殼寡糖及其相關(guān)衍生物對(duì)幽門螺旋桿菌的抑菌作用

林穎珺，韓堯躍，栗 華，姜發(fā)琴*，傅 磊，張 倩，林秀芬

（1 上海交通大學(xué)藥學(xué)院 上海 200240 2 廈門藍(lán)灣科技有限公司 福建廈門 361026 3 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 福建廈門 361003）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，簡(jiǎn)稱Hp）寄生于腸道，是一種螺旋形、微厭氧革蘭氏陰性菌。目前感染超過(guò)全球50%以上的人群，與多種胃腸道疾病及胃腸外疾病密切相關(guān)，如消化性潰瘍、慢性胃炎及胃癌等，被歸類為第1 類致癌物[1-3]。

目前幽門螺旋桿菌的治療方案包括伴同療法、混合療法、包含左氧氟沙星的方案[4]。頻發(fā)的抗生素耐藥性問(wèn)題以及臨床治愈后的復(fù)發(fā)率上升讓人重新審視幽門螺旋桿菌的治療方案。2010 年全球幽門螺旋桿菌的復(fù)發(fā)率呈現(xiàn)地區(qū)化分布規(guī)律，復(fù)發(fā)率已達(dá)4.8%，高于1990 年的3.9%。幽門螺旋桿菌對(duì)克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐藥率（包括多重耐藥率）在2016 年被發(fā)現(xiàn)呈直線上升趨勢(shì)，其中克拉霉素為20%～50%，甲硝唑?yàn)?0%～70%[5]。一線治療方案如克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑以及質(zhì)子泵抑制劑聯(lián)用的治療方案治愈率有所下滑，其最主要的原因在于克拉霉素的耐藥性上升[6]。因此臨床治療中常常需要延長(zhǎng)臨床治療周期，由此常帶來(lái)多種胃腸道反應(yīng)，如惡心、味覺(jué)障礙、消化不良、腹痛、腹瀉。腦腸同軸理論中指出，胃腸動(dòng)力受大腦的調(diào)節(jié)主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，即神經(jīng)傳導(dǎo)和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)[7]。過(guò)度使用抗生素可能帶來(lái)的胃腸功能紊亂，腸易激綜合征（IBS）以及情緒問(wèn)題，給人的正常生活帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。

近年來(lái)出現(xiàn)的益生元、益生菌療法可以很好地解決臨床治愈率下降以及副作用等多重問(wèn)題[8]。殼寡糖及其相關(guān)化合物是一種以甲殼綱動(dòng)物為來(lái)源的優(yōu)質(zhì)益生元，具有出色的生物活性[9]。據(jù)Zheng 等[10]研究，殼聚糖對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具備抗菌活性，以甲殼綱動(dòng)物為原料的殼寡糖及其系列產(chǎn)物，被證明具有一定的抑菌效果。殼寡糖被列入我國(guó)新食品原料目錄，擁有極大的市場(chǎng)應(yīng)用前景[11]。目前國(guó)內(nèi)外益生元抑制幽門螺旋桿菌的報(bào)道更多的集中在組合療法，如抗生素與益生菌結(jié)合療法[12-13]，還未見(jiàn)系統(tǒng)性的體外抗菌研究。本次研究中對(duì)比研究殼寡糖及其相關(guān)產(chǎn)物的體外抗幽效果，希望能夠?yàn)楹罄m(xù)臨床抗幽門螺旋桿菌的新型療法提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌株

幽門螺旋桿菌，編號(hào)GDMCC 1.1820，購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心，采用冷凍干燥保藏管進(jìn)行保存。

1.2 主要試劑與耗材

腦心浸液粉，OXOID；哥倫比亞瓊脂，環(huán)凱微生物；無(wú)菌脫纖維羊血，南京茂捷微生物；真菌培養(yǎng)皿，BIOFIL；殼聚糖（脫乙酰度＞90%），羧甲基殼聚糖，殼寡糖A，殼寡糖B。

