膳食纖維和阿魏酸對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程中麥谷蛋白大聚體聚集態(tài)的影響及其分子間相互作用

馮鈺琳，張慧娟，王 靜

（北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 中國(guó)-加拿大食品營(yíng)養(yǎng)與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（北京）國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管食品特殊監(jiān)管技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048）

近年來(lái)，全谷物食品逐漸受到消費(fèi)者的喜愛(ài)。全麥?zhǔn)称肥侨任锸称返姆N類之一，通常由全麥面粉，即白面粉中加入小麥麩皮粉加工制作而成，通常具有較差的口感和風(fēng)味[1]。

膳食纖維（Dietary fiber，DF）是麥麩中的主要物質(zhì)[2]。有研究表明，麥麩中的膳食纖維對(duì)面團(tuán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的不良影響主要是膳食纖維對(duì)面筋蛋白的稀釋作用與水分競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，并對(duì)氣泡的擴(kuò)展產(chǎn)生限制作用，降低面團(tuán)的持氣性[3-5]。另外，在麥麩粉碎的過(guò)程中釋放出的阿魏酸（Ferulic acid，F(xiàn)A）等酚酸類物質(zhì)可能會(huì)影響面筋網(wǎng)絡(luò)中巰基/二硫鍵的交換反應(yīng)，減少面筋網(wǎng)絡(luò)中的二硫鍵含量[6]。

麥谷蛋白大聚體（gluten macropolyer，GMP）是一種不溶于十二烷基硫酸鈉（SDS）的谷蛋白聚合體，是構(gòu)成麥谷蛋白骨架的大分子蛋白質(zhì)，與小麥面團(tuán)的流變學(xué)特性呈正相關(guān)[7-8]。面團(tuán)的混合攪拌和靜置醒發(fā)等加工過(guò)程會(huì)影響麥谷蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成和GMP 的聚合。在制備面團(tuán)攪拌的過(guò)程中，GMP 結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生解聚，使得SDS 提取液中蛋白的濃度增大；而在面團(tuán)醒發(fā)時(shí)，這些可提取的聚合物會(huì)重新聚合，從而增加GMP 的含量[9]。然而，目前關(guān)于全麥體系中膳食纖維與阿魏酸以及兩者的共同作用如何影響面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程GMP 分子聚集的報(bào)道甚少，有待研究。

本文通過(guò)向高筋面粉中分別添加DF、FA 以及復(fù)合添加DF+FA，在面團(tuán)的不同醒發(fā)時(shí)間提取其中的GMP，對(duì)其粒徑與分子質(zhì)量分布、內(nèi)源性色氨酸熒光光譜與紫外光譜、游離氨基與水解氨基酸進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)DF 與FA 影響GMP 面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程中分子聚集行為與相互作用機(jī)理進(jìn)行解析，為全谷物食品的生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高筋小麥粉，河北金沙河集團(tuán)；膳食纖維，Interfiber 公司；阿魏酸、十二烷基硫酸鈉、絲氨酸、鹽酸，上海麥克林生化科技有限公司；雙色預(yù)染寬分子量蛋白Mark、4x Laemmli Sample Buffer（含β-巰基乙醇）、氫氧化鈉，北京索萊寶科技有限公司；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；苯酚、2，4-二硝基氟苯、醋酸銨，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；乙腈，美國(guó)MREDA 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA5003 電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；CR22N 高速離心機(jī)，日本日立公司；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；79600-70 真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO 公司；Cary 100 紫外分光光度計(jì)，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；SC-05 熒光分光光度計(jì)，英國(guó)愛(ài)丁堡儀器公司；SALD-2300N 激光粒度分析儀、DGU-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Red 公司；小型垂直電泳系統(tǒng)，美國(guó)Hoefer 公司；多用途恒溫超聲波提取儀，上海比朗儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DF、FA 及DF+FA 混合粉的配制與面團(tuán)的制備 將未添加任何物質(zhì)的純高筋小麥粉設(shè)置為Flour 組。分別在高筋小麥粉中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的DF[2，10]，0.15%的FA[10-11]，充分混勻，制備成DF混合粉與FA 混合粉；另外將質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的DF與0.15%的FA 復(fù)配添加到高筋小麥面粉中，制備成DF+FA 混合粉。

