殼寡糖對腐敗真菌的抑菌活性及其機理

張苗苗，柯 媛，董同珺，伍修德，肖甚圣，王學東，丁貝貝

（武漢輕工大學食品科學與工程學院 武漢 430000）

曲霉屬在自然界分布極廣，廣泛應用于傳統(tǒng)釀造業(yè)、現(xiàn)代發(fā)酵業(yè)及生物工程研究中，具有重要的經(jīng)濟意義[1]。該屬是引起多種物質(zhì)霉腐的主要微生物之一，會產(chǎn)生有毒次級代謝物，如赭曲霉毒素，污染食品、飼料及中藥，嚴重危害動物及人類健康[2-3]。作為重要的發(fā)酵工業(yè)菌屬，黑曲霉能導致水分較高的糧食霉變。食品行業(yè)一般通過篩選谷物產(chǎn)品中是否存在這類真菌，并使用抗生素抑制其生長，防止食品腐敗[4]。然而，食品中殘留的抗生素會導致人體耐藥性增加，這在很大程度上限制了臨床治療的選擇，嚴重影響人類健康[5]。亟待開發(fā)具有生物降解性的新型無毒、高效的抗菌劑，以保障食品品質(zhì)和保護人類健康。

殼寡糖（COS）是殼聚糖的降解產(chǎn)物，是由2～20 個氨基葡萄糖通過β-1，4 糖苷鍵鏈接而成的寡聚糖，具有良好的水溶性及生物活性，在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領域有廣泛的應用前景[6]。劉芳等[7]研究發(fā)現(xiàn)COS 對原料乳中細菌總數(shù)和嗜冷菌數(shù)均有顯著的抑制作用，且COS 的濃度和抑菌效果呈正相關，進一步驗證了抗菌活性與COS 氨基含量和氨基質(zhì)子化密切相關。Plascencia 等[8]研究認為殼聚糖能夠提高幾丁質(zhì)酶的活性，影響細胞壁的形成，并且可以聚集孢子，造成細胞形態(tài)異常，胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，甚至導致微生物死亡。此外，COS 溶解性好、易于吸收，可作為生物保鮮劑應用于醫(yī)藥、食品及化妝品等領域，并且有降血脂、抗衰老、提高免疫力等功效，被認為是一種潛在的天然抗菌防腐劑[9-10]。

COS 是一種具有生物活性的殼聚糖低聚物，有潛力作為一種天然抗菌防腐劑來改變微生物細胞膜的通透性，并影響微生物的生長和存活。目前，COS 對腐敗真菌的抑制研究還鮮有報道。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)COS 對黃曲霉和煙曲霉有較好抑制作用[10]。本文通過測定最低抑菌濃度（MIC）、菌絲生長抑制率和孢子萌發(fā)抑制率揭示COS 對黑曲霉、赭曲霉和雜色曲霉的抑菌活性，通過觀測細胞微觀結構、漿膜損傷、細胞膜透性、幾丁質(zhì)含量和活性及可溶性蛋白含量變化來評估細胞壁和細胞膜的完整性，厘清COS 對黑曲霉、赭曲霉和雜色曲霉的抑菌活性及抑菌機制，為COS在食品貯藏領域的開發(fā)和應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

COS（水分質(zhì)量分數(shù)9.07%，純度≥90%，聚合度為3～6），濟南海得貝海洋生物工程有限公司；菌株（GDMCC 3.386 黑曲霉，GDMCC 3.28 赭曲霉，GDMCC 3.473 雜色曲霉），廣東省微生物菌種保藏中心；馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB），上海博微生物科技有限公司；丙二醛含量測試盒（G0110W），蘇州格瑞銳思生物科技有限公司；幾丁質(zhì)酶活性測定試劑盒（BC0820），北京索萊寶科技有限公司；蛋白濃度測定試劑盒（G3522-200T），廣州捷倍斯生物科技有限公司。

1.2 設備

BXM-75VE 滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；HNY-200B 恒溫搖床，天津市歐諾有限公司；HP150MJ-B 霉菌培養(yǎng)箱，武漢瑞華有限責任公司；SpectraMax M2e 酶標儀，美國Molecular Devices；EVOLUTION220 紫外光光度計，美國Thermo scientific；Sorvall RC6 plus 離心機，美國賽默飛世爾；S-3000N 掃描電鏡，日本日立公司；F-4600 熒光光譜儀，日本日立HITACHI；FV1200 激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus。

