降N-亞硝胺乳酸菌的篩選及其降解特性研究

郭 進(jìn)，曉 燕，劉培清，劉宗益，蘇 琳，趙麗華，靳 燁*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特 010018 2 呼和浩特市抽樣監(jiān)測與重大活動保障中心 呼和浩特 010018 3 烏蘭察布市市場監(jiān)督管理局 內(nèi)蒙古烏蘭察布 013750 4 烏拉特中旗農(nóng)牧和科技局 內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015300）

N-亞硝胺（NAs）通常是由胺類物質(zhì)的亞硝化反應(yīng)生成[1]，其分子式為R1NNOR2，根據(jù)分子質(zhì)量和蒸汽壓大小可分為揮發(fā)性亞硝胺和非揮發(fā)性亞硝胺[2]，其中揮發(fā)性亞硝胺廣泛存在于食品中，尤其是加工肉制品，是四大食品污染物之一[3]。大多數(shù)亞硝胺具有致癌、致畸、致突變性和很強(qiáng)的基因毒性，與多種器官癌癥的發(fā)生相關(guān)，尤其是食管、肝臟和腎臟的癌癥，并可通過胎盤傳遞給下一代而受到人們的高度關(guān)注[4-5]。

食品污染是一個嚴(yán)重影響食品安全和人類健康的問題。乳酸菌作為益生菌不僅能夠提高食品的品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值，還可在人體中發(fā)揮重要生理功能，且近年來益生菌可控制食品中有害物質(zhì)產(chǎn)生的重要功能已受到廣泛關(guān)注[5]。有研究表明乳酸菌可通過吸附或降解途徑直接減少食品加工過程中產(chǎn)生的生物胺[6]、亞硝胺[7]、苯并芘[8]和真菌毒素[9]等污染物。目前，降亞硝胺的乳酸菌主要通過抑制NAs 形成和清除已生成的NAs 降低NAs 的含量。李秀明[10]研究發(fā)現(xiàn)菌體碎片具有抑制NDMA 形成的作用。Kim 等發(fā)現(xiàn)乳酸菌可直接降低MRS 培養(yǎng)基中NDMA 的含量。Nowak 等[12]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對NDMA 的抑制能力受環(huán)境因素和菌株的影響，且培養(yǎng)上清液、膜提取物和胞內(nèi)提取物均能不同程度地降低NDMA 含量。然而，肖亞慶[13]研究發(fā)現(xiàn)菌株降解NAs 的有效成分為細(xì)胞壁上的假定蛋白。

為弄清降亞硝胺乳酸菌的特性，本研究以危害性最強(qiáng)的NDMA 和NDEA 作為篩選菌株的依據(jù)，采用HPLC 篩選具有高效降亞硝胺能力的乳酸菌，研究NAs 脅迫對菌株生長量的影響以及不同環(huán)境因素對菌株降亞硝胺能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16 株乳酸菌，分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵制品（酸奶、腌菜、風(fēng)干肉），內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品科學(xué)與技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；EPA 8270/Appendix IX亞硝胺標(biāo)品（純度≥99%，產(chǎn)品編號：502138），Sigma-Aldrich 公司。

Centrifuge 5810R 型高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱、1260 安捷倫高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；SCIENTZ-950E 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；SYNERGY H1 酶標(biāo)儀，雷康恒泰北京商貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)與篩選 乳酸菌的活化：將實(shí)驗(yàn)室中甘油保藏的乳酸菌接種至MRS 培養(yǎng)基，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量于28 ℃/37 ℃條件下經(jīng)2次連續(xù)傳代培養(yǎng)。降亞硝胺能力的測定：參照肖亞慶[13]的方法略作修改。將16 株活化好的乳酸菌按2%接種量分別接入MRS 培養(yǎng)基中，添加質(zhì)量濃度為20 μg/mL 的NAs 標(biāo)品，使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，放置于28 ℃/37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，對照組中不接菌并同等條件下培養(yǎng)。參照方法GB 5009.26-2016 《食品中N-亞硝胺類化合物的測定》提取培養(yǎng)基中的NAs，測定其含量，篩選可高效降低NAs 含量的菌株。