分別將高筋小麥粉與上述3 種混合粉各100 g 置于和面機(jī)中，水量根據(jù)Mixolab 試驗(yàn)測(cè)定的吸水率結(jié)果添加，在25 ℃環(huán)境中混合攪拌5 min 后形成光滑完整的面團(tuán)，30 ℃條件下分別靜置醒發(fā)0，30，60，90 min（分別設(shè)置為R0 組、R30 組、R60組與R90 組），其余面團(tuán)于-80 ℃下冷凍12 h 后，冷凍干燥后磨粉，過(guò)篩備用。

1.3.2 GMP 的提取 將1.3.1 節(jié)制得的面粉用正己烷脫脂后，根據(jù)Don 等[12]描述的方法提取面團(tuán)中的GMP。將1.4 g 凍干面粉樣品置于離心管中，加入28 mL 15 g/L 的SDS 溶液混勻，待面粉充分在溶液中分散均勻后離心（25 ℃，15 000 r/min，30 min），沉淀上層的蛋白質(zhì)凝膠即為GMP。部分新鮮GMP 凝膠用于測(cè)定GMP 的粒徑分布，其余GMP 于冷凍干燥后磨粉過(guò)篩備用。

1.3.3 GMP 粒徑分布的測(cè)定 根據(jù)Yan 等[13]的方法測(cè)定GMP 的粒徑分布。將約1 g 新鮮制備的GMP 樣品置于15 mL 離心管中，加入15 g/L SDS溶液10 mL。低速磁力攪拌2 h 后使GMP 均勻地懸浮在溶液中，GMP 的粒徑分布使用激光粒度分析儀測(cè)定。

1.3.4 GMP 分子質(zhì)量分布的測(cè)定 SDS-PAGE：依照Wang 等[14]描述的方法，進(jìn)行輕微調(diào)整。采用5%的濃縮膠（pH 6.8）和12%的分離膠（pH 8.8）對(duì)GMP 分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析。使用提取液（0.5 mL 0.01 mol/L Tris-HCl，pH 6.8；含體積分?jǐn)?shù)10% β-巰基乙醇的4x Laemmli Sample Buffer）對(duì)GMP 蛋白粉末進(jìn)行提取后，取10 μL 上清液上樣進(jìn)行電泳試驗(yàn)。用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)染色、脫色后的凝膠進(jìn)行觀察拍照。

SEC-HPLC：參照Morel 等[15]與Larroque 等[16]的方法稍作修改。準(zhǔn)確稱取10 mg 冷凍干燥的GMP，加入提取液（0.05 mol/L PBS，pH 6.9，含2 mol/L 尿素，15 g/L SDS），漩渦振蕩混勻后使用超聲波提取儀進(jìn)行GMP 提?。üβ?0%，3 min）。之后20 ℃，17 000×g 離心15 min。使用0.22 μm 濾膜過(guò)濾上清液，取50 μL 提取液進(jìn)樣至高效液相色譜儀。選用Shodex Protein KW-804 色譜柱，色譜條件為：流動(dòng)相為乙腈與水1∶1（含0.05% 三氟乙酸），流動(dòng)相流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

1.3.5 HMW/LMW 比值的測(cè)定 根據(jù)Wieser 等[17]的方法，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定GMP 的HMW/LMW 比值。使用C8 鍵合相色譜柱，通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定。冷凍干燥的GMP粉末（100 mg）加入1 mL 提取液[體積分?jǐn)?shù)50%異丙醇，2 mol/L 尿素，10 g/L 二硫蘇糖醇，0.05 mol/L的Tis-HCl（pH 7.5）]，在氮?dú)猸h(huán)境下60 ℃振蕩加熱20 min 進(jìn)行提取。離心后（6 000×g，4 ℃，20 min）重復(fù)提取3 次，合并上清液。流動(dòng)相A 為含體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的超純水，流動(dòng)相B 為含有體積分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸的乙腈（色譜級(jí)）。取100 μL 提取液進(jìn)樣，柱溫50 ℃。洗脫流速為1 mL/min，B 相從28%到56%進(jìn)行梯度洗脫。