1.3 方法

1.3.1 COS 對真菌最小抑菌濃度的測定 通過微量稀釋法對COS 的MIC 進行評估。首先取10 g COS 溶于20 mL 的無菌水混合制成COS 溶液，再用二倍稀釋法稀釋成500～0.24 mg/mL 至96 孔板。制備一排陰性對照（PDB）和一排陽性對照（PDB+真菌），將孔板于28 ℃條件下培養(yǎng)2 d，記錄最小抑菌濃度MIC[11]。

1.3.2 COS 對菌絲生長抑制率的測定 先將COS制成MIC、2MIC 濃度的兩種COS 溶液，再往含有90 mL 的PDA 培養(yǎng)基中吸取不同濃度的10 mL COS 溶液，每個平板培養(yǎng)基中加入1 塊直徑為6.00 mm 的菌餅，菌絲體向下，28 ℃培養(yǎng)箱下3 d，測定菌落直徑[12]，根據(jù)下列公式計算菌絲抑制率：

1.3.3 COS 對真菌孢子萌發(fā)抑制率的測定 取一支已經(jīng)活化好的菌種，在無菌條件下，用PDB 溶液制成孢子懸浮液，取凹玻片，滴入45 μL 的菌孢子懸浮液和15 μL 不同濃度的COS，并設置對照。將凹玻片于28 ℃條件下培養(yǎng)2 d，在顯微鏡下統(tǒng)計100 個孢子[13]，根據(jù)下列公式計算孢子萌發(fā)抑制率：

1.3.4 細胞微觀結構的測定 將菌懸液接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)2 d，收獲菌絲體，用蒸餾水洗滌2 次，棄去上清液，真菌菌體沉淀用2.5%戊二醛溶液固定24 h，冷凍干燥，噴金，最后在掃描電鏡下觀察[14]。

1.3.5 漿膜損傷的測定 將真菌懸液接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，對照組為未經(jīng)過COS 處理的樣品。收獲菌絲體，用蒸餾水洗滌2次，將細胞洗凈，棄去上清液，用0.5 mL PBS 重懸，用終質(zhì)量濃度為1 mg/mL PI 溶液在PBS 中室溫黑暗染色30 min，然后用激光共聚焦顯微鏡觀察每個樣品[15]。

1.3.6 細胞膜滲透性的測定 將菌懸液接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)1～2 d，將菌絲在4℃、10 000 r/min 條件下離心20 min，得到上清液，測定其電導率[11]。

1.3.7 核酸泄露值的測定 將菌懸液接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，在180 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)2 d。未經(jīng)COS 處理的樣本作為對照組。在4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，得到上清液，然后，用紫外分光光度計測定260 nm 時各菌液的吸光值為核酸泄露值[16]。

1.3.8 幾丁質(zhì)含量的測定 將真菌懸液接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃條件下接種12 h 后，未經(jīng)過COS處理的樣品作為對照。用蒸餾水洗滌2 次，用0.025%剛果紅在暗光中染色5 min，樣品用熒光光譜儀檢測，選擇540 nm 激發(fā)波長和500～900 nm 發(fā)射光譜進行分析[11]。

1.3.9 幾丁質(zhì)酶活性的測定 在無菌條件下，將1 mL 菌懸液直接接種于含有MIC、2MIC 濃度COS 的PDB 培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)3 d 后，洗滌，收集菌絲，稱重。然后研磨至糊狀，轉入離心管中，8 000 r/min，4 ℃離心25 min，取上清液為所提酶液，用幾丁質(zhì)酶活性測定試劑盒測定。

1.3.10 可溶性蛋白濃度的測定 在無菌條件下，將菌懸液直接接種于含有MIC 和2MIC 濃度COS的PDB 培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)2 d，經(jīng)過濾、沖洗菌絲后，再用磷酸緩沖液（0.2 mo1/L，pH 7.5）沖洗3 次，用濾紙吸干后獲得菌絲，再稱取0.5 g 菌絲于研缽中，依次加入2 mL磷酸緩沖液和1 g 石英砂在冰浴中將菌絲研磨至糊狀，轉移至離心管中，不足10 mL 通過添加磷酸緩沖液補足，并于4 ℃，10 000 r/min 條件下離心15 min，未用COS 處理的樣本作為對照組，取上清液于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫儆玫鞍诐舛葴y定試劑盒測定。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析與處理 每組試驗重復測定3次，結果表示為：平均值±標準誤差。利用Origin 8.5 軟件對原始數(shù)據(jù)進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 COS 對真菌最小抑菌濃度的影響