式中：S0——對照組上清液亞硝胺含量；St——試驗(yàn)組上清液亞硝胺含量。

1.2.2 亞硝胺含量的測定 采用HPLC 測定NAs的含量。檢測參考肖付剛等[14]的方法，采用ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，二元梯度洗脫，水相流動相A 為乙腈，有機(jī)流動相B 為純水，流速1 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫為25 ℃，于240 nm 處紫外檢測器進(jìn)行測定。具體梯度洗脫程序如表1 所示。所有樣品檢測前均經(jīng)過0.45 μm 膜過濾。利用HPLC 進(jìn)行檢測，NDMA 與NDEA 的保留時(shí)間分別為3.15 和4.34 min，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=41.858x-1.8024（R2=0.9986）和y=24.861x+0.6011（R2=0.9993）（y為峰面積，x 為亞硝胺濃度）。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 The gradient elution program

1.2.3 菌株在正常培養(yǎng)和NAs 脅迫下的生長曲線 將菌株以2%的接種量分別接種于普通MRS和NAs 濃度為1 μg/mL 的MRS 培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)時(shí)間0，2，4，6，8，12，16，20 和24 h 取樣，測定菌液OD600nm值，繪制生長曲線。

1.2.4 不同環(huán)境因素對菌株降亞硝胺能力的影響

1.2.4.1 時(shí)間對乳酸菌降亞硝胺能力的影響 參考1.2.1 節(jié)的方法，將活化后的乳酸菌與亞硝胺于MRS 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，通過HPLC 依次測定培養(yǎng)時(shí)間為0，12，24，36，48，72，96，120 和144 h 的NAs 含量，研究時(shí)間對菌株降亞硝胺能力的影響。

1.2.4.2 初始pH 值對菌株降亞硝胺能力的影響

參考1.2.1 節(jié)的方法，NAs 質(zhì)量濃度為1 μg/mL的MRS 培養(yǎng)基在初始pH 值為3.5，4.5，5.5，6.5 和7.5 條件下，對照組中不接菌并同等條件下培養(yǎng)，通過HPLC 測定不同初始pH 值條件下NAs 的含量，計(jì)算菌株對NAs 的清除率。

1.2.4.3 培養(yǎng)溫度對菌株降亞硝胺能力的影響參考1.2.1 節(jié)的方法，在共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)溫度為20，28，37 和45 ℃條件下，對照組中不接菌并同等條件下培養(yǎng)，通過HPLC 測定不同培養(yǎng)溫度條件下NAs 的含量，計(jì)算菌株對NAs 的清除率。

1.2.4.4 接種濃度對菌株降亞硝胺能力的影響參考1.2.1 節(jié)的方法，在乳酸菌接種濃度為106，107，108，109和1010CFU/mL 條件下，對照組中不接菌并同等條件下培養(yǎng)，通過HPLC 測定不同接種濃度條件下NAs 的含量，計(jì)算菌株對亞硝胺的去除率。

1.2.5 不同細(xì)胞組分對菌株降亞硝胺能力的影響 參考Nowak 等[12]的方法略作修改，研究胞內(nèi)提取物、胞外代謝物和細(xì)胞壁對NAs 的清除作用。將第3 代菌液在4 ℃，12 000 g 條件下離心15 min 得菌株胞外提取液與菌體沉淀。然后加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）懸浮清洗菌體沉淀3 次，再經(jīng)超聲破碎（300 W，工作2 s，間歇3 s，180 次，0 ℃）后再次離心（12 000 g，15 min，4 ℃）后收集上清得胞內(nèi)提取液。將菌體沉淀重懸于PBS 中，并通過100 ℃高溫加熱處理10 min 致死后可得到細(xì)胞壁。分別添加NAs 至上述胞內(nèi)提取液、胞外代謝物和細(xì)胞壁中，使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，以終質(zhì)量濃度為1 μg/mL 亞硝胺的PBS 緩沖液及MRS 培養(yǎng)基作為對照，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0，0.5，3，6，12，24 和36 h 取樣，經(jīng)HPLC 測定NAs 含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測定3 次，用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，利用Orgin2018 軟件繪制圖表，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 降亞硝胺乳酸菌的篩選