1.3.6 GMP 內(nèi)源性色氨酸熒光光譜的測(cè)定 參照Han 等[18]的方法，將GMP 蛋白粉末500 mg 于燒杯中，加入20 mL 磷酸緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.0 制得蛋白質(zhì)溶液。取3 mL 置于四面透光的熒光石英比色皿內(nèi)，熒光分光光度計(jì)設(shè)置參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，波長(zhǎng)掃描范圍300～400 nm，狹縫寬度5 min，掃描GMP 的內(nèi)源性色氨酸熒光光譜圖。

1.3.7 GMP 紫外光譜分析 參照岳鑫等[19]的方法，取1.3.6 節(jié)中的蛋白溶液3 mL 于石英比色皿中，使用紫外分光光度計(jì)在250～350 nm 范圍內(nèi)測(cè)定GMP 蛋白的紫外光譜。

1.3.8 GMP 游離氨基的測(cè)定 參照Swieca 等[20]的方法測(cè)定GMP 中的游離氨基。將1.3.6 節(jié)中制得的蛋白質(zhì)的溶液取1 mL 加入100 μL 1 g/L 的TNBS 水溶液，50 ℃條件下避光反應(yīng)60 min 后，加入1 mL 標(biāo)準(zhǔn)酸（0.1 mol/L），室溫避光孵育30 min后測(cè)定420 nm 處的吸光度。使用不同濃度的絲氨酸進(jìn)行上述操作步驟，以絲氨酸濃度-吸光度為標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)GMP 中的游離氨基進(jìn)行定量計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 DF 與FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程GMP 粒徑分布的影響

按照不同的粒徑范圍，將GMP 的粒徑分布分為小粒徑＜11 μm、中粒徑11～50 μm 和大粒徑＞50 μm 3 個(gè)范圍，各粒徑范圍GMP 的體積分?jǐn)?shù)如表1 所示。由表可知，在0～60 min 醒發(fā)時(shí)間的范圍內(nèi)，各組別小粒徑GMP 的體積分?jǐn)?shù)隨醒發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，而大粒徑GMP 的體積分?jǐn)?shù)隨醒發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，如醒發(fā)60 min 時(shí)Flour 組大粒徑（粒徑＞50 μm）GMP 體積分?jǐn)?shù)比醒發(fā)0 min 時(shí)增加了6.1%。Don 等[21]認(rèn)為，在面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程中，部分面團(tuán)中由于前期攪拌過(guò)程中機(jī)械力而發(fā)生解聚的GMP 會(huì)由小粒徑重新聚合逐漸變?yōu)榇罅剑c本部分的試驗(yàn)結(jié)果相似。在Han 等[18]的研究中，發(fā)現(xiàn)添加DF 會(huì)使面筋蛋白的粒徑分布發(fā)生明顯的變化，面筋聚集也會(huì)由于DF 的添加發(fā)生改變。而FA 與蛋白之間存在的疏水作用力與氫鍵[22]可能會(huì)導(dǎo)致添加FA 后GMP 的粒徑分布發(fā)生變化。這可能是本試驗(yàn)中FA 組小粒徑GMP 所占的比例相比于Flour 組顯著增加，大粒徑GMP 的體積分?jǐn)?shù)顯著降低的原因。當(dāng)同時(shí)添加DF 與FA 時(shí)，GMP 粒徑的變化介于單獨(dú)添加DF 與FA 之間，大粒徑GMP 含量降低程度小于單獨(dú)添加FA 的組別，這說(shuō)明添加DF+FA 會(huì)降低單獨(dú)添加DF 或FA對(duì)GMP 粒徑分布的影響。