最小抑菌濃度（MIC）可用于定量表示抑菌劑的抑菌性能，COS 對3 種真菌的最小抑菌濃度（MIC）見表1。由表可知，COS 對被試菌的MIC 范圍在15.6～31.2 mg/mL 之間，COS 對赭曲霉、雜色曲霉的MIC 值為15.6 mg/mL，而對黑曲霉的MIC值為31.2 mg/mL，這與前人的研究結果有相似之處。錢建瑛等[17]研究發(fā)現(xiàn)，40 mg/mL 的COS 對大腸桿菌抑菌活性有56%。穆曉麗[18]研究發(fā)現(xiàn)COS對米曲霉有抑制作用，COS 質(zhì)量濃度為12 g/L 時抑菌效果最好。從表1 也可知，COS 質(zhì)量濃度在32 mg/mL 以上時可以有效的抑制3 種真菌的生長，但3 株腐敗真菌對COS 的敏感程度不同，該現(xiàn)象可能與菌株的自身活力有關，即COS 對不同真菌的抑菌效果不同，說明COS 對不同菌種的抑制作用是一致而特異的。

表1 COS 對真菌的最小抑菌濃度（MIC）Table 1 MICs of COS against fungi

2.2 COS 對菌絲生長抑制率的影響

COS 對不同真菌菌絲生長抑制如表2 所示。由表2 可知，COS 對3 種真菌的菌絲生長均有抑制作用，且COS 對真菌菌絲生長的影響隨著COS濃度的增加而逐漸增大，即存在濃度依賴性。當COS 濃度為MIC 時，對3 種真菌菌絲生長抑制率都在30%以上，其中對雜色曲霉的菌絲生長抑制作用最明顯，達到40%，原因可能是雜色曲霉的生長活性最弱；當COS 濃度為2MIC 時，對3 種真菌菌絲生長抑制作用明顯，抑制率都在55%以上，對黑曲霉菌絲生長抑制率最明顯達到82%以上。馬增新等[19]也研究發(fā)現(xiàn)，COS 對4 種青霉菌菌絲生長均具有抑制作用，且存在濃度依賴性，隨濃度的升高抑制作用加強。周國春[20]研究發(fā)現(xiàn)，200 μg/mL COS 處理組對交鏈孢菌絲生長抑制率有7.94%。胡國元等[21]研究得出COS 對煙草赤星病病原菌（鏈格孢菌）有明顯的抑制作用，抑菌率可達到80%以上。顧麗嬙[22]研究發(fā)現(xiàn)，COS 濃度對灰霉病菌的抑制作用呈正相關，1 500 mg/L COS 對灰霉病菌菌絲生長的抑制率均在80%以上，菌絲直徑明顯增粗，間隔變多。臧珉等[23]研究發(fā)現(xiàn)，COS濃度增加，抑制率提高，5 g/L COS 對棉花枯萎病菌的抑制率達到20%，對煙草赤星菌菌絲生長的抑制率為14%。

表2 COS 對真菌菌絲生長抑制率Table 2 Inhibitory rate of COS on hypha growth of fungi

2.3 COS 對真菌孢子萌發(fā)抑制率的影響

COS 對3 種真菌孢子萌發(fā)影響結果如表3 所示。由表3 可知，COS 對不同真菌孢子萌發(fā)的影響不同，當COS 濃度為MIC 時，對3 種真菌孢子均有抑制作用，對雜色曲霉的孢子萌發(fā)抑制能力最強，與菌絲生長抑制實驗結果相符合。COS 隨著濃度的增加對3 種真菌抑制作用稍加明顯，當COS濃度為2MIC 時，對這3 種真菌孢子萌發(fā)抑制率也都在36%以上，表明2MIC 的COS 能有效地抑制孢子萌發(fā)，這可能是菌株經(jīng)過COS 處理后，引起芽管產(chǎn)生畸形，芽管長度與對照組相比較短，使萌發(fā)率下降。COS 對真菌孢子萌發(fā)抑制率與菌絲生長抑制率結果類似。馬增新等[19]研究發(fā)現(xiàn)，COS對4 種青霉菌孢子萌發(fā)均具有抑制作用，且隨著COS 濃度的升高，抑制效果逐漸增強。顧麗嬙[22]研究發(fā)現(xiàn)，在1 500 mg/L 的質(zhì)量濃度下，COS 對灰霉病菌的產(chǎn)孢抑制率為83.82%，抑制孢子萌發(fā)率達52.97%。周國春[20]研究發(fā)現(xiàn)，在50～500 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，COS 對交鏈孢菌孢子萌發(fā)抑制作用強于產(chǎn)孢作用。隨著COS 濃度的增大，抑制作用逐漸增強。100 μg/mL COS 處理組的孢子萌發(fā)抑制率在50%以上，500 μg/mL COS 處理組對孢子萌發(fā)的抑制率達到了100%。本研究中，COS 對孢子萌發(fā)的抑制作用要小于對菌絲的抑制作用，這可能是因為孢子和菌絲對COS 的敏感程度不同。

