰島素檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)方法按照說明書進(jìn)行。

胰島素抵抗指數(shù)按下列公式計(jì)算：

胰島素抵抗指數(shù)=（空腹胰島素含量×空腹血糖值）/22.5

1.7 血脂分析

總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）水平使用試劑盒測(cè)定。

1.8 胰腺組織病理學(xué)分析

用4%多聚甲醛溶液固定的胰腺組織經(jīng)過夜洗滌后，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色。觀察并拍攝組織具有代表性的顯微照片。

1.9 糞便短鏈脂肪酸含量的測(cè)定

小鼠糞便凍干后稱取約50 mg 糞便樣品加入0.5 mL 飽和NaCl 溶液，再用20 μL H2SO4溶液酸化后加入1 mL 乙醚旋渦萃取，混合物12 000 r/min 離心15 min 并脫水后得到上層乙醚相，用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）儀器測(cè)定乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的含量。

1.10 腸道菌群的測(cè)定

小鼠糞便中細(xì)菌基因組的提取按照Fast DNA Spin 試劑盒說明書進(jìn)行。對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，30 min。按照膠回收試劑盒的說明書進(jìn)行V4 區(qū)PCR 產(chǎn)物的膠回收。按等質(zhì)量濃度原則混樣并用MiSeq 測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序。獲得下機(jī)數(shù)據(jù)地址后，利用SSH Secure Shell Client 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)提取和合并。去除嵌合體序列，進(jìn)行OTU 聚類，選取OTU 代表性序列以進(jìn)行后續(xù)分析。通過對(duì)序列進(jìn)行分類，制定biom 格式的OTU 表。根據(jù)otu_table.biom 進(jìn)行α、β 多樣性和腸道菌群門屬水平種類與豐度的分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 的單因素ANOVA 和鄧肯式多重比較對(duì)各組數(shù)據(jù)的差異進(jìn)行分析，不同字母標(biāo)注代表具有顯著差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 空腹體重

小鼠空腹體重的變化如圖1a 所示。在6 周的干預(yù)過程中，空白組小鼠的體重不斷增加，而所有T2D 小鼠均出現(xiàn)體重減輕的典型病理特征[17]。陽性組小鼠從第2 周開始，體重開始回升并保持相對(duì)穩(wěn)定，說明二甲雙胍能緩解T2D 小鼠的體重快速下降。發(fā)酵煎餅組小鼠體重下降的幅度低于模型組和未發(fā)酵煎餅組，但這3 組小鼠的體重之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 飲食干預(yù)期間小鼠空腹體重（a）和空腹血糖（b）水平的變化Fig.1 Changes in fasting body weight（a）and fasting blood glucose（b）levels of mice during the dietary intervention

2.2 空腹血糖

空腹血糖是T2D 最常規(guī)的檢測(cè)指標(biāo)，能夠反映患者糖代謝情況及胰島β 細(xì)胞功能狀態(tài)[12]。由圖1b 可知，在干預(yù)開始前，T2D 小鼠的空腹血糖值均明顯高于空白組小鼠（P＜0.05）。6 周的干預(yù)過程中，空白組小鼠空腹血糖值始終正常且穩(wěn)定，而模型組和未發(fā)酵煎餅組小鼠空腹血糖值始終保持上升趨勢(shì)。發(fā)酵煎餅組小鼠的空腹血糖值在干預(yù)后期（4～6 周）上升趨勢(shì)逐漸減緩甚至開始下降，表明發(fā)酵煎餅具有一定的降血糖作用。有研究表明，有活性的和經(jīng)過高溫處理殺死的乳酸菌均表現(xiàn)出一定程度的降低T2D 小鼠空腹血糖和餐后血糖的能力[13]。因此，發(fā)酵煎餅組觀察到的小鼠空腹血糖的下降可能與死菌和酸面團(tuán)發(fā)酵過程中高產(chǎn)的胞外多糖等發(fā)酵產(chǎn)物有關(guān)，即使在煎餅加工過程中高溫殺死了絕大多數(shù)的活菌。