表1 添加DF、FA 及DF+FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程中GMP 粒徑分布的影響Table 1 Effects of DF，F(xiàn)A and FA+DF on the particle size distribution of GMP during resting process

當(dāng)面團(tuán)醒發(fā)時(shí)間達(dá)到90 min 時(shí)，F(xiàn)lour 組小粒徑GMP 的體積分?jǐn)?shù)有所升高，大粒徑GMP 的體積分?jǐn)?shù)發(fā)生下降，但是添加了DF 與FA 的組別的小粒徑GMP 依然呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，大粒徑GMP的體積分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，說(shuō)明添加DF 與FA同樣會(huì)影響醒發(fā)過(guò)程中GMP 粒徑分布的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。

2.2 DF 與FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程GMP 分子質(zhì)量分布的影響

圖1 為GMP 的凝膠電泳成像圖。由圖可知，GMP 的分子質(zhì)量較大，主要分布在35～135 ku 的范圍內(nèi)。DF 組與Flour 組相比分子質(zhì)量條帶分布沒(méi)有明顯的變化，表明添加DF 不會(huì)對(duì)GMP 的分子質(zhì)量分布造成較大的影響。FA 組與DF+FA 組在75～100 ku 的范圍內(nèi)條帶由原來(lái)的2 個(gè)條帶變?yōu)? 個(gè)條帶，說(shuō)明FA 的加入會(huì)對(duì)較高分子質(zhì)量的蛋白亞基產(chǎn)生影響。結(jié)合110 ku 處條帶強(qiáng)度變小且向低分子質(zhì)量處方向偏移，推測(cè)出現(xiàn)的新條帶可能是由該條帶解聚產(chǎn)生的。說(shuō)明FA 的加入會(huì)導(dǎo)致GMP 蛋白的高分子質(zhì)量亞基發(fā)生解聚。添加DF+FA 的組別同樣也在該區(qū)域出現(xiàn)了新條帶，但110 ku 處與泳道整體的蛋白強(qiáng)度與FA 組相比有所增強(qiáng)，說(shuō)明DF 能夠平衡FA 對(duì)GMP 蛋白分子質(zhì)量分布的影響。在Wang 等[14]的研究中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的解聚與亞基的變化可能與GMP 粒徑變化有關(guān)。在2.1 節(jié)中我們發(fā)現(xiàn)添加FA 會(huì)使大粒徑GMP 體積分?jǐn)?shù)減小，DF+FA 會(huì)降低單獨(dú)添加DF或FA 對(duì)GMP 粒徑分布影響，與電泳試驗(yàn)的結(jié)果相似，印證了Wang 等[14]的觀點(diǎn)。

圖1 GMP 的SDS-PAGE 圖Fig.1 The SDS-PAGE analysis of GMP

各組GMP 的SEC-HPLC 圖如圖2 所示。各組樣品的色譜圖按照分子質(zhì)量的大小主要可以分為3 個(gè)峰區(qū)，分別為谷蛋白聚合體（F1，Mw≈91 000～688 000 ku）、單體谷蛋白（F2，Mw≈16 000～91 000 ku）與清蛋白、球蛋白、肽鏈及氨基酸（F3，Mw＜10 000 ku）[23]。由于GMP 是麥谷蛋白中的高分子聚合體，因此其主要的峰響應(yīng)集中在F1 區(qū)。而F2區(qū)及F3 區(qū)主要是一些與聚合體結(jié)合較緊密而未被分離的單體蛋白與氨基酸等。由圖可知，DF 組的色譜圖與Flour 組相比沒(méi)有明顯的區(qū)別，說(shuō)明添加DF 不會(huì)對(duì)GMP 的分子質(zhì)量分布產(chǎn)生顯著影響。FA 組在保留時(shí)間為8.744 min 峰響應(yīng)有所降低，且在該峰的右側(cè)，即保留時(shí)間為11～14 min 的范圍內(nèi)出現(xiàn)了響應(yīng)，說(shuō)明FA 的加入會(huì)使部分高分子質(zhì)量亞基解聚，導(dǎo)致分子質(zhì)量分布向低分子質(zhì)量的方向偏移，這與SDS-PAGE 中FA 導(dǎo)致GMP高分子質(zhì)量亞基發(fā)生解聚的結(jié)果是一致的。當(dāng)同時(shí)添加DF 與FA 時(shí)，隨著醒發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)1 區(qū)的峰值逐漸升高伴隨著其右側(cè)的響應(yīng)值逐漸降低，直至醒發(fā)90 min 時(shí)，GMP 的譜圖與Flour 組相比已無(wú)明顯差異，說(shuō)明在醒發(fā)的過(guò)程中，DF 與FA的共同作用可以逐漸平衡單獨(dú)添加FA 對(duì)GMP的解聚作用，減輕對(duì)GMP 分子質(zhì)量分布的影響，這與SDS-PAGE 的結(jié)果也是一致的。