將分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵制品的16 株乳酸菌于MRS 培養(yǎng)基中與NAs 共培養(yǎng)，利用HPLC 檢測亞硝胺的含量。結(jié)果如表2 所示，不同菌株的降亞硝胺能力具有特異性，與肖亞慶[13]和Kim 等[11]研究結(jié)果一致。由表可知，植物乳桿菌AL6-1 對培養(yǎng)基中NDMA 的去除率為27.95%，顯著高于其它菌株（P＜0.05），而植物乳桿菌ML2-2、植物乳桿菌37X-6 和戊糖片球菌 37X-8 對NDMA 有不同程度的促進(jìn)作用，清除率分別為-1.49%，-7.11%和-5.11%，此現(xiàn)象與李木子[15]研究結(jié)果一致，原因是亞硝胺具有揮發(fā)性，在培養(yǎng)過程中NAs含量發(fā)生不同程度變化。16 株乳酸菌對NDEA 的清除率范圍為-9.77%～25.23%，其中植物乳桿菌37X-6 對培養(yǎng)基中NDEA 的去除率顯著高于其它菌株（P＜0.05），為25.23%，而植物乳桿菌AL6-1、CL4-3、X3-2B、37X-11 和瑞士乳桿菌SL-1 與植物乳桿菌37X-6 的降亞硝胺能力無顯著差異（P＞0.05），分別為20.32%，19.14%，17.17%，19.96%和25.09%。植物乳桿菌 AL6-1 對2 種NAs 的降低率之和為48.27%，因此選取具有較高降亞硝胺能力的植物乳桿菌AL6-1 用于后續(xù)研究。

表2 不同菌株的降亞硝胺能力Table 2 Decreasing effect of different strains on concentrations of NAs

2.2 植物乳桿菌AL6-1 在正常培養(yǎng)和NAs 脅迫下的生長曲線

由圖1 可知，在MRS 培養(yǎng)基中植物乳桿菌AL6-1 在接種后4 h 后迅速進(jìn)入對數(shù)生長期，20 h 進(jìn)入穩(wěn)定期，最大生物量為OD600nm=1.75；在亞硝胺終質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的MRS 培養(yǎng)基中，植物乳桿菌AL6-1 的生物量低于正常條件，且20 h 內(nèi)未明顯進(jìn)入穩(wěn)定期，最大生物量為OD600nm=1.72。由此可知，亞硝胺在一定程度上可抑制植物乳桿菌AL6-1 的生長，可能由于亞硝胺具有毒性[13]，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而延長乳酸菌的遲滯期并降低對數(shù)期的生長速率。

圖1 植物乳桿菌AL6-1 在正常條件和亞硝胺脅迫下的生長曲線Fig.1 Growth curves of L.plantarum AL6-1 in normal conditions and under the stress of NAs

2.3 不同環(huán)境因素對植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響 Nowak 等[12]認(rèn)為乳酸菌降低NDMA能力取決于菌株的生長期。由圖2 可知，植物乳桿菌AL6-1 對NDMA 和NDEA 清除率變化趨勢相同，在0～36 h，亞硝胺清除率隨著時(shí)間延長呈現(xiàn)增長趨勢，在清除時(shí)間為36 h 時(shí)，NDMA 和NDEA清除率已經(jīng)趨于穩(wěn)定，此時(shí)清除率分別為63.90%和61.65%，與48，72，96，120 和144 h 無顯著差異（P＞0.05）。推測原因可能是乳酸菌在含亞硝胺的培養(yǎng)體系中緩慢進(jìn)入對數(shù)生長期，在36 h 到達(dá)穩(wěn)定期，使其降解率達(dá)到最大值且趨于穩(wěn)定，在此過程中隨著乳酸菌數(shù)量增多導(dǎo)致亞硝胺含量急劇下降。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對植物乳桿菌AL6-1 降NAs 能力的影響Fig.2 Effect of incubation time on degradation of NAs by L.plantarum AL6-1