2.3 胰島素和胰島素抵抗

胰島素是由胰腺β 細(xì)胞分泌的一種參與血糖調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)激素。胰島素抵抗是T2D 典型的特征，主要表現(xiàn)為胰島素敏感性下降，胰島素過度積累卻沒有發(fā)揮降血糖的作用[14]。如圖2a 和2b 所示，模型組小鼠的胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)均顯著高于空白組（P＜0.05），表明模型組小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的胰島素抵抗。與模型組和未發(fā)酵煎餅組相比，發(fā)酵煎餅組小鼠的胰島素抵抗指數(shù)顯著降低（P＜0.05），表明發(fā)酵煎餅的干預(yù)在一定程度上可以改善T2D 小鼠的胰島素抵抗。有研究報(bào)道過，灌胃植物乳桿菌K68 發(fā)酵的果蔬汁比單純灌胃植物乳桿菌K68 或果蔬汁更能降低糖尿病大鼠的胰島素抵抗[15]。植物乳桿菌發(fā)酵果蔬汁過程中額外產(chǎn)生的胞外多糖可能是發(fā)酵果蔬汁更能改善胰島素抵抗的原因，這與我們觀察到的試驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖2 發(fā)酵煎餅對(duì)小鼠胰島素水平（a）和胰島素抵抗（b）的影響Fig.2 Effect of FP on insulin level（a）and homeostasis model assessment of insulin resistance（b）in mice

2.4 血脂

血脂異常也是T2D 的常見特征，通常通過血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 來表征。由表1 可知，相比于空白組，模型組小鼠的血脂異常主要表現(xiàn)為TC、TG 和LDL-C 的顯著升高（P＜0.05），而HDL-C 顯著降低（P＜0.05）[9]。與模型組相比，發(fā)酵煎餅組小鼠的LDL-C 水平?jīng)]有顯著性差異（P＞0.05），但TC 和TG 水平顯著降低（P＜0.05），HDLC 水平顯著升高（P＜0.05），表明長期飼喂發(fā)酵煎餅雖然沒有達(dá)到全面調(diào)節(jié)T2D 小鼠血脂4 項(xiàng)的效果，但在一定程度上改善了血脂異常的狀態(tài)。

表1 發(fā)酵煎餅對(duì)小鼠血脂的影響Table 1 Effect of FP on levels of serum lipids in mice

2.5 胰腺組織病理學(xué)分析

胰島損傷是高脂飲食和STZ 誘導(dǎo)T2D 小鼠模型的一個(gè)重要組織學(xué)特征。在模擬T2D 模型中，胰島細(xì)胞的損傷主要是由STZ 引起的[16]。各組小鼠胰腺組織切片HE 染色結(jié)果如圖3 所示?？瞻捉M小鼠胰島呈規(guī)則的圓形或近圓形，輪廓清晰，胰島細(xì)胞數(shù)目豐富，形態(tài)飽滿且排列整齊[17]。而模型組小鼠的胰島受到了嚴(yán)重的損傷，胰島體積變小，結(jié)構(gòu)皺縮，分布較松散，胰島細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重。陽性藥物二甲雙胍對(duì)T2D 小鼠的胰島萎縮有明顯的緩解作用。與模型組和未發(fā)酵煎餅組相比，發(fā)酵煎餅組小鼠胰島受損情況得到了一定程度的改善，胰島大小顯著恢復(fù)，胰島細(xì)胞數(shù)量顯著增加。此外，胰島的形態(tài)和結(jié)構(gòu)也趨向于完整[16，18]。

圖3 發(fā)酵煎餅對(duì)小鼠胰腺組織的影響（放大倍數(shù)，400×）Fig.3 Effect of FP on the pancreas in mice（magnification，400×）