1.3 主要設(shè)備與儀器

HL-B 型厭氧工作站，LABIOPHY；HF100 型三氣培養(yǎng)箱，力康；STARTER3100 型pH 計(jì)，OHAUS。

2 試驗(yàn)方法

2.1 主要物料及溶液的制備

2.1.1 主要物料的制備 本次研究試驗(yàn)中所涉及的殼聚糖及殼寡糖、羧甲基殼聚糖均為自主研發(fā)制備而成，以阿拉斯加雪蟹殼為主要原料，通過(guò)“一步法”制備的高脫乙酰度殼聚糖，然后以反應(yīng)工藝所獲得的殼聚糖，通過(guò)復(fù)合生物酶法制備的不同脫乙酰度的殼寡糖，并以化學(xué)法制備獲得的特定聚合度的羧甲基殼聚糖，將直接用于后續(xù)抑菌性試驗(yàn)研究。

2.1.2 主要溶液的配制

1）幽門螺旋桿菌培養(yǎng)基的配制：稱取腦心浸液粉9.6 g、哥倫比亞瓊脂23.4 g，加入蒸餾水780 mL，100 mL 分裝后高壓滅菌15 min，當(dāng)溫度降至46 ℃時(shí)每100 mL 加入5 mL 無(wú)菌脫纖維羊血，倒板待用。

2）不同濃度的殼聚糖溶液配制方法如下：殼聚糖溶液（10 mg/mL）：稱取0.5 g 殼聚糖粉末，加入1%醋酸溶解，定容至50 mL，測(cè)得pH 值為4.08，使用0.22 μm 濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌。5 mg/mL殼聚糖和1 mg/mL 殼聚糖溶液以相應(yīng)倍數(shù)進(jìn)行稀釋。殼聚糖溶液（20 mg/mL）：稱取1 g 殼聚糖粉末，加入2%醋酸溶解，定容至50 mL。

3）不同脫乙酰度殼寡糖原料，具體分類如下：

根據(jù)試驗(yàn)需求，分別取不同種類的殼寡糖原料，配制不同濃度梯度的殼寡糖原料，范圍為1～50 mg/mL，配制方法如下所示：

表1 不同脫乙酰度的殼寡糖Table 1 Chitosan oligosaccharide with degree of deacetylation

殼寡糖溶液（50 mg/mL）：稱取2.5 g 殼寡糖粉末，加入去離子水進(jìn)行溶解，定容50 mL，使用0.22 μm 濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌。

殼寡糖溶液（10 mg/mL）：稱取0.5 g 殼寡糖粉末，加入去離子水溶解，定容至50 mL，測(cè)得pH 值為5.45，使用0.22 μm 濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌。5 mg/mL 殼寡糖和1 mg/mL 殼寡糖溶液以相應(yīng)倍數(shù)進(jìn)行稀釋。

4）羧甲基殼聚糖溶液（10 mg/mL）：稱取0.5 g 羧甲基殼聚糖粉末，加入去離子水溶解，定容至50 mL，測(cè)得pH 值為9.65，使用0.22 μm 濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌。5 mg/mL 羧甲基殼聚糖和1 mg/mL 羧甲基殼聚糖溶液以相應(yīng)倍數(shù)進(jìn)行稀釋。羧甲基殼聚糖溶液（20 mg/mL）：稱取1 g 羧甲基殼聚糖粉末，加入去離子水溶解，定容至50 mL。

5）甲硝唑溶液（10 mg/mL）：稱取0.2 g 甲硝唑，加入1%醋酸進(jìn)行溶解，定容至20 mL。

2.2 體外抑菌試驗(yàn)檢測(cè)殼寡糖及其衍生物抑制幽門螺旋桿菌

根據(jù)周蓉等[15]改進(jìn)的體外抑菌性研究方法，以2.1 節(jié)中配置的溶液為試驗(yàn)組，研究在不同濃度下的殼寡糖、殼聚糖以及羧甲基殼聚糖的體外抗幽門螺旋桿菌的作用，陽(yáng)性對(duì)照為甲硝唑溶液，陰性對(duì)照組為無(wú)菌ddH2O 或醋酸溶液，空白對(duì)照為不添加任何試液。以下是具體方案：

從-80 ℃冰箱取出保藏的Hp 菌種，37 ℃水浴迅速解凍后，涂布于新鮮的平板上，37 ℃、5% O2、10% CO2培養(yǎng)48 h。觀察菌落形態(tài)為透明，灰白色，邊緣平整濕潤(rùn)，革蘭氏染色為陰性，挑取單菌落，純化培養(yǎng)3 代后，再進(jìn)行48 h 培養(yǎng)后，從平板上刮取少量Hp，重懸于1 mL 無(wú)菌ddH2O，根據(jù)OD625的大小將菌懸液濃度控制在107CFU/mL。