2.3.2 初始pH 值對植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響 pH 值對菌株的降解和吸附作用具有重要影響，其可以通過改變微生物的生長繁殖及酶活性影響降解能力，并在吸附過程中可對離子交換過程以及細(xì)胞壁上官能團(tuán)的電離狀態(tài)產(chǎn)生一定影響[16]。由圖3 可知，在pH 3.5～7.5 時(shí)，植物乳桿菌AL6-1 對NDMA 和NDEA 均具有降NAs能力且變化趨勢相同，呈先上升后下降趨勢；當(dāng)pH 4.5 時(shí)，亞硝胺清除率顯著高于其它組（P＜0.05），為37.63%，；隨著pH 值的升高，亞硝胺清除率在pH 6.5 時(shí)基本趨于穩(wěn)定，此時(shí)清除率為26.51%，與pH 7.5 時(shí)無顯著性差異（P＞0.05）。因此，可確定pH 4.5 為植物乳桿菌AL6-1 降低NAs含量的最適pH 值。孫學(xué)穎等[17]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品在發(fā)酵階段pH 值可降到最低，pH 值為4.69，同時(shí)亞硝胺含量達(dá)到最低值，推測在pH 值較低條件下乳酸菌對亞硝胺起到降解作用，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。

圖3 初始pH 值對植物乳桿菌AL6-1 降NAs 能力的影響Fig.3 Effect of pH value on degradation of NAs by L.plantarum AL6-1

2.3.3 培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響 溫度對植物乳桿菌AL6-1 降NAs能力的影響如圖4 所示，在培養(yǎng)溫度為20～45 ℃時(shí)，植物乳桿菌AL6-1 對NDMA 和NDEA 均具有降NAs 能力且變化趨勢相同，呈先上升后下降趨勢。當(dāng)溫度在20～37 ℃范圍內(nèi)時(shí)，NAs 清除率隨著溫度的升高而增長；當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，NDMA和NDEA 清除率分別為35.00%和28.81%，顯著高于其它溫度（P＜0.05），可確定37 ℃為植物乳桿菌AL6-1 降低NAs 的最適培養(yǎng)溫度；當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，NAs 清除率顯著降低（P＜0.05）。原因可能是培養(yǎng)溫度通過影響細(xì)胞膜流動性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜脂肪酸和蛋白質(zhì)的組成及含量以及酶活性來影響乳酸菌的生長和代謝，進(jìn)而影響菌株的降NAs 能力[18]。

圖4 培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌AL6-1 降NAs 能力的影響Fig.4 Effect of incubation temperature on degradation of NAs by L.plantarum AL6-1

2.3.4 接種濃度對植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響 接種濃度對植物乳桿菌AL6-1 降NAs 能力的影響如圖5 所示。隨著接種濃度的增加，植物乳桿菌AL6-1 對NDMA 的清除率逐步增加，當(dāng)接種濃度為1010CFU/mL 時(shí)，NDMA 清除率顯著高于其它組（P＜0.05），為26.58%。而植物乳桿菌AL6-1 對NDEA 的清除率在接種濃度為106～108CFU/mL 范圍內(nèi)無顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)接種濃度高于108CFU/mL 時(shí)，NDEA 的清除率隨著接種濃度的增加而增大，當(dāng)接種達(dá)到1010CFU/mL，NDEA 含量顯著降低（P＜0.05），其清除率為19.67%。結(jié)果顯示，在一定接種濃度范圍內(nèi)，植物乳桿菌AL-6-1 的降NAs 能力與接種濃度之間呈正相關(guān)關(guān)系，與肖亞慶[13]的研究結(jié)果一致，因此確定接種濃度1010CFU/mL 為植物乳桿菌AL-6-1的最適接種濃度。

圖5 接種濃度對植物乳桿菌AL6-1 降NAs 能力的影響Fig.5 Effect of inoculation concentration on degradation of NAs by L.plantarum AL6-1