2.6 短鏈脂肪酸

短鏈脂肪酸是未消化的淀粉和纖維經(jīng)過厭氧微生物發(fā)酵的主要產(chǎn)物，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸和戊酸等，在調(diào)節(jié)腸道健康、保護(hù)腸道微生態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要的作用[16]。不同干預(yù)組小鼠糞便中短鏈脂肪酸的水平如圖4 所示，模型組小鼠5 種短鏈脂肪酸的水平都低于空白組，這與Wang 等[17]報(bào)道的結(jié)果相一致。與模型組相比，未發(fā)酵煎餅組的丙酸、丁酸水平顯著升高（P＜0.05），這可能與玉米作為煎餅的原料粗纖維含量較高相關(guān)。發(fā)酵煎餅組5 種短鏈脂肪酸的水平均高于未發(fā)酵煎餅組和模型組，尤其是異丁酸和戊酸表現(xiàn)出顯著性的差異（P＜0.05）。有研究表明，補(bǔ)充植物乳桿菌NCU116 發(fā)酵胡蘿卜汁的大鼠糞便中短鏈脂肪酸水平顯著高于補(bǔ)充未發(fā)酵胡蘿卜汁[18]。類似于發(fā)酵胡蘿卜汁體系，植物乳桿菌發(fā)酵酸面團(tuán)過程中同樣產(chǎn)生大量胞外多糖，這些多糖在腸道內(nèi)經(jīng)過厭氧微生物發(fā)酵產(chǎn)生一定量的短鏈脂肪酸因而導(dǎo)致了我們觀察到的結(jié)果。據(jù)報(bào)道，乙酸可以降低食欲，抑制體內(nèi)脂肪堆積[17]。丙酸可以降低膽固醇和甘油三酯水平，提高胰島素敏感性，從而改善葡萄糖代謝[19]。補(bǔ)充丁酸可以緩解小鼠的胰島素抵抗并增加能量消耗。此外，丁酸已被證明能激活胚胎干細(xì)胞中調(diào)節(jié)胰腺早期發(fā)育的基因，從而增加胰腺β 細(xì)胞的分化和胰島素相關(guān)基因的表達(dá)[20]。因此，可以推測(cè)，酸面團(tuán)發(fā)酵煎餅?zāi)芨纳芓2D 小鼠糖脂代謝紊亂，進(jìn)一步緩解胰島素抵抗，可能是通過調(diào)控短鏈脂肪酸水平實(shí)現(xiàn)的。

圖4 發(fā)酵煎餅對(duì)小鼠糞便短鏈脂肪酸含量的影響Fig.4 Effect of FP on fecal short-chain fatty acids content in mice

2.7 腸道菌群

T2D 的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群有著密切的聯(lián)系，飲食對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的形成也起著至關(guān)重要的作用，不同飲食干預(yù)對(duì)T2D 小鼠腸道菌群α 多樣性的影響如圖5 所示，包括Shannon，Evenness，F(xiàn)aith_pd 和Observed_otus。相比于模型組，發(fā)酵煎餅組的Shannon 指數(shù)和Observed_otus 均有上升，表明長期飼喂發(fā)酵煎餅可以提高T2D 小鼠腸道菌群的多樣性和豐富度。為了更直觀地了解不同干預(yù)組小鼠腸道菌群組成的差異情況，我們對(duì)各組樣本的所有分類水平結(jié)果進(jìn)行了主坐標(biāo)成分（PCoA）分析如圖6 所示?？瞻捉M和模型組完全分開，沒有重疊，說明高脂飲食和STZ 注射造模導(dǎo)致模型組小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。未發(fā)酵煎餅的干預(yù)對(duì)T2D 小鼠的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，但沒有顯著差異。發(fā)酵煎餅組與陽性組產(chǎn)生較大重疊，即其腸道菌群表現(xiàn)出與陽性組較大的相似性，且其與未發(fā)酵煎餅組和模型組的差異顯著，表明發(fā)酵煎餅干預(yù)在一定程度上改善了小鼠腸道菌群多樣性，這可能有助于緩解糖尿病[21]。

圖5 發(fā)酵煎餅對(duì)α 多樣性指數(shù)的影響Fig.5 Effect of FP on α diversity index

圖6 發(fā)酵煎餅對(duì)β 多樣性的影響Fig.6 Effect of FP on β diversity

圖7 顯示了各組在門水平上的相對(duì)豐度，小鼠的腸道微生物主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）組成。與之前的報(bào)道一致[17]，相比于空白組，模型組小鼠腸道微生物中厚壁菌門相對(duì)豐度上升，擬桿菌門相對(duì)豐度下降，厚壁菌門/擬桿菌門的值升高，變形菌門相對(duì)豐度增加。厚壁菌門/擬桿菌門的值已被證明與血糖水平呈正相關(guān)[22]。與模型組相比，發(fā)酵煎餅組的小鼠厚壁菌門相對(duì)豐度下降，擬桿菌門相對(duì)豐度上升，厚壁菌門/擬桿菌門的值降低，這與發(fā)酵煎餅組小鼠觀察到的較低的血糖水平相符合。

圖7 不同組別小鼠腸道菌群門水平變化Fig.7 Changes at phylum level of mice fecal microbiota in different groups