圖2 GMP 的SEC-HPLC 圖Fig.2 The SEC-HPLC analysis of GMP

2.3 DF 與FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程GMP 亞基比值的影響

各組別GMP 亞基比值如圖3 所示。由圖可知，F(xiàn)lour 組與FA 組在面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程中亞基比值沒(méi)有發(fā)生顯著的變化。在Aussena 等[24]探究面團(tuán)加工過(guò)程GMP 亞基比值變化的試驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)醒發(fā)過(guò)程GMP 亞基比值略有上升但總體變化不大，與本試驗(yàn)的結(jié)果相似。但DF、DF+FA 的組別隨醒發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)亞基比值發(fā)生了顯著的增加（P＜0.05），這可能是由于DF 的加入影響了醒發(fā)過(guò)程中面粉中蛋白的可萃取率，隨著醒發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，不可萃取的麥谷蛋白大聚體中的HMW-GS 含量增加，導(dǎo)致亞基比值的升高[25]。另外在相同醒發(fā)時(shí)間下，添加DF、FA 均會(huì)使GMP 的亞基比值下降，與醒發(fā)90min 的Flour 組亞基比值相比，DF 組下降了7.4%，F(xiàn)A 組下降了18.5%，DF+FA 組下降了7.5%，DF與FA 的相互作用可以保持GMP 中HMW 與LMW 的相對(duì)含量。前人的研究中提出谷蛋白聚合物具有層次結(jié)構(gòu)，在面團(tuán)加工的過(guò)程中麥谷蛋白亞基是以非隨機(jī)順序釋放的[3]。因此推斷DF 與FA 的加入會(huì)與GMP 分子中的不同亞基間產(chǎn)生相互作用，導(dǎo)致HMW-GS 釋放，由聚合體蛋白轉(zhuǎn)化為單體蛋白，更容易在提取面團(tuán)中的GMP 過(guò)程中被SDS 提取溶液萃取，從GMP 中脫離出來(lái)，導(dǎo)致HMW/LMW-GS 發(fā)生降低的現(xiàn)象。同時(shí)推測(cè)，由于這兩種物質(zhì)與GMP 的作用方式不同，所釋放的HMW-GS 的種類和數(shù)量之間的差異引起了添加DF 與FA 亞基比值降低程度的不同。

圖3 添加DF、FA 及DF+FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程中GMP 亞基比值的影響Fig.3 Effects of DF，F(xiàn)A and DF+FA on the HMW/LMW ratio of GMP during resting process

2.4 DF 與FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程GMP 內(nèi)源性色氨酸熒光光譜的影響

各組GMP 的內(nèi)源性色氨酸熒光掃描光譜圖如圖4 所示。由圖可知，對(duì)于添加同種物質(zhì)的組別，各組在醒發(fā)過(guò)程中出峰位置與峰高都較為集中，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的差異，這說(shuō)明在醒發(fā)過(guò)程中色氨酸暴露的數(shù)量與程度、色氨酸周圍極性微環(huán)境沒(méi)有出現(xiàn)明顯的變化。

圖4 添加DF、FA 及DF+FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程中GMP 色氨酸熒光光譜的影響Fig.4 Effects of DF，F(xiàn)A and DF+FA on the fluorescence characteristic of GMP during resting process