將該濃度的菌懸液進(jìn)行涂布試驗(yàn)，其中每個(gè)平板涂布100 μL 菌液，每個(gè)平板上打4 個(gè)孔，每孔加入50 μL 待測(cè)藥物，放入培養(yǎng)箱中以上述相同條件培養(yǎng)48 h，觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)半徑（mm），并拍照保存，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的處理方法同上。

2.3 殼寡糖及其相關(guān)產(chǎn)物對(duì)幽門螺旋桿菌體外生長(zhǎng)的影響

以2.2 節(jié)中驗(yàn)證獲得具備體外抑菌作用的物料，甲硝唑等加入幽門螺旋桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，控制初始幽門螺旋桿菌的濃度為107CFU/mL，觀察幽門螺旋桿菌的生長(zhǎng)情況，液體培養(yǎng)的發(fā)酵條件為事先摸索的幽門螺旋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶微需氧（6%O2、80%N2、10%CO2）的培養(yǎng)技術(shù)，置于恒溫?fù)u床中37 ℃振蕩培養(yǎng)，以不添加任何其它溶液的培養(yǎng)基作為調(diào)零溶液，記錄不同時(shí)間段的吸光度值OD625，運(yùn)用orgin2018 繪制菌體生長(zhǎng)曲線圖，討論殼寡糖對(duì)幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 殼聚糖、羧甲基殼聚糖對(duì)幽門螺旋桿菌的抑菌作用研究

打孔法測(cè)定生物活性物質(zhì)的抑菌性是藥敏學(xué)中常用的方法，該方法需要所研究的物料在平板上擴(kuò)散性較好，所以需要考察不同溶劑對(duì)于目標(biāo)產(chǎn)物的溶解性，選擇合適的溶劑和濃度作為載體，進(jìn)行后續(xù)的抑菌性試驗(yàn)。

3.1.1 不同溶劑溶解殼聚糖、殼寡糖及羧甲基殼聚糖的效果 殼聚糖是一種在酸性條件下溶解性好的生物大分子多糖，常用的溶解溶劑包括無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸。選擇不同種類的酸，配置成質(zhì)量濃度20 mg/mL 的殼聚糖溶液，觀察溶液的溶解情況，試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示：殼聚糖溶液在無(wú)機(jī)酸中的溶解速度和效果優(yōu)于有機(jī)酸，其中醋酸溶解速度快，所形成的溶液性質(zhì)為透明均一的液體。

表2 不同種類酸溶解殼聚糖（20 mg/mL）的情況Table 2 Dissolving description of Chitosan（20 mg/mL）with different kind of acid

目前大多關(guān)于殼聚糖溶液的研究一般以充分溶解的低濃度殼聚糖溶液為研究對(duì)象，溶液多以醋酸稀溶液為主，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%。故后續(xù)選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，2%的醋酸溶液作為溶劑，研究不同濃度下的殼聚糖的抑菌效果。由于殼寡糖、羧甲基殼聚糖極易溶于水，所以本次抑菌性試驗(yàn)所選擇的溶劑為無(wú)菌ddH2O，羧甲基殼聚糖是一種由殼聚糖的羧甲基化衍生物，水溶性較好，其在水中的最大溶解度為20 mg/mL。

3.1.2 殼聚糖及羧甲基殼聚糖的抑菌效果情況本研究中以醋酸溶液為溶劑，配置不同濃度的殼聚糖溶液，空白對(duì)照為1%，2%的醋酸（圖1 右下），以2.2 節(jié)中所提及方法，進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)，測(cè)定平板形成抑菌圈大小，試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示，結(jié)論顯示：以1%醋酸溶液為溶劑，質(zhì)量濃度為1，5，10，20，50 mg/mL 的殼聚糖溶液均未產(chǎn)生抑菌環(huán)，說(shuō)明以1%醋酸溶液為溶劑配置的不同質(zhì)量濃度的1～50 mg/mL 殼聚糖溶液以及對(duì)照1%醋酸對(duì)幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)均沒(méi)有抑制作用，但以2%醋酸溶液為溶劑，配置的殼聚糖溶液，質(zhì)量濃度為20，50 mg/mL 的殼聚糖溶液均出現(xiàn)極小的抑菌環(huán)，陰性對(duì)照2%的醋酸溶液的抑菌圈半徑為1 mm，從結(jié)果分析可能是2%醋酸溶液對(duì)幽門螺旋桿菌有抑菌作用，陽(yáng)性對(duì)照為10 mg/mL 甲硝唑溶液。