表3 COS 對真菌孢子萌發(fā)影響Table 3 Effects of COS on spore germination of fungi

2.4 COS 對真菌細胞微觀結構的影響

掃描電鏡試驗結果如圖1 所示，各組供試菌對照組的真菌菌絲形狀規(guī)則且完整，菌絲飽滿且比較均勻一致，對于黑曲霉、雜色曲霉，在COS 濃度為MIC 時，菌絲變得皺縮畸形，干癟，甚至出現(xiàn)菌絲斷裂，出現(xiàn)塌陷現(xiàn)象，在COS 濃度為2MIC時，菌絲表面粗糙有突起，出現(xiàn)菌絲斷裂、內(nèi)容物外滲的現(xiàn)象；對于赭曲霉，在COS 濃度為MIC 和2MIC 時，菌絲表面粗糙有突起，內(nèi)容物也有外滲的現(xiàn)象。表明COS 對這3 種腐敗真菌有明顯損傷作用。該結果與周國春[20]的研究結果相似，通過掃描電鏡觀察到菌絲經(jīng)過COS 處理后，菌絲干癟，發(fā)生皺縮，且有菌絲斷裂現(xiàn)象，表面凹凸不平，菌絲破壞嚴重，且隨著濃度的增大，菌絲的破壞程度増加，這可能是濃度越大，菌絲與COS 的接觸機會越多，COS 對菌絲的破壞也就越大。

圖1 COS 對真菌細胞微觀結構的影響Fig.1 Effects of COS on the cell microstructure of fungi

2.5 COS 對真菌漿膜損傷的影響

碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）可穿過受損的細胞膜進入細胞，并與DNA 特異性結合，發(fā)出紅色熒光，但無膜通透性，不能透過活細胞膜，只能染死細胞，因此，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞不能著色，壞死細胞呈紅色熒光[14]。所以本研究中我們采用的是PI 染色的方法，再通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察真菌細胞染色后熒光強度來反映COS 對3 種真菌漿膜損傷的影響，結果如圖2所示。

圖2 COS 對真菌漿膜損傷的影響Fig.2 Effects of COS on serosal membrane injury of fungi

由圖2 可知，相對于對照組，經(jīng)COS 處理的3種真菌都能觀察到熒光信號，并且可以看到COS濃度為2MIC 的處理組熒光強度明顯強于COS 濃度為MIC 的處理組，因此說明COS 對真菌的細胞膜有一定的影響，會破壞細胞膜的完整性，也使得真菌有不同程度的死亡，并呈濃度依賴性，隨COS濃度越高，對細胞膜的完整性破壞越嚴重，菌的死亡率越高。王瑩[24]通過激光共聚焦研究發(fā)現(xiàn)當50 ku 的殼聚糖進入黑曲霉內(nèi)部時，細胞膜破壞，與本文研究結果一致。