與Flour 組相比，添加了DF 或FA 后的色氨酸熒光譜帶強(qiáng)度都有所降低，但色氨酸熒光強(qiáng)度DF 組大于FA 組，這說(shuō)明DF 組蛋白中色氨酸殘基的暴露程度要高于FA 組。這可能是由于色氨酸也是疏水性氨基酸之一，會(huì)與酚酸中的疏水性基團(tuán)產(chǎn)生疏水相互作用，使得蛋白分子含有色氨酸殘基部分的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使色氨酸殘基的暴露程度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生熒光淬滅，熒光帶強(qiáng)度降低；另外FA 等酚酸具有酚羥基等結(jié)構(gòu)會(huì)與蛋白含有色氨酸殘基的結(jié)構(gòu)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使色氨酸的數(shù)目減少，使得色氨酸的熒光強(qiáng)度降低[26-28]。也有研究報(bào)道了植物酚酸的添加所產(chǎn)生的酚酸-蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變[29]。而同時(shí)添加DF 與FA的組別的色氨酸熒光強(qiáng)度介于單獨(dú)添加DF 與FA之間，這說(shuō)明當(dāng)DF 與FA 共同作用時(shí)，它們對(duì)含有色氨酸殘基的蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了中和的效果，使這部分蛋白構(gòu)象的變化程度降低。

從圖中還可以看出，含有FA 組別的最高峰位置向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，即發(fā)生了紅移現(xiàn)象。這說(shuō)明在添加了FA 后色氨酸周圍的極性微環(huán)境發(fā)生了變化。相比于其它組別，色氨酸暴露在了極性更強(qiáng)的微環(huán)境中。

2.5 DF 與FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程GMP 紫外吸收光譜的影響

圖5 為各組GMP 蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜。由圖可知，添加同種物質(zhì)組別的出峰位置與峰高都較為集中，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的差異，這說(shuō)明在醒發(fā)的過(guò)程中色氨酸與酪氨酸的暴露程度與數(shù)量、周圍極性微環(huán)境沒(méi)有出現(xiàn)明顯的變化。

圖5 添加DF、FA 及DF+FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程中GMP 紫外吸收光譜的影響Fig.5 Effects of DF，F(xiàn)A and DF+FA on the ultraviolet absorption spectrum of GMP during resting process

DF 組與Flour 組相比紫外吸收峰強(qiáng)度與峰位置沒(méi)有明顯的區(qū)別，說(shuō)明DF 的加入沒(méi)有導(dǎo)致含有酪氨酸殘基的結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化。添加FA對(duì)GMP 紫外吸收光譜的強(qiáng)度的影響較大，說(shuō)明FA 作為配體分子與蛋白質(zhì)相關(guān)氨基酸殘基之間的相互作用更為強(qiáng)烈，它可能與蛋白質(zhì)分子之間通過(guò)共價(jià)作用形成了蛋白質(zhì)-酚酸復(fù)合物，對(duì)GMP 的蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，肽鏈的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得蛋白質(zhì)分子中含有酪氨酸殘基結(jié)構(gòu)的暴露程度增加。而這種構(gòu)象的變化有利于蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基和酪氨酸殘基中芳香環(huán)的π-π*躍遷，表現(xiàn)為紫外光譜的吸光度增強(qiáng)[30]。DF+FA 組的紫外吸收強(qiáng)度相比于單獨(dú)添加FA 的組別有所降低，這說(shuō)明當(dāng)DF 與FA 共同作用時(shí)，它們對(duì)含有色氨酸、酪氨酸殘基的蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了中和的效果，使蛋白構(gòu)象的變化程度降低。