圖1 殼聚糖以及羧甲基殼聚糖抑菌平板示意圖Fig.1 Inhibit circle picture of Chitosan and carboxymethyl chitosan

圖2 殼寡糖對(duì)幽門螺旋桿菌的抑菌平板示意圖Fig.2 Inhibit circle picture of chitosan oligosaccharide

表3 不同濃度下殼聚糖溶液和羧甲基殼聚糖溶液的抑菌環(huán)情況Table 3 Chitosan and carboxymethyl chitosan's inhibit circle in different concentration

以無(wú)菌水為溶劑溶解，配置不同濃度的羧甲基殼聚糖，根據(jù)表2 抑菌環(huán)測(cè)試顯示，不同濃度的羧甲基殼聚糖均未形成抑菌環(huán)，說(shuō)明這些濃度的羧甲基殼聚糖不具備抑制幽門螺旋桿菌的作用，另外表中的陽(yáng)性對(duì)照為10 mg/mL 甲硝唑溶液，陰性對(duì)照為無(wú)菌ddH2O。

3.2 不同脫乙酰度的殼寡糖原料對(duì)幽門螺旋桿菌的抑菌作用研究以及最小抑菌濃度的確定

脫乙酰度是殼寡糖產(chǎn)品好壞的重要指標(biāo)，脫乙酰度的高低直接決定其在溶液中的溶解性，脫乙酰度越高，抑菌性越高；目前，大部分已有報(bào)道推測(cè)殼寡糖對(duì)于幽門螺旋桿菌的抑菌作用可能與酶切方式、pH 值、濃度有關(guān)，但還并未有報(bào)道研究脫乙酰度對(duì)于抗幽作用的影響。

通過(guò)對(duì)比兩種不同脫乙酰度的殼寡糖原料，以無(wú)菌水為溶劑分別溶解配置成不同濃度的殼寡糖溶液，以2.2 節(jié)中介紹的試驗(yàn)方法測(cè)定殼寡糖A和B 的體外抑菌情況，以下是通過(guò)抑菌試驗(yàn)獲得的抑菌環(huán)數(shù)據(jù)。

表4 不同脫乙酰度下的殼寡糖抑菌環(huán)情況Table 4 Inhibit circle of chitosan oligosaccharide in degree of deacetylation

通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果可以看到，不同濃度的殼寡糖A 未能在平板上生成抑菌環(huán)，而殼寡糖原料B 能夠具備抑制幽門螺旋桿菌的作用，最小抑菌質(zhì)量濃度為50 mg/mL。在該濃度下，所配置而成的殼寡糖溶液能有效抑制幽門螺旋桿菌的生長(zhǎng)，生成半徑約為4 mm 的抑菌圈，陽(yáng)性對(duì)照為配置而成的10 mg/mL 甲硝唑溶液，陰性對(duì)照為無(wú)菌ddH2O。

3.3 高脫乙酰度殼寡糖B 對(duì)于幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

分別選擇殼寡糖A（50 mg/mL），殼寡糖B（50 mg/mL）以及甲硝唑（10 mg/mL）作為研究對(duì)象，與幽門螺旋桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照組（control）為不添加殼寡糖的幽門螺旋桿菌，初始菌濃度與試驗(yàn)組相同，所有組別保證溶液的初始菌濃度為107CFU/mL，以空白培養(yǎng)基溶液為吸光度值調(diào)零，以菌體吸光度OD625為考察指標(biāo)，討論不同殼寡糖溶液對(duì)于幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)曲線的影響。