2.4 不同細(xì)胞組分對植物乳桿菌AL6-1 降亞硝胺能力的影響

植物乳桿菌AL6-1 不同細(xì)胞組分對NAs 的降解作用如表3 所示，胞內(nèi)提取物對NDMA 和NDEA 含量的變化趨勢相同，在0～6 h 范圍內(nèi)亞硝胺含量隨著時(shí)間增加而逐漸降低；在6 h 時(shí)，NDMA 和NDEA 含量已經(jīng)趨于穩(wěn)定，其含量分別為0.68 μg/mL 和0.71 μg/mL，此時(shí)降解率分別為70.28%與71.88%，顯著低于0，0.5，3 h 時(shí)亞硝胺的含量（P＜0.05），而與12，24，36 h 無顯著差異（P＞0.05），研究結(jié)果表明植物乳桿菌AL6-1 胞內(nèi)酶對亞硝胺具有降解作用。肖亞慶[13]研究發(fā)現(xiàn)戊糖乳桿菌R3 胞內(nèi)提取液對NAs 具有一定降解作用，但降解能力不顯著（P＞0.05）。Nowak 等[12]發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)提取液可降低NAs 含量，并且菌株可以將NDMA作為氮源利用。Grill 等[19]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌BB536 的胞內(nèi)提取物具有降低亞硝胺含量的能力，且熱變性后未觀察到亞硝胺含量變化，結(jié)果表明胞內(nèi)提取液中的酶反應(yīng)參與了亞硝胺的降解過程，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。由以上分析可知植物乳桿菌AL6-1 胞內(nèi)提取液的降解作用可能是其清除NAs 的主要途徑。

表3 胞內(nèi)提取液對NAs 的降解作用Table 3 Degrading effect of different cell components on concentrations of NAs

植物乳桿菌AL6-1 胞外代謝物對NAs 清除效果在36 h 內(nèi)無顯著差異。NAs 與胞外代謝物共培養(yǎng)36 h 后，NDMA 和NDEA 含量分別為0.97 μg/mL 和0.90 μg/mL，表明植物乳桿菌AL6-1 通過代謝作用所產(chǎn)生的胞外代謝物不能降解亞硝胺。

滅活后的植物乳桿菌AL6-1 細(xì)胞壁與NAs共培養(yǎng)36 h，在0 h，培養(yǎng)體系中NDMA 含量顯著低于胞內(nèi)提取物與胞外代謝物（P＜0.05），為0.93 μg/mL，對NDEA 含量無顯著影響（P＞0.05）；在0～36 h，培養(yǎng)體系中NDMA 和NDEA 含量范圍分別為0.91～0.93 μg/mL 和0.93～0.96 μg/mL，無顯著差異（P＞0.05），表明植物乳桿菌AL6-1 細(xì)胞壁可在短時(shí)間內(nèi)吸附NDMA，吸附率為4.12%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用HPLC 篩選具有高效降亞硝胺能力的菌株，并揭示其降解特性及機(jī)理。研究結(jié)果表明植物乳桿菌AL6-1 具有高效降亞硝胺能力，在亞硝胺終質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的共培養(yǎng)體系中NDMA 和NDEA 的降解率分別為27.95%和18.32%；且植物乳桿菌AL6-1 降解能力受不同環(huán)境因素的影響，確定其最佳培養(yǎng)時(shí)間為36 h，最適pH 值為4.5，最適溫度為37 ℃，最佳接種濃度為1010CFU/mL；通過研究植物乳桿菌AL6-1 胞內(nèi)酶提取液、胞外代謝物及細(xì)胞壁對NAs 含量的影響，發(fā)現(xiàn)清除NAs 主要是通過胞內(nèi)提取液的降解作用，在6 h 時(shí)，NDMA 和NDEA 降解率分別為70.28%與71.88%，且細(xì)胞壁對NAs 有一定的吸附作用。本研究為該菌株能進(jìn)一步應(yīng)用于食品中降低亞硝胺含量提供重要參考依據(jù)。