從圖中還可以看出，含有FA 的組別在310 nm 附近出現(xiàn)了新的吸收峰，這是由于阿魏酸其自身酚酸的結(jié)構(gòu)引起的。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，含有FA 組別的最高峰位置向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，即發(fā)生了紅移現(xiàn)象。這說(shuō)明FA 作為配體分子與蛋白質(zhì)結(jié)合后使色氨酸與酪氨酸周圍的極性微環(huán)境發(fā)生了變化。相比于其它組別，色氨酸與酪氨酸暴露在了極性更強(qiáng)的水相環(huán)境中，引起兩種方式電子軌道躍遷能量減小，表現(xiàn)為吸收峰的紅移。

2.6 DF 與FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程GMP 游離氨基的影響

圖6 為各組GMP 中游離氨基含量變化。由圖可知，添加DF、FA 均會(huì)使GMP 中的游離氨基含量下降。面團(tuán)醒發(fā)90 min 時(shí)，DF 與FA 使GMP 蛋白質(zhì)分子中游離氨基含量分別顯著下降（P＜0.05）22.48%與17.38%。FA 作為一種具有酚羥基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，其所含有的酚羥基具有較高的交聯(lián)活性，易與肽鏈上具有游離氨基側(cè)鏈的氨基酸殘基發(fā)生相互交聯(lián)，導(dǎo)致GMP 中的游離氨基含量下降。Zhang 等[31]的研究發(fā)現(xiàn)單寧酸的酚羥基與面筋蛋白中的游離氨基之間可能形成了非二硫鍵的其它化學(xué)鍵，單寧酸作用于蛋白質(zhì)時(shí)所發(fā)生的相互作用引起了面筋蛋白中游離氨基含量的降低。DF 由于含有半縮醛羥基，也會(huì)與GMP 分子中的游離氨基發(fā)生相互作用，導(dǎo)致了游離氨基含量的下降。同時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)Flour 組在醒發(fā)的過(guò)程中游離氨基含量沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），但添加了DF、FA 后各組游離氨基的含量均隨著醒發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這說(shuō)明在醒發(fā)的過(guò)程中，DF、FA 與GMP 蛋白質(zhì)分子的游離氨基之間的交聯(lián)作用逐漸增強(qiáng)，更多的游離氨基與FA、DF 結(jié)合，導(dǎo)致了游離氨基含量的顯著下降（P＜0.05）。另外，蛋白中游離氨基含量的降低也說(shuō)明膳食纖維與阿魏酸會(huì)和GMP 蛋白分子中的游離氨基之間產(chǎn)生共價(jià)鍵[31]，而這也可能是導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的原因之一[32]。

圖6 添加DF、FA 及DF+FA 對(duì)面團(tuán)醒發(fā)過(guò)程中GMP 游離氨基含量的影響Fig.6 Effects of DF，F(xiàn)A and DF+FA on the free amino groups of GMP during resting process

3 結(jié)論

DF 與FA 的添加會(huì)對(duì)GMP 蛋白質(zhì)的分子聚集產(chǎn)生影響，并且會(huì)與GMP 蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生分子間相互作用，使GMP 的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化。在0～60 min 醒發(fā)的時(shí)間范圍內(nèi)，DF 使大粒徑GMP 的體積分?jǐn)?shù)增加，F(xiàn)A 則增加了小粒徑GMP 的體積分?jǐn)?shù)。FA 會(huì)導(dǎo)致較高分子質(zhì)量范圍的GMP 發(fā)生解聚，DF+FA 能夠平衡FA 對(duì)GMP 蛋白分子質(zhì)量分布以及亞基比值的影響，也會(huì)降低單獨(dú)添加DF或FA 對(duì)GMP 粒徑分布的影響。添加DF、FA 均會(huì)使GMP 高分子谷蛋白亞基與低分子谷蛋白亞基的比值下降。DF 與FA 使GMP 分子中含有色氨酸、酪氨酸等蛋白結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，F(xiàn)A使GMP 的色氨酸熒光色譜與紫外吸收光譜發(fā)生紅移，使色氨酸、酪氨酸殘基的極性微環(huán)境發(fā)生變化。DF、FA 由于與GMP 分子發(fā)生共價(jià)交聯(lián)的相互作用，使GMP 中的游離氨基含量發(fā)生顯著下降。