根據(jù)圖3 的生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組的菌體正常生長(zhǎng)，10～20 h 為菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20 h 后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。而試驗(yàn)組（COS B+HP）中由于加入質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的殼寡糖，使得菌體的生長(zhǎng)受到抑制作用，導(dǎo)致試驗(yàn)組所積累的菌體生物量遠(yuǎn)低于對(duì)照組（菌體的吸光度值下降），試驗(yàn)組（COS A+HP）中的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組的生長(zhǎng)基本一致，生長(zhǎng)趨勢(shì)和生物量無(wú)明顯區(qū)別，加入甲硝唑的組別菌體生長(zhǎng)受到明顯抑制，生物量積累明顯低于所有其它試驗(yàn)組和對(duì)照組，另外通過(guò)t 檢驗(yàn)顯示所有試驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果有顯著差異（P＜0.05）。

圖3 不同物料對(duì)幽門螺旋桿菌的生長(zhǎng)曲線的影響Fig.3 Effect on the HP's growth curve with different experiment group

4 結(jié)論

近年來(lái)，學(xué)者們對(duì)于殼寡糖及其相關(guān)產(chǎn)物的體外抑制幽門螺旋桿菌的作用有了初步的研究成果[16]。謝勇等[17]在研究中提出殼聚糖、羧甲基殼聚糖對(duì)幽門螺旋桿菌具有抑制作用；薛海波等[18]提出通過(guò)內(nèi)切酶制備工藝對(duì)產(chǎn)物抗幽作用的影響；李溫靜[19]在研究中提到特殊的殼寡糖具備一定的體外抗幽門螺旋桿菌作用。陳建國(guó)等[20]提到內(nèi)切酶、外切酶以及混合酶的制備工藝對(duì)于產(chǎn)物是否具有抗幽作用有重要影響。

在本次研究中選擇自主制備的甲殼質(zhì)衍生物中代表性產(chǎn)物、殼聚糖、殼寡糖以及羧甲基殼聚糖為研究對(duì)象，研究不同種物料對(duì)于幽門螺旋桿菌的最小抑菌濃度（MIC），一般來(lái)說(shuō)，打孔法適用于溶解性好的樣品；但殼聚糖的水溶性較差，所以本研究中采用不同濃度的醋酸溶液溶解殼聚糖進(jìn)行研究，而羧甲基殼聚糖及殼寡糖的水溶性較好，可以直接選用無(wú)菌ddH2O 進(jìn)行溶解。采用不同濃度的殼聚糖和羧甲基殼聚糖進(jìn)行試驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)其具備體外抑制幽門螺旋桿菌的作用，可能于不同取代位置與分子質(zhì)量區(qū)間有關(guān)；而殼寡糖組試驗(yàn)結(jié)論顯示，廈門藍(lán)灣科技有限公司自主生產(chǎn)的高脫乙酰度殼寡糖經(jīng)過(guò)驗(yàn)證在質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)能夠?qū)τ拈T螺旋桿菌產(chǎn)生較強(qiáng)的體外抑菌作用，抑菌圈半徑為（4.1±0.23）mm，質(zhì)量濃度為10 mg/mL 陽(yáng)性對(duì)照（甲硝唑）的條件下，所形成的抑菌環(huán)半徑為（5.5±0.15）mm，試驗(yàn)中采用的低脫乙酰度的殼寡糖未產(chǎn)生抑菌圈，同時(shí)從共培養(yǎng)結(jié)果來(lái)看，高脫乙酰度的殼寡糖B（50 mg/mL）可以明顯抑制幽門螺旋桿菌的生物量積累，反之殼寡糖A（50 mg/mL）則不具備相應(yīng)的抑制作用；分析原因可能是由于高脫乙酰度的殼寡糖擁有較高的生物利用度，水溶性更好，能夠更好的與細(xì)胞膜上的受體蛋白錨定并特異性結(jié)合，當(dāng)與細(xì)胞體內(nèi)帶有陰離子的細(xì)胞質(zhì)發(fā)生物理聚合作用，進(jìn)而擾亂細(xì)胞正常的生理活動(dòng)，抑制幽門螺旋桿菌的正常代謝，進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)。

綜上，在本研究中由廈門藍(lán)灣科技有限公司生產(chǎn)的高脫乙酰度的殼寡糖具備一定的體外抑制幽門螺旋桿菌作用，未來(lái)可以進(jìn)一步完善在抗幽試驗(yàn)的深入研究。