2.6 COS 對真菌細胞膜滲透性的影響

滲透壓決定著細胞內(nèi)外的水平衡，水能通過半透膜出入細胞，蔗糖與蛋白質(zhì)等大分子則不能通過，因此可以通過測定溶液電導率的變化來了解細胞膜滲透性的變化[15]。COS 作用于3 種真菌后電導率的變化結果如表4 所示，由表可知，經(jīng)COS 處理后，各組腐敗真菌培養(yǎng)液的電導率均升高，且處理組溶液的電導率隨COS 濃度的增大而增大，其中黑曲霉組由0.10 ms/cm 升高至0.98 ms/cm，赭曲霉組由0.04 ms/cm 升高至0.52 ms/cm，雜色曲霉組由0.12 ms/cm 升高至0.59 ms/cm，相比較而言，黑曲霉的變化最明顯。上述試驗結果表明，COS 對真菌的細胞膜滲透性有作用，提高了細胞膜通透性，菌絲體內(nèi)部的一些重要離子如鉀離子和鈉離子會泄漏，外滲進入到培養(yǎng)液中，更多的小分子，如電解質(zhì)被釋放[25]，這些離子的流失會影響細胞內(nèi)多種生物酶的合成和工作，使細胞的代謝活動受阻，此外，離子的流失也會影響細胞內(nèi)外滲透壓，使細胞破裂，最終導致菌體死亡[26]。Liu等[27]研究也發(fā)現(xiàn)殼聚糖的抑菌作用是通過增加菌膜的通透性，導致胞內(nèi)物質(zhì)外滲實現(xiàn)的。對于黃曲霉，經(jīng)MIC 及2MICCOS 溶液處理后，電導率與對照組相差較大，電導率的增加更為顯著，即COS易導致黃曲霉細胞內(nèi)成分的泄漏，可能是抗菌成分與胞質(zhì)膜相互作用所致[28]。這3 種真菌的電導率改變不一樣可能與同一COS 處理時不同成分和細胞膜結合位點的作用有關[29]。

表4 COS 對真菌電導率的影響Table 4 Effects of COS on the electrical conductivity of fungi

2.7 COS 對真菌核酸泄露值的影響

細胞膜是多數(shù)抑菌劑的作用位點，抑菌劑與細菌細胞膜相互作用導致細胞膜的功能發(fā)生改變，通過測定260 nm 處的吸光度值，可以對COS對真菌的細胞膜的通透性進行推測[12]。在260 nm下，通過測定不同溶度的COS 溶液處理后的真菌菌液的吸光值，了解COS 溶液對真菌核酸泄露的影響，吸光值越大說明核酸泄露越多。

COS 對3 種真菌核酸泄露的影響結果如表5所示。從表5 可以看出，與對照組相比，COS 濃度為MIC、2MIC 的處理組菌液吸光值都增大了，其中，當COS 濃度為MIC 時，黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉菌液吸光度值分別增大了0.149，0.084，0.110，當COS 濃度為2MIC 時，黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉菌液吸光度值分別增大了0.242，0.124，0.183，即菌液的吸光值與COS 濃度成正比。吸光度增大可能原因是加入多糖后，可以增加菌體細胞膜的通透性，導致細胞溶出物顯著增加，對膜結構造成不可修復的傷害，多糖濃度越高，傷害越大[30]。有研究表明，殼聚糖的低聚物能進入大腸桿菌內(nèi)部[24]，殼聚糖存在的大量陽離子基團NH3+能夠與菌外膜上帶負電的脂多糖、磷脂、脂蛋白等反應，進而改變外膜的結構使得外膜的通透性增加[12]。

表5 COS 對真菌核酸泄露的影響Table 5 Effects of COS on nucleic acid leakage of fungi

2.8 COS 對真菌幾丁質(zhì)含量的影響

幾丁質(zhì)是真菌細胞質(zhì)的重要組成部分，對維持細胞壁結構的完整性有重要作用，在正常情況下，幾丁質(zhì)的組成和降解過程是在動態(tài)平衡下進行的，這種平衡的紊亂會導致細胞死亡[5]。COS 對真菌幾丁質(zhì)含量的影響結果如圖3，由圖3 可知，當黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉經(jīng)過MIC 濃度的COS 處理后，與對照組相比，其幾丁質(zhì)含量分別下降了56.87%，56.34%和39.55%，當COS 的濃度為2MIC 時，跟對照組相比，幾丁質(zhì)含量分別下降了88.12%，81.54%和84.03%，結果表明，不同濃度的COS 對真菌的幾丁質(zhì)含量有顯著的抑制作用，并且?guī)锥≠|(zhì)含量呈濃度依賴性下降，推測可能原因是，COS 破壞了真菌的幾丁質(zhì)組成和降解過程的動態(tài)平衡，對細胞壁結構的完整性有破壞作用，產(chǎn)生紊亂并導致真菌細胞的死亡。