圖8a 顯示了各組在屬水平上的相對(duì)豐度。為明確飲食干預(yù)對(duì)小鼠屬水平上的腸道菌群造成的影響，采用LEfSe 對(duì)不同組小鼠的腸道菌群進(jìn)行差異性分析（設(shè)定LDA 值大于4），結(jié)果如圖8b 所示。陽性組的標(biāo)記菌屬為擬桿菌屬，擬桿菌屬是重要的短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌[23]，許多證據(jù)表明機(jī)體腸道微生物自發(fā)形成的短鏈脂肪酸對(duì)宿主健康具有十分重要的作用，二甲雙胍緩解T2D 的良好作用可能與其提高產(chǎn)短鏈脂肪酸菌群的豐度密切相關(guān)。未發(fā)酵煎餅組的標(biāo)記菌屬為糞桿菌屬和副沙門氏菌屬，發(fā)酵煎餅組的標(biāo)記菌屬為乳桿菌屬和脫硫弧菌屬。據(jù)報(bào)道，乳桿菌屬豐度的增加可促進(jìn)胰島素的分泌，在T2D 患者中乳桿菌屬的比例與血糖水平呈負(fù)相關(guān)[23]。此外，乳桿菌屬能增強(qiáng)膽汁水解酶的活性，增加糞便中脂類的排泄，減少脂類堆積[24]，這與本研究中觀察到的發(fā)酵煎餅組小鼠血脂的改善相符合。因此，乳桿菌屬可能是調(diào)節(jié)T2D 小鼠血糖水平，緩解血脂異常的靶向菌之一。Yan 等[11]也報(bào)道過嗜酸乳桿菌干預(yù)導(dǎo)致T2D 小鼠脫硫弧菌屬豐度的增加，脫硫弧菌屬是人體腸道中主要的硫酸鹽還原菌，雖然有研究推測(cè)脫硫弧菌屬與腸道疾病有關(guān)，但二者之間的關(guān)系尚存爭(zhēng)議。屬水平上不同組之間具體的菌群差異如圖8c～8f 所示，除乳桿菌屬和脫硫弧菌屬外，與模型組和未發(fā)酵煎餅組相比，發(fā)酵煎餅組中的蘇黎世桿菌屬和黏液螺旋菌屬的相對(duì)豐度也顯著升高（P＜0.05）。蘇黎世桿菌屬被報(bào)道與腸道丁酸水平相關(guān)，而丁酸鹽的增加與胰島素敏感性的改善有關(guān)[25-26]。黏液螺旋菌屬也屬于短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌，有研究認(rèn)為黏液螺旋菌屬，糞球菌屬，擬桿菌屬和副桿菌屬等短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌通過腸道菌群-短鏈脂肪酸-炎癥通路緩解胰島素抵抗，進(jìn)一步改善糖代謝[17，27]。此外，Galle 等[8]報(bào)道過酸面團(tuán)來源的胞外多糖能刺激結(jié)腸碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，并增加腸道菌群的數(shù)量。因此，我們認(rèn)為植物乳桿菌發(fā)酵酸面團(tuán)過程中產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物，如有機(jī)酸和胞外多糖等，是飼喂發(fā)酵煎餅?zāi)茱@著改變T2D 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加乳桿菌屬和產(chǎn)短鏈脂肪酸菌屬蘇黎世桿菌屬及黏液螺旋菌屬的豐度，并進(jìn)一步影響其病理生理指標(biāo)的主要原因。

圖8 不同組別小鼠腸道菌群屬水平變化Fig.8 Changes at genus level of mice fecal microbiota in different groups

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了植物乳桿菌發(fā)酵酸面團(tuán)山東煎餅對(duì)T2D 小鼠的緩解作用。6 周的發(fā)酵煎餅干預(yù)可以降低T2D 小鼠空腹血糖水平和胰島素抵抗、改善血脂異常、保護(hù)胰島功能、調(diào)節(jié)SCFA 水平和腸道菌群。酸面團(tuán)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物如有機(jī)酸和胞外多糖等，可能是發(fā)酵煎餅表現(xiàn)出顯著的抗糖尿病作用的原因。以上結(jié)果表明，植物乳桿菌發(fā)酵酸面團(tuán)山東煎餅有望成為T2D 患者的功能性主食。