圖3 COS 對真菌幾丁質(zhì)的影響Fig.3 Effect of COS on fungi chitin

2.9 COS 對真菌幾丁質(zhì)酶活性的影響

幾丁質(zhì)酶能夠催化細胞壁中的幾丁質(zhì)水解為幾丁寡糖，破壞細胞器，從而抑制真菌的生長[12]。通過測定COS 處理的幾種真菌培養(yǎng)液中幾丁質(zhì)酶活性可以推測COS 對真菌的抑菌方式。本試驗測定了菌體胞內(nèi)的幾丁質(zhì)酶活性，不同濃度COS對真菌幾丁質(zhì)酶活性結果如圖4 所示。

圖4 COS 對真菌幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.4 Effect of COS on chitinase activity of fungi

由圖4 可以看出，與對照組相比，這3 種腐敗真菌經(jīng)COS 處理后其菌體胞內(nèi)的幾丁質(zhì)酶活性顯著增大，且隨著COS 濃度的增加而增大，呈正相關關系。其中經(jīng)過不同濃度的COS 處理后黑曲霉菌體胞內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性由對照組的24.16 U/g升高到54.49 U/g，赭曲霉由對照組的27.82 U/g 升高到47.28 U/g，雜色曲霉由對照組的17.82 U/g 升高到41.20 U/g，黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉在MIC處理后幾丁質(zhì)酶活性較對照組分別增加了46.9%，33.5%，52.6%。研究結果表明，隨著COS 濃度的增加，幾丁質(zhì)酶活性增強，促進幾丁質(zhì)酶解，最終導致細胞表皮變薄，阻礙其生長[5]。有研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖作為幾丁質(zhì)酶的底物，能激活真菌內(nèi)的幾丁質(zhì)酶的活性，導致細胞變形使其繁殖受阻[24]，與本研究結果一致。

2.10 COS 對真菌可溶性蛋白濃度的影響

可溶性蛋白是細胞重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護作用[16]。本試驗分別用0、MIC、2MIC 不同濃度的COS 溶液來處理幾種真菌，觀察其對真菌可溶性蛋白的影響，結果如圖5 所示。

圖5 COS 對真菌可溶性蛋白濃度的影響Fig.5 Effects of COS on the concentration of soluble proteins in fungi

從圖5 可以看出，3 種真菌在經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，處理組的菌絲蛋白濃度均與對照組不同，經(jīng)各種濃度的COS 作用的菌絲體之間以及與對照組菌絲體間的可溶性蛋白質(zhì)含量差異顯著。與對照組相比，經(jīng)COS 處理后真菌菌絲內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)大量外滲，且COS 濃度越高，外滲量越高，菌絲體內(nèi)濃度越低，即隨COS 濃度的增大，菌絲體內(nèi)可溶性蛋白濃度呈降低的趨勢，其中，經(jīng)過不同濃度的COS 處理后黑曲霉的可溶性蛋白濃度由對照組的1.07 μg/μL 降低到0.60 μg/μL，赭曲霉由對照組的1.08 μg/μL 降低到0.74 μg/μL，雜色曲霉由對照組的1.55 μg/μL 降低到0.95 μg/μL，黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉MIC 處理組可溶性蛋白濃度較對照組分別降低了32.0%，24.6%，18.1%，2MIC 處理組可溶性蛋白濃度較對照組分別降低了44.4%，31.4%，38.5%。這說明MIC、2MIC 的COS 使得細胞已經(jīng)破損，使其可溶性蛋白的合成受到影響，或者是因為COS 破壞了菌的細胞膜結構，使可溶性蛋白通過細胞膜滲出，造成3 種真菌菌絲可溶性蛋白質(zhì)的嚴重流失。

3 結論

本文探討了COS 對黑曲霉、赭曲霉、雜色曲霉的抗菌活性及機理。研究得到結論如下：COS 對供試菌的抑菌質(zhì)量濃度范圍在15.6～31.2 mg/mL，COS 處理導致菌絲體變形、膜透性增加、漿膜損傷和細胞質(zhì)內(nèi)容物滲漏，COS 還呈劑量依賴性地減少幾丁質(zhì)的產(chǎn)生，增強幾丁質(zhì)酶的活性，并導致可溶性蛋白質(zhì)大量外滲。這些特性表明COS 可以通過破壞細胞壁和細胞膜以及破壞正常的細胞代謝來抑制食物腐敗真菌生長。此外，COS 對人和動物無毒，在食品工業(yè)中的應用前景廣闊。